Author Produced

Afledning af stamcellelinjer fra mus præimplantations embryoner

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I denne artikel beskrives en protokol til effektivt at udlede og kultur pluripotente stamceller linier fra mus embryoner på blastocyststadiet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Musen embryonale stamceller (mESC) afledning er den proces, ved hvilken pluripotente cellelinjer er etableret fra præimplantations embryoner. Disse linjer bevarer evnen til at enten selv forny eller differentiere på særlige betingelser. På grund af disse egenskaber er mESC et nyttigt redskab i regenerativ medicin, sygdom modellering og væv ingeniørstudier. I denne artikel beskrives en simpel protokol for at opnå mESC linjer med høj afledning effektivitetsfordele (60-80%) ved dyrkning af blastocyster for eftergivende mus stammer på feeder celler i definerede medium suppleret med leukæmi hæmmende faktor. Protokollen kan også anvendes effektivt afleder mESC linjer fra ikke-eftergivende mus stammer, at af den simpel addition af en cocktail af to små-molekyle hæmmere til afledning medium (2i medium). Der findes detaljerede procedurer for udarbejdelsen og kultur af feeder celler, samling og kultur af musen embryoner, og afledning og kultur af mESC linjer. Denne protokol kræver ikke specialiseret udstyr og kan udføres på et laboratorium med grundlæggende pattedyr celle kultur ekspertise.

Introduction

Embryonale stamceller (ESC) er pluripotente celler fra præimplantations embryoner, som bevarer evnen til at enten selv forny eller differentiere under særlige betingelser1. Baseret på disse egenskaber, ESC er blevet et nyttigt redskab for regenerativ medicin, sygdom modellering og tissue engineering studier2.

ESC blev fremstillet for første gang præimplantations mus embryoner, oprindelse mus ESC (mESC) linjer med lav succes3,4. For år forblev afledning effektivitet lav på grund af vanskeligheden ved at bevare pluripotency in vitro. Udover tilstedeværelse af feeder celler5, som forbedrer afledning effektivitet, fremme koloni vedhæftet fil, og forbedrer karyotypic stabilitet6, flere ændringer af protokollen fører til en forbedring af pluripotency vedligeholdelse. Det vigtigste var tilføjelsen af leukæmi hæmmende faktor (LIF) til mESC næringssubstratet7,8, brug af embryoner fra 129S2 eftergivende baggrund9 og kulturen i mESC med medium suppleret med defineret serum, fri for potentielle differentiering faktorer10. Mere nylig, overbevisende beviser har vist, at tilføjelsen af en cocktail af to små-molekyle modulatorer af signaling veje til mESC næringssubstratet (kendt som 2i) er bedst at opretholde pluripotency. 2i cocktail består af en kombination af MEK hæmmer PD0325901, hvilket reducerer differentiering signaler ved at hæmme mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) vej, og GSK3β hæmmer CHIR99021, som øger celle overlevelse ved lav massefylde ved at aktivere Wnt vej11.

I denne artikel beskriver vi en simpel protokol til at effektivt udlede mESC linjer fra mus blastocyster. Vi følger standardprocedurer, dyrkning af embryoner fra eftergivende stammer på feeder celler i afledning medium suppleret med LIF og en serum udskiftning12. Efter denne protokol, mESC linjer kan afledes med effektivitetsgevinster svarende til dem, der opnås i 2i medium. På trods af dette, kan 2i tilføjes for at undgå mulige problemer med pluripotency vedligeholdelse eller når du arbejder med ikke-eftergivende stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

brugen af de dyr, der er beskrevet i afsnittene nedenfor er blevet godkendt af den etiske komité om dyrs og menneskers forskning Universitat Autònoma de Barcelona og Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jeg Alimentació af Generalitat de Catalunya (protokol #8741).

1. feeder celle inaktivering og opbevaring

Bemærk: menneskelige forhuden fibroblaster (HFF-1) var tidligere frosset i 1 mL af indefrysning løsning bestående af 90% føtal bovin Serum (FBS) og 10% dimethyl sulfoxid ( DMSO) og opbevares i flydende nitrogen indtil brug.

  1. Tø en kryogene hætteglas af HFF-1 (1 mL) ved at nedsænke hætteglas i et 37 ° C vandbad.
  2. Tilføje optøede indholdet af kryogene hætteglasset til pre varmede Dulbecco ' s ændret Eagle ' s Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS at lave en 1:10 fortynding.
  3. Frø de fortyndede celler (10 mL) i en T75 kolben og kultur dem ved 37 ° C og 5% CO 2.
  4. Den næste dag, ændre medium at fjerne DMSO resterne. Fjern mediet og tilsæt 10 mL af pre varmede DMEM suppleret med 10% FBS.
  5. Kultur HFFs og ændre medium hver 48 h, indtil kulturen når sammenflydende scenen. Dette kan tage ca 7 til 10 dage.
  6. Til at forberede inaktivering løsning, fortyndes mitomycin C i DMEM suppleret med 10% FBS i en endelig koncentration på 10 µg/mL. Inkuber celler med inaktivering løsning i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
  7. Fjerne inaktivering løsning og skyl celler tre gange med 2 mL af Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) til at fjerne mitomycin C resterne.
  8. For at frigøre de inaktiverede celler, tilsættes 1 mL pre varmede Trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes i 5 min. ved 37 ° C og 5% CO 2.
  9. Overholde celler under en inverteret mikroskop til at sikre de fritliggende (10 x mål med 0,3 numerisk blænde eller NA). Hvis ikke der Inkuber dem for et par flere minutter ved 37 ° C og 5% CO 2. Kontrollere cellerne igen under den inverterede mikroskop.
  10. Afpipetteres løsningen med Pasteur pipette for at adskille celle klumper.
  11. Neutraliserer den enzymatiske løsning ved at tilføje 4 mL af DMEM suppleret med 10% FBS og resuspend.
  12. Tage en alikvot af cellesuspension og gøre en 1: 100 fortynding i HBSS. For at bestemme antallet af celler, indlæse 10 µL af fortynding i en Neubauer ' s kammer. Tælle de celler, der er beliggende i et af de store pladser i salen under en inverteret mikroskop (20 x mål med en 0,45 NA).
    1. Repeat tæller i alt fire store firkanter. Beregn det samlede antal celler (N) som N = gennemsnitligt antal celler optalte x samlede volumen x fortynding x 10 4.
  13. Centrifugeres resten af prøven i 5 min på 200 x g. udsmid supernatanten og resuspenderes med frysning løsning ved en koncentration på 10 6 celler pr. mL.
  14. Alikvot suspension i kryogene hætteglas med 10 6 celler (1 mL) hver. Læg de kryogene hætteglas i en indefrysning beholder og fryse på-80 ° C.
  15. Den næste dag, Opbevar kryogene hætteglassene i flydende kvælstof.

2. Feeder cellekultur

  1. en til fire dage før du starter afledning processen, tø en kryogene hætteglas indeholdende 1 x 10 6 inaktiveret HFF-1 celler i et vandbad ved 37 ° C.
  2. Gøre en 1:6 fortynding af de optøede HFF-1 i pre varmede DMEM suppleret med 10% FBS og holde temperaturen ved 37 ° C.
  3. Fyld hver brønd med en 4-godt plade med 500 µL af pre varmede 0,2% gelatine fra svin huden og holde pladen ved 37 ° C i 10 min.
  4. Fjerne den 500 µL af gelatine fra brøndene og tilsættes 500 µL af HFFs fortynding. Forsigtigt rock plade for at sikre en ensartet fordeling af HFFs på bunden af brøndene. Undgå cirkulære bevægelser, ellers cellerne vil koncentrere sig i midten af brønden.
  5. Ruger plade mindst 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2 at få en éncellelag af inaktiverede HFFs i hver brønd.
  6. Den næste dag, observere celler under en inverteret mikroskop (10 X mål med 0,3 NA) og kontrollere, at de er vedlagt og ensartet fordelt. Ændre medium for at eliminere DMSO resterne. Fjern mediet og tilsæt 500 µL af pre varmede DMEM suppleret med 10% FBS.

3. Indsamlingsstedet og kultur

  1. , fire dage før indsamlingsstedet, administrere 5 IU af gravide mare ' s serum gonadotropin ved intraperitoneal injektion til 6-12 uge gammel hunmus.
    Bemærk: Vi har brugt hunner fra 129S2 eller B6CFAF1 stammer, men hunnerne fra andre mus stammer kan også bruges. Ikke desto mindre, når arbejder med kvinder fra ikke-eftergivende stammer (fx CBA), medium bør suppleres med 2i som nævnt i trin 4.2.
  2. Efter 48 h, administrere 5 IU af humant choriongonadotropin ved intraperitoneal injektion, og parre hunner med hanner, mindst 8 uger gamle, i forholdet 1:1. Adskille hunnerne fra hannerne den morgendag.
  3. Dagen før indsamlingsstedet, forberede en 35-mm cellekultur petriskål med flere 40 µL dråber KSOMaag medium suppleret med 4 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) og fyld pladen med mineralsk olie skal fuldt ud dække dråberne. Inkuber parabol på 37 ° C og 5% CO 2 til Reagensglasset mellemlang.
  4. At forberede embryo manipulation pipetter, opvarmes den tyndere del af en lang spids glas Pasteur pipette ved hjælp af en bunsenbrænder. Når bløde, trække det tilbage fra flammen og trække de to ender fra hinanden. Bryde det til den ønskede længde. Den indre diameter på spidsen skal være 100-150 µm.
  5. Aflive de hunmus af cervikal dislokation 45-48 h post-coitum (p.c.).
  6. Dissekere mus for at udsætte bughulen ved at skære huden med buede glat skarpe saks og bughinde med lige skarpe saks. Grab en livmoder med pincet, afbrød oviduct ved hjælp af lige skarpe saks og placere den i Hepes-buffered CZB medium (HCZB) 13 på 37 ° C. Gentag processen til at fjerne de andre oviduct.
  7. Flush æggelederne med en 1 mL sprøjte fyldt med HCZB holdes på plads af urmager pincet til at indsamle 2-celle embryoner.
    Bemærk: For at forberede den rødmen nål tage en 30 G kanyle, skåret i slutningen, og jorden til en stump spids på en slibende sten.
  8. Med munden pipette apparatur, afhente embryoner, vaske dem i HCZB og kultur dem i tidligere forberedt embryo kultur parabol på 37 ° C og 5% CO 2 indtil blastocyststadiet. Op til 50 embryoner kan være kulturperler i hver 40 µL dråbe. Overvåge embryo udvikling hver 24 h under et stereomikroskop.
    Bemærk: Alternativt embryoner kan afhentes på blastocyststadiet at forkorte in vitro- embryo kultur. I dette tilfælde euthanize hunnerne på dag, 3,5-4,5 p.c., dissekere livmoderen. og skyl det med HCZB.

4. Stem Cell afledning

  1. forberedelse af afledning plader
    1. på dagen for embryo såning, forberede afledning medium ved at supplere DMEM medium med 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 x ikke-essentielle aminosyrer , 20% af serum udskiftning og 10 3 U/mL LIF.
    2. Hvis det ønskes, også tilføje 1 µM af MEK hæmmer PD0325901 og 3 µM af GSK3 hæmmer CHIR99021 til at opnå et 2i medium.
    3. Tager 4-godt plade med éncellelag af inaktiverede HFFs (trin 2.6) fra den inkubator. Fjern mediet og tilsæt 800 µL af pre varmede afledning medium til hver brønd. Returnere pladen til rugemaskine.
  2. Zona pellucida fjernelse og embryo såning
    1. forberede en 35 mm cellekultur petriskål med tre 30 µL dråber af sure Tyrode ' s løsning 14 og tre 30 µL dråber af afledning medium. Dække dråber med mineralsk olie og holde skålen på 37 ° C.
    2. Tage embryo kultur parabol fra rugemaskinen. Én efter én, overføre blastocyster fra kultur dråber til et surt Tyrode ' s løsning drop ved hjælp af et embryo manipulation pipette. Hvis det er muligt, Vælg kun de udvidede blastocyster at starte afledning processen.
    3. Skærm zona pellucida fordøjelsen under stereomikroskopet. Så snart zona pellucida forsvinder, overføre blastocyst til en afledning mellemstore slip for at vaske ud den sure Tyrode ' s løsning.
    4. Tager 4-godt afledning plade fra rugemaskinen, og frø en zona-fri blastocyst på feeder celler i hver brønd.
    5. Vende tilbage 4-godt afledning pladen til rugemaskine og kultur på 37 ° C og 5% CO 2.
  3. Overvågning stamceller vækst og medium ændre
    1. overvåge kulturer hver 24 h under en inverteret mikroskop (20 X mål med 0,45 NA). Det er vigtigt at bemærke, om der er tegn på stamcelle differentiering, såsom hævede refraktive celler omkring udkommet eller selv skubbe feeder celler afsat.
    2. Hver anden dag, ændre medium af kultur. Tage 4-godt plade fra rugemaskinen, fjerne medium fra hver brønd og tilføje 800 µL af pre varmede afledning medium suppleret med LIF og 2i, hvis de anvendes. Opretholde kulturen, indtil udvækster overholdes (6-8 dage).

5. Stem cellekultur og vedligeholdelse

  1. Forbered Kolle-lignende håndtag og stamceller manipulation pipetter. Følg trin 3.4 at forberede stamcelle manipulation pipetter med en indre diameter på spidsen af 250-300 µm. Brug anden del af den trak Pasteur pipette til at forberede Kolle-lignende håndtag. Varme og forme det indtil opnåelse af en krog.
  2. Tager 4-godt kultur pladen ud af rugemaskinen og Find udvækst under et stereomikroskop. Brug håndtaget til at skubbe væk de differentierede celler og foderautomater, der omgiver udvækst.
    Bemærk: For at undgå eventuel differentiering af udkommet, er det vigtigt at fjerne alle de differentierede celler fra kanten af udkommet.
  3. Opsug udvækst med en stamcelle manipulation pipette og placere det i en ny fad i en 50 µL trypsin-EDTA drop.
  4. Bruger en skalpel til at skære udvækst i flere dele for at disaggregate det både mekanisk og enzymatisk.
  5. Med det samme overføre udvækst fragmenter i en frisk dråbe afledning medium til at neutralisere trypsin handling.
  6. Overføre udvækst fragmenter til en ny 4-godt pladen med en éncellelag af foderautomater. Overføre op til 10 fragmenter pr. brønd og kultur dem med afledning medium på 37 ° C og 5% CO 2.
  7. Vedligehold stamcelle-lignende kulturer i mindst seks uger før de overvejer linjen mESC etableret. Ændre medium hver anden dag og subkultur dem en gang om ugen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter denne protokol, over 95% af udvækst dannelse bør opnås efter den første uge af kulturen (figur 1A). Etablering af mESC linjer efter seks passager er variabel blandt eksperimentelle replikater, med en gennemsnitlig succes på 60-80%. Tilsætning af 2i forbedrer ikke resultaterne betydeligt, når du arbejder med eftergivende mus stammer, såsom dem med en 129S2 baggrund, men det er nødvendigt, når du arbejder med ikke-eftergivende stammer.

Musen ESC kolonier bør fremlægge en regelmæssig morfologi med en flad form og definerede kanter når kulturperler uden behandling (figur 1B-C) eller kulturperler med 2i (fig. 1 d). Kolonier præsenterer perifere differentiering tegn skal være kasseret (figur 1E-F). Hvis afledning effektivitetsgevinster opnået er lavere end de forventede værdier, kontrol med forøgelsen af mESC kolonier og subkultur dem mere ofte for at undgå tilgroning, da dette kan forårsage celledød og ville fremme differentiering (figur 1 g-H).

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant billeder af mESC kolonier i kultur. (A) udvækst afledt af en blastocyst efter den første uge af kultur (B, C) flere mESC kolonier på passage 10 præsenterer definerede kanter og en flad form. (D) kolonier fra mESC linjer behandlet med 2i. (E, F) Eksempler på semi-differentieret mESC kolonier præsenterer perifere differentiering tegn (markeret med stiplet ellipser). (G, H) Eksempler på tilgroede mESC kolonier præsenterer en dårlig morfologi og differentiering tegn. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Du kan kontrollere stemness af de formodede mESC linjer fremstillet efter seks uger af kultur, bør tilstedeværelsen af pluripotency og differentiering markører vurderes. MESC linjer bør være positiv for pluripotency markører som Oct4 og Sox2 (figur 2 A-B). Desuden, efter induktion af spontan differentiering af dyrkning af celler i 10 dage uden feeder celler i DMEM suppleret med 10% FBS, mESC linjer forventes at være positiv for ectoderm markør β-tubulin klasse III (Tuj1) (figur 2 c), mesoderm markør α-glat muskel aktin (αSMA) (figur 2D) og endoderm markør alfa-fetoprotein (AFP) (figur 2E). Kun de linjer positive for de fem markører vurderet bør betragtes som sande mESC linjer og dermed bruges til beregning af afledning effektivitet. Normalt, svarer det til næsten alle mESC linjer genereret ved hjælp af denne protokol.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant immunofluorescens mod pluripotency og differentiering markører. mESC kolonier udtryk for (A) Oct4 (grøn) (B) og Sox2 (rød). Differentierede mESC kolonier udtrykker (C) Tuj1 (grøn), (D) αSMA (grøn) og (E) AFP (grøn). I alle billeder er det nukleare materiale counterstained med Hoeschst (blå). Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om mESC linje afledning er en velkendt procedure rutinemæssigt anvendes i mange laboratorier, er dens effektivitet ikke altid så højt som forventet på grund af flere faktorer, der kan forstyrre pluripotency vedligeholdelse. I denne artikel viser vi, trin for trin, hvordan at etablere mESC linjer med høj effektivitet ved hjælp af en enkel og pålidelige protokol. Disse effektivitetsgevinster er lig dem rapporteret i litteraturen.

For at sikre maksimal effektivitet, er det vigtigt at kontrollere cellerne dagligt eller hver anden dag, siden tidspunktet punkter, som angives er kun illustrative. Det er vigtigt at undgå tilgroning af kolonier, da dette fremmer celledød og differentiering. Det er også vigtigt at reducere så meget som muligt af kolonierne eksponering for trypsin-EDTA under deres subkultur, da dette kan også reducere cellernes levedygtighed.

En anden afgørende faktor er kilden til feeder celler og deres kultur. Flere undersøgelser viste, at HFF, mus embryonale fibroblaster (MEF) og mus STO fibroblaster er ligeledes købedygtig opbakning ESC afledning og kultur15. HFF er dog op til to gange mere holdbare end MEF og STO i kultur16, giver mere tid for mESC at vokse. Således undgår brug af HFF ekstra mESC subkulturer.

Hvis afledning effektivitetsgevinster opnået er lavere end de rapporterede resultater, er det vigtigt nøje at kontrollere alle komponenter i afledning medium, især serum udskiftning. Forskellige partier af serum udskiftning kan medføre betydelige forskelle i afledning effektivitetsgevinster17,18. Derfor skal hver ny batch testes før dets anvendelse.

Det er vigtigt at påpege, at den genetiske baggrund for embryoner bruges som en kilde til mESC afledning kan også væsentligt påvirke afledning effektivitet. Faktisk, mus stammer blevet klassificeret til eftergivende stammer (f.eks. 129S2 og C57BL6) og ikke-eftergivende stammer (såsom CBA, Nik og FVB) efter deres evne til at give mESC linjer under standardbetingelser9,19. Protokollen rapporteret her kan med held anvendes til embryoner fra begge typer af stammer så længe 2i cocktail er inkluderet i afledning medium, når du arbejder med embryoner fra ikke-eftergivende stammer. 2i medium er i stand til at modulere signaling mønstret i mESC linjer til at opretholde pluripotency, uanset den genetiske baggrund6. Den største begrænsning er, at på grund af den stærke signalering mønster erhvervet under kultur20, mESC linjer kulturperler i 2i bliver resistente over for differentiering. For at overvinde denne begrænsning, skal være kulturperler mESC linjer uden 2i for mindst én passage før induktion af differentiering til at svække den signalering erhvervet.

Samlet set kan dette arbejde lette praksis af mESC afledning af viser trinene som blot som muligt og peger på de vigtigste problemer og hvordan man kan overvinde dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Jonatan Lucas for sin tekniske bistand med feeder cellekultur, Servei Estabulari de la UAB for pasning af dyr og Domènec Martín til at optage video. Dette arbejde er blevet støttet af Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R og Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC er modtageren af en PIF-UAB fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes - Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes - Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16, (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72, (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9, (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94, (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82, (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25, (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3, (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58, (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38, (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7, (2), 177-191 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics