Author Produced

Härledning av stamcellslinjer från musembryon preimplantatorisk

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I artikeln beskrivs ett protokoll för att effektivt härleda och kultur pluripotenta stamcellslinjer från musembryon på blastocyststadiet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vila-Cejudo, M., Ibañez, E., Santalo, J. Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. (126), e56171, doi:10.3791/56171 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mus embryonala stamceller (mESC) härledning är den process genom vilken pluripotenta cellinjer är etablerade från preimplantatorisk embryon. Dessa rader kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja särskilda villkor. Tack vare dessa egenskaper är mESC ett användbart verktyg i regenerativ medicin, sjukdom modellering och vävnad ingenjörsstudier. I artikeln beskrivs ett enkelt protokoll för att få mESC linjer med hög härledning effektivitet (60-80%) av odlingsskålar blastocyster från tillåtande mus stammar på mataren celler i definierade medium kompletteras med leukemi hämmande faktor. Protokollet kan också användas för att effektivt härleda mESC linjer från icke-tillåtande mus stammar, genom enkla tillägg av en cocktail av två småmolekylär hämmare till härledning medium (2i medium). Detaljerade förfaranden för utarbetning och kultur av mataren celler, insamling och musembryon, och härledning kultur och kultur av mESC linjer finns. Detta protokoll kräver inte specialutrustning och kan utföras i ett laboratorium med grundläggande däggdjursceller kultur expertis.

Introduction

Embryonala stamceller (ESC) är pluripotenta celler från preimplantatorisk embryon, som kvar möjligheten att antingen själv förnya eller skilja under särskilda villkor1. Baserat på dessa egenskaper, ESC har blivit ett användbart verktyg för regenerativ medicin, sjukdom modellering och tissue engineering studier2.

ESC härleddes för första gången från preimplantatorisk musembryon, med ursprung mus ESC (mESC) linjer med låg framgång3,4. För år förblev härledning effektivitet låg på grund av svårigheten att upprätthålla pluripotency in vitro. Förutom förekomsten av mataren celler5, som förbättrar härledning effektivitet, främja kolonin fastsättning och förbättra karyotypic stabilitet6, flera ändringar av protokollet bly till en förbättring av pluripotency underhåll. Den viktigaste var tillägget av leukemi hämmande faktor (LIF) till mESC odlingsmedium7,8, användningen av embryon från 129S2 tillåtande bakgrunden9 och kulturen av mESC med medium kompletteras med definierade serum, fria från potentiella differentiering faktorer10. Mer nyligen, övertygande bevis har visat att tillägg av en cocktail av två småmolekylär modulatorer av signalvägar till odlingsmediet mESC (känd som 2i) är bäst att upprätthålla pluripotency. 2i cocktail består av en kombination av den MEK-hämmaren PD0325901, vilket minskar de differentiering signalerna genom att hämma mitogen-aktiverat protein kinase (MAPK) vägen, och den GSK3β-hämmaren CHIR99021, som förbättrar cellöverlevnad vid låg densitet genom att aktivera Wnt väg11.

I denna artikel skall beskriva vi ett enkelt protokoll för att effektivt härleda mESC linjer från mus blastocyster. Vi följer standardprocedurer, odla embryon från tillåtande stammar på mataren celler i härledning medium kompletteras med LIF och ett serum ersätter12. Efter detta protokoll, mESC linjer kan härledas med effektivitetsvinster som är likvärdiga med dem som erhållits i 2i medium. Trots detta kan 2i läggas för att undvika eventuella problem med pluripotency underhåll eller när du arbetar med icke-tillåtande stammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

användning av de djur som beskrivs i avsnitten nedan har godkänts av den etiska kommittén om djurs och människors forskning av den Universitat Autònoma de Barcelona och Departament d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca jag Alimentació av Generalitat de Catalunya (protokoll #8741).

1. mataren Cell inaktivering och lagring

Obs: mänskliga förhud fibroblaster (HFF-1) var tidigare frysta i 1 mL iskallt lösning bestående av 90% fetalt bovint Serum (FBS) och 10% dimetyl sulfoxid ( DMSO) och lagras i flytande kväve tills användning.

  1. Tina en kryogen injektionsflaska för HFF-1 (1 mL) genom att doppa injektionsflaskan i 37 ° C vattenbad.
  2. Lägga till tinade innehållet i injektionsflaskan med kryogen pre värmde Dulbecco ' s ändrad Eagle ' s Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS att göra en 1:10 utspädning.
  3. Utsäde utspädda cellerna (10 mL) i en T75 kolv och kultur dem vid 37 ° C och 5% CO 2.
  4. Nästa dag, ändra mediet att eliminera DMSO resterna. Ta bort mediet och tillsätt 10 mL av pre värmde DMEM kompletteras med 10% FBS.
  5. Kultur i HFFs och ändra mediet varje 48 h tills kulturen når konfluenta scenen. Detta kan ta ca 7-10 dagar.
  6. Att förbereda inaktivering lösningen, späd mitomycin C i DMEM kompletteras med 10% FBS med en slutlig koncentration på 10 µg/mL. Inkubera cellerna med inaktivering lösningen för 3 h vid 37 ° C och 5% CO 2.
  7. Ta bort inaktivering lösningen och skölj celler tre gånger med 2 mL av Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) att eliminera mitomycin C resterna.
  8. För att lossa de inaktiverade cellerna, tillsätt 1 mL före värmde Trypsin-EDTA-lösning och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C och 5% CO 2.
  9. Observera cellerna under en inverterade Mikroskop för att säkerställa att de är fristående (10 x mål med 0.3 numerisk bländare eller NA). Om de inte är, inkubera dem ett par minuter vid 37 ° C och 5% CO 2. Kontrollera cellerna igen under det inverterade mikroskopet.
  10. Pipettera lösningen med en Pasteur-pipett för att dissociera cell klumpar.
  11. Neutralisera den enzymatiska lösningen genom att tillsätta 4 mL DMEM kompletteras med 10% FBS och resuspendera.
  12. Ta en alikvot av cellsuspensionen och göra en utspädning 1: 100 i HBSS. För att avgöra antalet celler, Ladda 10 µL av utspädning i en Neubauer ' s kammare. Räknar de celler som ligger i en av de stora torgen i kammaren under en inverterade Mikroskop (20 x-objektiv med en 0.45 NA).
    1. Upprepa inventeringen i sammanlagt fyra stora rutor. Beräkna det totala antalet celler (N) n = Genomsnittligt antal celler räknade x totala volym x utspädning x 10 4.
  13. Centrifugera resten av provet för 5 min vid 200 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten med frysning lösning med en koncentration på 10 6 celler per mL.
  14. Alikvot suspensionen i kryogena injektionsflaskor med 10 6 celler (1 mL) varje. Placera kryogen injektionsflaskorna i en frysning behållare och frysa vid -80 ° C.
  15. Nästa dag, lagra kryogen injektionsflaskorna i flytande kväve.

2. Mataren cellkultur

  1. en till fyra dagar innan du börjar härledning, Tina en kryogen injektionsflaska innehållande 1 x 10 6 inaktiverat HFF-1 celler i ett vattenbad vid 37 ° C.
  2. Gör en 1:6 utspädning av tinade HFF-1 i pre värmde DMEM kompletteras med 10% FBS och hålla temperaturen vid 37 ° C.
  3. Fyll varje brunn 4-well platta med 500 µL av pre värmde 0,2% gelatin från svin hud och hålla plattan vid 37 ° C i 10 min.
  4. Ta bort den 500 µL av gelatin från brunnarna och tillsätt 500 µL av HFFs utspädning. Skaka försiktigt på plattan för att säkerställa en jämn fördelning av HFFs på botten av brunnarna. Undvika cirkulära rörelser, annars cellerna kommer att koncentrera sig på mitten av brunnen.
  5. Inkubera plattan minst 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2 att få en enskiktslager av inaktiverat HFFs i varje brunn.
  6. Nästa dag Observera cellerna under en inverterade Mikroskop (10 X-objektiv med 0.3 NA) och kontrollera att de anslutna och homogeneously distribueras. Ändra mediet för att eliminera DMSO resterna. Ta bort mediet och tillsätt 500 µL av pre värmde DMEM kompletteras med 10% FBS.

3. Embryosamlingsgrupper och kultur

  1. fyra dagar före embryosamlingen, administrera 5 IE av gravida mare ' s serum gonadotropin av intraperitoneal injektion till 6-12 vecka gammal honmöss.
    Obs: Vi har använt honor från 129S2 eller B6CFAF1 stammar, även honor från andra musen stammar kan användas. Ändå, när arbetar med kvinnor från icke-tillåtande stammar (e.g. CBA), medium bör kompletteras med 2i som nämns i steg 4.2.
  2. Efter 48 h, administrera 5 IE humant koriongonadotropin av intraperitoneal injektion och para honorna med hanarna, minst 8 veckor gammal, i förhållandet 1:1. Separera honorna från hanarna nästa dag.
  3. Dagen före embryosamlingen, förbereda en 35 mm cellkultur petriskål med flera 40 µL droppar KSOMaag medium kompletteras med 4 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) och fyll tallriken med mineralolja att fullt ut täcka dropparna. Inkubera skålen vid 37 ° C och 5% CO 2 temperera mediet.
  4. Att förbereda embryo manipulation pipetter, värm den tunna delen av en lång spets glas Pasteur-pipett med hjälp av en bunsenbrännare. När mjuka, återkalla det från lågan och dra två ändar isär. Bryta det till önskad längd. Den inre diametern på spetsen bör vara 100-150 µm.
  5. Avliva honmöss av cervikal dislokation 45-48 h post-intravenösa (p.c.).
  6. Dissekera möss för att exponera bukhålan genom att skära huden med böjd slät vass sax och bukhinnan med rak vass sax. Greppa en livmoder med pincett, avskurna i äggledaren som använder rak vass sax och placera den i Hepes-buffrat CZB medium (HCZB) 13 vid 37 ° C. Upprepa processen att ta bort den andra äggledaren.
  7. Flush oviducts med en 1 mL spruta laddad med HCZB hålls på plats av urmakare pincett att samla 2-cells embryona.
    Obs: För att förbereda den rodnad nål ta 30 G injektionsnål, skär i slutet, och marken till en trubbig spets på en slipande sten.
  8. Använder munnen pipett apparaten, plocka upp embryon, tvätta dem i HCZB och kultur dem i tidigare beredda embryo kultur skålen vid 37 ° C och 5% CO 2 tills i blastocyststadiet. Upp till 50 embryon kan vara odlade i varje 40 µL droppe. Övervaka embryots utveckling varje 24 h under ett stereomikroskop.
    Obs: Alternativt embryon kan samlas i blastocyststadiet att förkorta in vitro- embryo kultur. I det här fallet euthanize honorna vid dag 3,5-4,5 p.c., dissekera livmodern. och spola det med HCZB.

4. Stem Cell härledning

  1. beredning av härledning plattorna
    1. dagen i embryo sådd, förbereda härledning mediet genom att komplettera DMEM medium med 100 µM 2-β merkaptoetanol, 1 x icke-essentiella aminosyror , 20% av serum byte och 10 3 U/mL LIF.
    2. Om så önskas, även lägga till 1 µM med MEK-hämmare PD0325901 och 3 µM med GSK3 hämmare CHIR99021 att erhålla en 2i medium.
    3. Ta 4-väl plattan med enskiktslager av inaktiverat HFFs (steg 2,6) från den inkubator. Ta bort mediet och tillsätt 800 µL före värmde härledning medium i varje brunn. Tillbaka plattan till inkubatorn.
  2. Zona pellucida borttagning och embryo sådd
    1. förbereda en 35 mm cellkultur petriskål med tre 30 µL droppar sura Tyrode ' s lösning 14 och tre 30 µL droppar härledning medium. Täcka droppar med mineralolja och hålla skålen vid 37 ° C.
    2. Ta embryo kultur skålen från inkubatorn. En efter en, överföra blastocyster från kultur dropparna till en sura Tyrode ' s lösning droppe med hjälp av ett embryo manipulation pipett. Om möjligt, Välj bara de utökade blastocyster att starta processen härledning.
    3. Övervaka zona pellucida matsmältningen under stereomikroskopet. Så snart zona pellucida försvinner, överföra blastocystan till en härledning medium droppe för att tvätta ut det sura Tyrode ' s lösning.
    4. Ta 4-väl härledning plattan från inkubator och frö en zona-fri blastocysten på mataren celler i varje brunn.
    5. Returnerar 4-väl härledning plattan till STINGs inkubator samt kultur vid 37 ° C och 5% CO 2.
  3. Övervakning stamcellstillväxt och medium ändra
    1. övervaka kulturerna varje 24 h under en inverterade Mikroskop (20 X-objektiv med 0,45 NA). Det är viktigt att notera om det finns tecken på stamcellers differentiering, såsom svullna brytningsfel celler kring utväxten eller ens trycka mataren celler undan.
    2. Varannan dag, ändra medlet av kulturen. Ta 4-väl plattan ur ruvmaskinen, ta bort mediet från varje brunn och tillsätt 800 µL av pre värmde härledning medium kompletteras med LIF och 2i, om används. Bibehålla kulturen tills utväxter observeras (6-8 dagar).

5. Stem cellkultur och underhåll

  1. Förbered Kolle-liknande handtag och stamceller manipulation pipetter. Följ steg 3,4 att förbereda stamceller manipulation pipetter med en inre diameter på spetsen av 250-300 µm. använda den andra delen av den drog Pasteur-pipetten för att förbereda Kolle-liknande handtaget. Värm och forma det tills en krok.
  2. Ta 4-väl kultur plattan ur inkubatorn och leta upp utväxten under ett stereomikroskop. Använd handtaget för att driva bort de differentierade cellerna och de matare som omger utväxten.
    Obs: För att undvika eventuell differentiering av utväxten, det är viktigt att ta bort alla differentierade celler från kanten av utväxten.
  3. Aspirera utväxten med stamceller manipulation pipett och placera den i en ny maträtt i en 50 µL trypsin-EDTA droppe.
  4. Använda en skalpell skära utväxten i flera delar för att dela upp det både mekaniskt och enzymatiskt.
  5. Genast överföra utväxt fragment i en färsk droppe härledning medium att neutralisera trypsin åtgärd.
  6. Överför utväxt fragment till en ny 4-well platta med en enskiktslager av matare. Överför upp till 10 fragment per brunn och kultur dem med härledning mediet vid 37 ° C och 5% CO 2.
  7. Upprätthålla stamceller-liknande kulturer under minst sex veckor innan man överväger raden mESC etablerat. Ändra mediet varannan dag och subkultur dem en gång i veckan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter detta protokoll, över 95% av utväxt bildandet bör uppnås efter den första veckan av kultur (figur 1A). Etablering av mESC linjer efter sex passager är variabel bland experimental replikat, med en genomsnittlig framgång på 60-80%. Tillägg av 2i avsevärt förbättras inte resultaten när du arbetar med tillåtande mus stammar, såsom de med en 129S2 bakgrund, men det är nödvändigt när man arbetar med icke-tillåtande stammar.

Mus ESC kolonierna bör presentera en regelbunden morfologi med en platt form och definierade kanter när odlade utan behandling (figur 1B-C) eller odlade med 2i (figur 1 d). Kolonierna presentera perifera differentiering tecken bör kasseras (figur 1E-F). Om härledningen effektivitetsvinsterna erhålls är lägre än förväntade värden, kontrollera tillväxten av mESC kolonier och subkultur dem mer ofta för att undvika överväxt, eftersom detta kan orsaka celldöd och skulle främja differentiering (figur 1 g-H).

Figure 1
Figur 1 : Representativa bilder av mESC kolonier i kultur. (A) utväxt härrör från blastocyst efter den första veckan av kultur (B, C), flera mESC kolonier på passage 10 presenterar definierade kanter och en platt form. (D) kolonier från mESC linjer behandlas med 2i. (E, F) Exempel på semi differentierade mESC kolonier presentera perifera differentiering tecken (markerade med streckad ellipser). (G, H) Exempel på övervuxna mESC kolonier presenterar en dålig morfologi och differentiering tecken. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kontrollera stemness av förmodad mESC raderna erhålls efter sex veckor av kultur genom bör närvaron av pluripotency och differentiering markörer bedömas. De mESC linjerna bör vara positivt för pluripotens markörer såsom Oct4 och Sox2 (figur 2 A-B). Dessutom efter induktion av spontana differentiering genom att odla cellerna i 10 dagar utan matare celler DMEM kompletteras med 10% FBS, mESC linjer förväntas vara positiva för ektoderm markör β-tubulin klass III (Tuj1) (figur 2 c), det mesoderm markör α-Smooth Muscle aktin (αSMA) (figur 2D) och endoderm markören alfa-fetoprotein (AFP) (figur 2E). Endast raderna som är positiva för de fem markörer bedömas beaktas sant mESC linjer och således används för beräkning av härledning effektivitet. Detta motsvarar vanligtvis, praktiskt taget alla mESC rader genereras med hjälp av detta protokoll.

Figure 2
Figur 2 : Representativa immunofluorescens mot pluripotency och differentiering markörer. mESC kolonier uttrycker (A) Oct4 (grön) (B) och Sox2 (röd). Differentierade mESC kolonier uttrycker (C) Tuj1 (grön), (D) αSMA (grön) och (E) AFP (grön). I alla bilder är kärnmaterialet counterstained med Hoeschst (blå). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om mESC linje härledning är ett välkänt förfarande som rutinmässigt används i många laboratorier, är dess effektivitet inte alltid så höga som förväntat på grund av flera faktorer som kan störa pluripotency underhåll. I denna artikel visar vi, steg för steg, hur du upprättar mESC linjer med hög effektivitet med en enkel och pålitlig-protokollet. Dessa effektivitetsvinster är liknande dem som rapporterats i litteraturen.

För att säkerställa maximal effektivitet, det är viktigt att styra cellerna dagligen eller varannan dag, eftersom tiden punkter som anges är bara illustrativ. Det är viktigt att undvika överväxt av kolonier, eftersom detta främjar celldöd och differentiering. Det är också viktigt att minska så mycket som möjligt av kolonierna exponering för trypsin-EDTA under deras subkultur, eftersom detta kan också minska cellernas viabilitet.

En annan avgörande faktor är källan till mataren celler och deras kultur. Flera studier har visat att HFF, mus embryonala fibroblaster (MEF) och mus STO fibroblaster har lika möjlighet att stödja ESC härledning och kultur15. HFF är dock upp till två gånger mer hållbara än MEF och STO i kultur16, vilket ger mer tid för mESC att växa. Därmed undviker användningen av HFF extra mESC subkulturer.

Om härledningen effektivitetsvinsterna erhålls är lägre än de rapporterade resultaten, är det viktigt att noga kontrollera alla komponenter i härledning medium, särskilt serum ersättare. Olika partier av serum ersättning kan resultera i betydande skillnader i härledning effektivitetsvinster17,18. Varje nytt parti måste därför kontrolleras före dess användning.

Det är viktigt att påpeka att den genetiska bakgrunden av de embryon som används som en källa för mESC härledning kan också påverka härledning effektivitet. Faktiskt, mus stammar har klassificerats till tillåtande stammar (såsom 129S2 och C57BL6) och icke-tillåtande stammar (såsom CBA, nicka och Kandeekane) enligt deras förmåga att ge mESC linjer under standart villkorar9,19. Det protokoll som redovisas här kan framgångsrikt tillämpas på embryon från båda typerna av stammar så länge 2i cocktail ingår i härledning mediet när du arbetar med embryon från icke-tillåtande stammar. 2i mediet är kunna modulerar signalering mönstret av mESC linjer att upprätthålla pluripotens, oavsett den genetiska bakgrund6. Den största begränsningen är att, på grund av stark signalering mönstret förvärvade under kultur20, mESC rader odlade i 2i blir resistenta mot differentiering. För att övervinna denna begränsning, bör mESC linjer vara odlade utan 2i för minst en passage före induktion av differentiering att försvaga den signalering förvärvade.

Sammantaget kan detta arbete underlätta bruket av mESC härledning av visar stegen så enkelt som möjligt och pekar på svårigheterna och hur man kan övervinna dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Jonatan Lucas för hans tekniskt bistånd med feeder cellkultur, Servei Estabulari de la UAB för djurens vård och Domènec Martín för inspelning av video. Detta arbete har stötts av Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R och Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC är mottagare av en PIF-UAB gemenskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL sryringe BD  309628
2-β-mercaptoethanol Life Technologies 31350-010
4-well plate Thermo Scientific Nunc 176740
Acidic Tyrode's solution  Home-made See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. 
BSA Sigma A3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 Molecular Probes - Invitrogen A-21200 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. 
CHIR990212 Axon Medchem  1386 Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. 
CryoTube Thermo Scientific Nunc 3754518
DMSO Sigma 41640
DMEM BioWest L0107
FBS BioWest S1810 Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC
Flushing needle BD  304000 Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone
Gelatin from porcine skin Fluka 48724 Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Molecular Probes - Invitrogen A-11037 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. 
HBSS BioWest L0611
Hepes-buffered CZB  Home-made See composition in Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropin Divasa-Farmavic Veterin-Corion 3000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Human foreskin fibroblasts ATCC ATCCSCRC-1041 For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.
KnockOut Serum Replacement Life Technologies  10828-028 Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.   
KSOMaag Evolve Zenith Biotech ZEKS-050 Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use.
Leukemia Inhibitory Factor Merk Millipore ESG1106
Mice  Charles River/Harlan It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. 
Mineral oil Sigma M8410 Embryo tested. Photosensitive. 
Mitomycin C Serva 2980501 Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. 
Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) Biolegend MMS-435P 1:500 dilution
Mouse monoclonal anti-αSMA Sigma A5228 1:200 dilution
Mouse monoclonal anti-AFP R&D Systems MAB1368 1:50 dilution
Mouse monoclonal anti Oct3/4  Santa cruz Sc-5279 1:50 dilution
Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140-035
PD0325901 Axon Medchem  1408 Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles.
Petri dish (35mm) Thermo Scientific Nunc 153066
Petri dish (60mm) Thermo Scientific Nunc 150288
Pregnant mare's serum gonadotropin Foligon Foligon-1000 UI Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. 
Rabbit policlonal anti-Sox2 Merck Millipore AB5603 1:200 dilution
T75 falcon Thermo Scientific 130190
Trypsin-EDTA 10x BioWest X0930 Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16, (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78, (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72, (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9, (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94, (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82, (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25, (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3, (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58, (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38, (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7, (2), 177-191 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics