Author Produced

Дифференцирование линий стволовых клеток мыши Предимплантационная эмбрионов

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Эта статья описывает протокол эффективно получать и культуры линии плюрипотентных стволовых клеток эмбрионов мыши на стадии бластоцисты.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Дифференцирование мыши эмбриональных стволовых клеток (mESC) это процесс, посредством которого плюрипотентных клеточных линий созданы с предимплантационной эмбрионов. Эти линии сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать при определенных условиях. Благодаря этим свойствам mESC являются полезным инструментом в регенеративной медицины, болезни моделирования и инженерные исследования тканей. Эта статья описывает простой протокол для получения mESC линии с высоким дифференцирование эффективности (60-80%), культивирование бластоцисты от штаммов разрешительной мыши на фидер клетки в определенной среде, дополнена лейкемия ингибирующего фактора. Протокол также может применяться эффективно получить mESC линии от не разрешительной мыши штаммов, путем простого добавления коктейль из двух малых молекул ингибиторов дифференцирование средний (2i средний). Предоставляются подробные процедуры по подготовке и культуры клеток фидер, сбор и культуры зародышей мыши, и дифференцирование и культуры mESC линий. Этот протокол не требует специализированного оборудования и может осуществляться в любой лаборатории с опытом культуры основных клеток млекопитающих.

Introduction

Эмбриональные стволовые клетки (ESC) являются плюрипотентных клеток, полученных от Предимплантационная эмбрионов, которые сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать под конкретные условия1. На основе этих свойств, ESC стали полезным инструментом для регенеративной медицины, болезни моделирования и ткани, инженерных исследований2.

ESC в первый раз были получены эмбрионы Предимплантационная мыши, возникая мыши ESC (mESC) линии с низкой успех3,4. Лет дифференцирование эффективность оставалась низкой из-за сложности поддержания плюрипотентности в пробирке. Кроме того присутствие фидер клетки5, который улучшить эффективность дифференцирование, поощрение вложения колонии и повышения стабильности karyotypic6, несколько модификаций протокола приведет к улучшению обслуживания плюрипотентности. Наиболее важными являются добавлением лейкемия ингибирующего фактора (LIF) для mESC культуры среднего7,8, использование эмбрионов с разрешительной фон 129S29 и культуры mESC с средой, дополнена определены сыворотка, свободной от потенциальных факторов дифференциации10. Совсем недавно убедительных доказательств показал, что добавление коктейль из двух мелкомолекулярных модуляторы сигнальных путей на носитель культуры mESC (известный как 2i) является лучшим для поддержания плюрипотентности. 2i коктейль состоит из комбинации MEK ингибитором PD0325901, который уменьшает дифференциация сигналов путем ингибирования Митоген активированный протеин киназы (MAPK) путь, и GSK3β ингибитором CHIR99021, который повышает выживаемость клеток в низкой плотности Активировав путь Wnt11.

В настоящей статье мы опишем простой протокол эффективно получить mESC линии от мыши бластоцисты. Мы следуем стандартной процедуры, культивирование эмбрионов от разрешительной штаммов на фидер клетки в среде дифференцирование, дополненная LIF и замена сыворотке12. После этого протокола, mESC линии могут быть получены с КПД, эквивалентные тем, которые получили в среде 2i. Несмотря на это чтобы избежать возможных проблем с поддержания плюрипотентности или при работе с не разрешительной штаммы могут добавляться 2i.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

использование животных, описанных в приведенных ниже разделах утвержден Комитетом этики на животных и человека исследования Барселоны Universitat близлежащем автономном и кафедра d ' Pesca сельского хозяйства, Ramaderia, я Alimentació Женералитата Каталонии (протокол #8741).

1. инактивации клетки фидера и хранения

Примечание: фибробластов человека крайней плоти (HFF-1) были ранее заморожены в 1 мл замораживания раствора, состоящего из 90% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 10% этанного сульфоксида ( ДМСО) и сохраняющихся в жидком азоте до использования.

  1. Оттепель криогенных флакон HFF-1 (1 мл), погружая флакона в ванну воды 37 ° C.
  2. Добавить Размороженный содержимое криогенных флакона подогретым Дульбекко ' s Modified Eagle ' s среднего (DMEM) с 10% FBS сделать 1:10 разрежения.
  3. Семя разреженных клетки (10 мл) в колбе T75 и культуры их при 37 ° C и 5% CO 2.
  4. Следующий день, измените средство для ликвидации остатков ДМСО. Удалите носитель и добавляют 10 мл подогретым DMEM дополнена 10% FBS.
  5. Культура HFFs и изменить носитель каждые 48 ч до тех пор, пока культура достигает стадии вырожденная. Это может занять примерно 7-10 дней.
  6. Подготовить решение инактивации, разбавить митомицин C в DMEM дополнена 10% FBS в конечной концентрации 10 мкг/мл. Инкубировать клетки с инактивации решение для 3 ч при 37 ° C и 5% CO 2.
  7. Удаление инактивации решения и промойте клетки трижды с 2 мл из Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) для ликвидации остатков митомицин C.
  8. Для отсоединения инактивированных клетки, добавить 1 мл раствора подогретым трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO 2.
  9. Наблюдать клетки под инвертированным микроскопом для обеспечения они отдельностоящий (цель 10 x с 0,3 числовая апертура или NA). Если они не являются, Инкубируйте их еще пару минут при 37 ° C и 5% CO 2. Проверьте клетки снова под инвертированным микроскопом.
  10. Пипетка решение с пипетка Пастера для того, чтобы разбить ячейки сгустки.
  11. Нейтрализовать ферментативные решение путем добавления 4 мл DMEM, дополненная 10% FBS и Ресуспензируйте.
  12. Взять Алиготе суспензию клеток и сделать разведение 1: 100 в HBSS. Чтобы определить количество клеток, загрузить 10 мкл разрежения в Нойбауэр ' s камеры. Подсчет количества ячеек, расположенных в одном из больших площадей камеры под инвертированным микроскопом (20 x цель с 0,45 NA).
    1. Повторить подсчета в общей сложности четыре больших площадей. Рассчитать общее количество клеток (N) как N = среднее количество клеток подсчитанных x общий объем x 4 разбавления x 10.
  13. Центрифуга остальная часть образца для 5 минут при 200 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с замораживания раствора в концентрации 10 6 клеток / мл.
  14. Алиготе подвеска в криогенных флаконов с 10 6 клеток (1 мл) каждый. Криогенных флаконов в замораживания контейнер и заморозить в -80 ° C.
  15. Следующий день, хранить криогенных флаконов в жидком азоте.

2. Культура клетки фидера

  1. одного до четырех дней перед началом процесса вывода, таяние криогенные флакон, содержащий 1 x 10-6 инактивированная HFF-1 клетки в водяной бане при 37 ° с.
  2. Сделать разведение 1:6 талой HFF-1 в предварительно разогретую DMEM, дополненная 10% FBS и держать температуру 37 ° C.
  3. Заполните каждый хорошо 4-ну плиты с 500 мкл подогретым 0,2% желатина из свиной кожи и сохранить пластины при 37 ° C на 10 мин
  4. Удалить 500 мкл желатина из скважин и 500 мкл HFFs разрежения. Осторожно покачайте пластину для обеспечения равномерного распределения HFFs в нижней части скважины. Избегайте круговыми движениями, в противном случае клетки будут сосредоточены в центре скважины.
  5. Инкубировать пластину по крайней мере 24 часа при 37 ° C и 5% CO 2 для получения монослоя инактивированных HFFs в каждой скважине.
  6. Следующий день, соблюдать клетки под инвертированным микроскопом (10 X цель с 0,3 NA) и проверьте, что они придают и равномерно распределены. Измените средство для ликвидации остатков ДМСО. Удалите носитель и 500 мкл подогретым DMEM дополнена 10% FBS.

3. Сбор эмбриона и культура

  1. , четыре дня до коллекции эмбриона, управлять 5 МЕ беременных Маре ' гонадотропина сыворотки s внутрибрюшинной инъекции до 6-12 неделя старый самок мышей.
    Примечание: Мы использовали женщины от 129S2 или B6CFAF1 штаммов, хотя женщины из других штаммов мыши могут быть использованы. Тем не менее, когда работает с женщинами от не разрешительной штаммов (например ЦБА), среднего должна быть дополнена 2i как указано в шаге 4.2.
  2. После 48 ч, управлять 5 ед хорионического гонадотропина человека внутрибрюшинной инъекции и мат женщин с мужчинами, по крайней мере 8 недель, в соотношении 1:1. Отдельные женщины от мужчины следующий день.
  3. За день до коллекции эмбриона, подготовить 35-мм клеточной культуры Петри с несколькими каплями 40 мкл KSOMaag среды с 4 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) и заполнить пластину с минеральным маслом для полного покрытия капли. Инкубировать блюдо на 37 ° C и 5% CO 2 чтобы сбалансировать среднего.
  4. Подготовить эмбриона манипуляции пипетки, тепло тоньше частью Лонг накренилась стеклянная пипетка Пастера, с помощью горелки Бунзена. После того, как мягкие, снять с огня и тянуть друг от друга два конца. Разбейте его на желаемую длину. Внутренний диаметр кончика должно быть 100-150 мкм.
  5. Усыпить самок мышей от шейки матки дислокации 45-48 h пост coitum (p.c.).
  6. Вскрыть мышей подвергать брюшной полости путем разрезания кожи с гладкой изогнутые ножницами и брюшины прямо острыми ножницами. Захватить один из матки с щипцами, отрезать маточных труб, прямо острыми ножницами и поместить его в буфер Hepes CZB среднего (HCZB) 13 37 ° C. повторить этот процесс, чтобы удалить другие маточных труб.
  7. Флеш, яйцеводов с 1 мл шприц загружен с HCZB удерживается на месте часовщик щипцы для сбора 2-клеток эмбрионов.
    Примечание: Подготовить промывки взять иголку подкожных иглой 30 G, разрезать конец и основанием для тупых отзыв на абразивный камень.
  8. С помощью аппарата рот пипеткой, забрать эмбрионы, мыть их в HCZB и культуры их в ранее подготовленных эмбриона культуры блюдо на 37 ° C и 5% CO 2 до стадии бластоцисты. До 50 эмбрионы могут быть культивировали в каждой капле 40 мкл. Мониторинг развития эмбриона каждые 24 ч под стереомикроскопом.
    Примечание: в качестве альтернативы, эмбрионы могут быть собраны на стадии бластоцисты сократить в пробирке эмбрион культуры. В этом случае усыпить самок в день p.c. 3.5-4.5, вскрыть матки. и смыть с HCZB.

4. Дифференцирование стволовых клеток

  1. Подготовка вывода пластин
    1. в день посева эмбриона, подготовить среднего дифференцирование, дополняя среде DMEM с 100 мкм 2-β меркаптоэтанол, 1 x Non-Essential аминокислоты , 20% сыворотки замены, и 10 3 ед/мл LIF.
    2. По желанию, добавить 1 мкм MEK ингибитора PD0325901 и 3 мкм ингибитора GSK3 CHIR99021 для получения среднего 2i.
    3. Взять 4-ну тарелку с монослоя инактивированных HFFs (шаг 2.6) от инкубатор. Удаление среды и 800 мкл подогретым дифференцирование среднего для каждой скважины. Возвращение пластину в инкубатор.
  2. Вителлинового удаления и эмбриона посев
    1. подготовить 35 мм клеточной культуры Петри с тремя 30 мкл капель кислой Tyrode ' s решение 14 и капель три 30 мкл дифференцирование среды. Обложка капли с минеральным маслом и держать блюдо на 37 ° C.
    2. Взять эмбриона культуры блюдо из инкубатора. Один за другим, передачи бластоцисты от капель культуры к кислой Tyrode ' s решение падение с помощью пипетки манипуляции эмбриона. Если возможно, выберите только расширенный бластоцисты, чтобы начать процесс вывода.
    3. Монитор вителлинового пищеварение под стереомикроскопом. Как только исчезает zona pellucida, передачи бластоциста падение средних дифференцирование для того, чтобы промыть кислой Tyrode ' раствор ф.
    4. Взять 4-ну дифференцирование пластина из инкубатора и семян одна зона свободной бластоциста на фидер клеток в каждой скважине.
    5. Возвращение пластину 4-ну дифференцирование инкубатора и культуры при 37 ° C и 5% CO 2.
  3. Мониторинга роста стволовых клеток и среднего изменения
    1. мониторинга культур каждые 24 ч под инвертированным микроскопом (20 X цель с 0,45 NA). Важно отметить, есть ли признаки дифференцировки стволовых клеток, таких как опухшие рефракционной клетки окружающих нарост или даже нажимать фидер клетки сторону.
    2. Каждый день, измените среднего культуры. Взять 4-ну пластина из инкубатора, удалить носитель из каждой скважины и 800 мкл подогретым дифференцирование среднего дополнена LIF и 2i, если используется. Сохранение культуры, пока наросты наблюдаются (6-8 дней).

5. Клеточная культура и техническое обслуживание

  1. подготовить Колле как ручки и стволовых клеток манипуляции пипетки. Следуйте шаг 3.4 подготовить стволовых клеток манипуляции пипетки с внутренним диаметром на кончике 250-300 мкм. Используйте другой частью вытащил пипетка Пастера подготовить ручку Колле как. Тепло и формировать его до получения крючок.
  2. Взять пластину 4-ну культуры из инкубатора и найдите нарост под стереомикроскопом. Используйте ручку, чтобы оттолкнуть дифференцированных клеток и питатели, которые окружают нарост.
    Примечание: Чтобы избежать возможной дифференциации нарост, важно удалить все дифференцированных клеток от края нарост.
  3. Аспирационная нарост с пипеткой манипуляции стволовых клеток и поместить его в новое блюдо в капле трипсина ЭДТА 50 мкл.
  4. Использовать скальпель вырезать нарост в нескольких частях для того, чтобы разбить его как механически, так и ферментативно.
  5. Сразу, перевести фрагменты нарост на свежие капли среднего деривации для нейтрализации действий трипсина.
  6. Передачи фрагментов нарост новая 4-ну табличка с монослоя кормушки. Передача до 10 фрагментов на колодец и культуры их с дифференцирование среднего при 37 ° C и 5% CO 2.
  7. Сохранения стволовых клеток подобных культур для по крайней мере за шесть недель до рассмотрения mESC линии, установленной. Изменить носитель каждые день и субкультуры их один раз в неделю.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После этого протокола более 95% нарост формирования должно быть достигнуто после первой недели культуры (рис. 1A). Создание линий mESC после шести переправах переменная среди экспериментальных реплицирует, с средний успех 60-80%. Добавление 2i не значительно улучшить результаты при работе с разрешительной мыши штаммов, как те, с 129S2 фоном, но это необходимо при работе с не разрешительной штаммов.

ESC мыши колоний должен представлять регулярные морфология с плоскую форму и определенными краями когда выращиваются без лечения (рис. 1B-C) или культивируемых с 2i (рис. 1 d). Колонии, представляя периферийных дифференциация знаки должны быть отброшены (Рисунок 1E-F). Если дифференцирование эффективности получил меньше, чем ожидаемые значения, контролировать рост колоний mESC и субкультуры их часто, чтобы избежать разрастания, поскольку это может привести к гибели клеток и будет способствовать дифференциации (Рисунок 1 g-H).

Figure 1
Рисунок 1 : Представитель изображений mESC колоний в культуре. (A) нарост, производный от бластоцисты, после первой недели культуры (B, C) несколько mESC колоний на проход 10 представления определенных краев и плоскую форму. (D) колонии от линии mESC лечат 2i. (E, F) Примеры полу дифференцированных mESC колоний, представляя периферийных дифференциация знаки (выделены пунктирной эллипсами). (G, H) Примеры заросший mESC колоний, представляя плохая морфология и дифференциации знаки. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы проверить stemness предполагаемого mESC линии, полученные после шести недель культуры, следует оценивать наличие плюрипотентности и дифференциации маркеров. MESC линии должны быть позитивными для плюрипотентности маркеры как Oct4 и Sox2 ( A-BРисунок 2 ). Кроме того, после индукции спонтанное дифференцировки путем культивирования клеток на 10 дней без клетки фидера в DMEM дополнена 10% FBS, mESC линии, как ожидается, будет положительным для эктодермы маркер β-тубулина класса III (Tuj1) (рис. 2 c), Мезодерма маркер α-гладких мышц актина (αSMA) (Рисунок 2D) и энтодермы маркер Альфа-фетопротеин (АФП) (рис. 2е). Только линии позитивные пять маркеров оценку следует считать истинной mESC линии и таким образом использоваться для расчета эффективности дифференцирование. Обычно это соответствует практически во всех mESC линии, созданные с помощью настоящего Протокола.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель иммунофлюоресценции против плюрипотентности и дифференциации маркеры. mESC колонии, выражая Oct4 (A) (зеленый) (B) и Sox2 (красный). Дифференцировать mESC колоний, выражая (C) Tuj1 (зеленый), (D) αSMA (зеленый) и (E) AFP (зеленый). Во всех изображениях ядерный материал является counterstained с Hoeschst (синий). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя mESC линии наследования является известным процедура обычно используется во многих лабораториях, его эффективность не всегда как высокими, как ожидалось, из-за многочисленных факторов, которые могут нарушить плюрипотентности обслуживания. В настоящей статье мы покажем, шаг за шагом, как установить mESC линии с высокой эффективностью, используя простой и надежный протокол. Эти эффективность аналогичны сообщениям в литературе.

Для обеспечения максимальной эффективности, важно контролировать клетки ежедневно или каждый день, со времени точки указано лишь иллюстративный характер. Важно, чтобы избежать избыточный рост колоний, так как это способствует гибели клеток и дифференциации. Также важно снизить максимально воздействия колоний трипсина ЭДТА в ходе их субкультуры, потому что это может также уменьшить жизнеспособность клеток.

Другим решающим фактором является источником подачи клеток и их культуры. Несколько исследований показали, что HFF, мыши эмбриональных фибробластов (MEF) и мышь STO фибробластов одинаково способны поддержать вывод ESC и культуры15. Однако HFF, до два раза более прочным, чем MEF и сто в культуры16, оставляя больше времени для mESC расти. Таким образом использование HFF позволяет избежать дополнительных mESC субкультуры.

Если дифференцирование эффективности получил меньше, чем сообщили результаты, важно тщательно проверить все компоненты дифференцирование среднего, особенно сыворотки замены. Различные пакеты сыворотки замена может привести к существенные различия в выводе эффективность17,18. Таким образом каждый новый пакет должен быть испытан до его использования.

Важно отметить, что генетический фон эмбрионов, используемый как источник для формирования mESC может также существенно влиять на эффективность дифференцирование. Действительно мыши штаммы были классифицированы в разрешительной штаммов (например 129S2 и C57BL6) и не разрешительной штаммов согласно их способности приносить mESC линии под стандартные условия9,19(таких как ЦБА, КИВНУЛ и FVB). Протокол сообщили здесь может успешно применяться к эмбрионов с обоих типов штаммов до тех пор, как коктейль 2i входит в средство вывода при работе с эмбрионами из не разрешительной штаммов. 2i среднего способен модулировать сигнализации шаблон mESC линий для поддержания плюрипотентности, независимо от того, генетический фон6. Основным ограничением является то, что, из-за сильного сигналов шаблон, приобретенные во время культура20, mESC линии культивировали в 2i, становятся устойчивыми к дифференциации. Чтобы преодолеть это ограничение, mESC линии следует культивированный без 2i для по крайней мере один проход до индукции дифференцировки ослабить сигнализации приобрел.

В целом эта работа может облегчить практику mESC наследование, показывая шаги как просто как возможно и указывая на основные трудности и пути их преодоления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Jonatan Лукас за его техническую помощь с подачи клеточной культуры, UAB-де-ла Estabulari обслуживание для ухода за животными и Мартин Domènec для записи видео. Эта работа была поддержана Ministerio де Economia y развитию AGL2014-52408-R и де Женералитата Каталонии 2014 SGR-524. MVC является бенефициаром PIF-ЗАО стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes - Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes - Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16, (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72, (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9, (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94, (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82, (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25, (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3, (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58, (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38, (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7, (2), 177-191 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics