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在体内小鼠激光诱导脉络膜新生血管模型的多模态成像与分析

Neuroscience

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Summary

在这里, 我们介绍了纵向的在体内成像在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形态学变化中的作用。

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Ragauskas, S., Kielczewski, E., Vance, J., Kaja, S., Kalesnykas, G. In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model. J. Vis. Exp. (131), e56173, doi:10.3791/56173 (2018).

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Abstract

激光诱导脉络膜新生血管 (CNV) 是模拟年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的湿型的一个良好建立的模型。在本议定书中, 我们的目标是引导读者不只是通过技术考虑产生激光诱导的损害, 以触发新生血管的过程, 而是侧重于强大的信息, 可以获得从多式联运纵向在体内的整个随访期内的成像。

激光诱导的小鼠 CNV 模型是由二极管激光管理产生的。多模态在体内成像技术被用来监测 CNV 的诱导, 进展和回归。首先, 在激光后立即进行光谱域光学相干层析成像 (SD OCT) 来验证赫膜的断裂。随后使用荧光素血管造影 (FA) 进行的活体成像证实了赫膜从脉络膜水平获得的序列图像的成功损伤。CNV 增殖和回归的纵向后续在天 5, 10 和14以后使用了 SD OCT 和 FA 激光执行。提出了从 FA 图像中 CNV leasions 的简单可靠的分级方法。自动分割的测量总视网膜厚度, 结合手动口径应用测量视网膜厚度的 CNV 地点, 允许无偏见的评价存在水肿。最后, 利用 isolectin GS-IB4 染色对脉络膜 flatmounts 进行了 CNV 的组织学验证。染色是值, isolectin 阳性面积计算 ImageJ。

该协议特别适用于需要高通量样的 CNV 病理筛查的治疗研究, 因为它可以快速、多式、可靠地分类 CNV 病理和视网膜水肿。此外, 高分辨率 SD OCT 可以记录其他病理特征, 如视网膜或 intraretinal 液的积累。但是, 此方法不提供从 SD OCT 图像中自动进行 CNV 卷分析的可能性, 必须手动执行。

Introduction

第一次成功的尝试模仿人类 CNV 在啮齿目动物的病理证实了近三年前与氪激光在长埃文斯鼠1。此后, 氪激光被用来打破赫的细胞膜在最流行的鼠标应变, C57BL/6J2,3,4。用 FA 和组织学染色验证了 CNV 诱导的成功率。快速发展的无创成像模式, 如 OCT, 促进了啮齿动物的临床前模型领域的增长。在同一眼的多个时间点, 监测视网膜形态变化的能力大大降低了动物的使用, 提高了实验研究的效率。组织学评价 CNV 病变是相当直接的, 并要求标签的异常血管生长周围的激光管理, 图像采集, 和面积/体积估计使用图像分析软件。相比之下,在体内成像模式引入了对 CNV 病理及其解释的更复杂的分析。

在这里, 我们提出了一个简单的和相对快速的方法来评分的诱导, 进展, 和回归的 CNV 使用 FA, SD OCT, 和自动分割方法的小鼠激光诱导 CNV 模型。

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Protocol

所有的动物都是按照帕特声明, 为使用动物在眼科和视力研究和欧共体指令 86/609/EEC 动物实验, 使用的协议批准和监测的动物实验委员会芬兰。

1. 激光诱导小鼠 CNV 模型5

  1. 从宏观上检查动物的眼睛是否有异常。
  2. 称量鼠标。
  3. 计算和准备适当数量的麻醉剂使用, 根据动物的重量,例如medetomidine (1 毫克/千克), 氯胺酮 (75 毫克/千克) 和蒸馏水 (0.9% NaCl 溶液) 的比例为 1:1. 5:2. 5, 或氯胺酮 (40-75 毫克/千克),嗪 (5 毫克/千克), 蒸馏水 (0.9% 氯化钠溶液) 的比率为 1:2. 5:1;对于20克老鼠, 注入0.1 毫升的混合物。
  4. 注射麻醉腹腔。
  5. 把老鼠放回笼子里, 等到动物被麻醉。确认鼠标没有踏板反射就能正确麻醉。
  6. 确保使用激光安全个人防护设备。
  7. 打开一个狭缝灯和 532 nm 二极管激光器。
  8. 将鼠标从笼子里取出, 放在暖气垫上。
  9. 应用一滴卡进行瞳孔扩张。等待3-5 分钟的全 (3 毫米) 瞳孔扩张。
  10. 将鼠标放在狭缝灯的舞台上。
  11. 将一滴眼科液体凝胶放在片上, 扁平角膜。
  12. 用中心的视神经头定位鼠标的眼睛。
  13. 将激光功率设置为100兆瓦, 持续时间为100毫秒, 光斑尺寸为50µm。
  14. 将激光束聚焦于视网膜色素上皮 (RPE)。
  15. 通过避免视网膜血管理想地在 4, 8, 和12点周围的视神经, 分别做三激光射击入一只眼睛。在所有激光照射后检查眼底, 因为没有视网膜出血。对侧眼作为非激光的控制。
  16. 丢弃片并将鼠标放回加热垫上。
  17. 用一滴 PEG 凝胶滴在两只眼睛上。

2. SD-OCT 6,7

  1. 将鼠标放置到啮齿动物的对齐阶段, 并固定头部。
  2. 将 SD-OCT 系统 (例如, Bioptigen/莱卡 Envisu R2200) 的镜头对准, 以使用 X 和 Y 级控制器对活体进行成像。
  3. 执行 sd oct 扫描以验证赫膜的断裂: 一旦 sd oct 扫描整个眼睛, 在激光站点上手动移动参考线。赫膜的断裂应在激光区域中清晰可见 (请参见图 1)。

3. 荧光素血管造影7,8,9

  1. 取出鼠标与持有人, 并将其放在 FA 系统 (例如, 海德堡 Spectralis HRA2)。
  2. 聚焦在眼睛眼底的激光烧伤区域, 用红外线反射模式与视神经的头部在观察窗口中间。
  3. 注射0.1 毫升的5% 荧光素钠盐为20克鼠皮下或腹腔。
  4. 关注脉络膜水平。
  5. 从脉络膜的焦点水平进行图像。
  6. 重新聚焦在视网膜水平上, 并采取图像。
  7. 等待三十年代, 重复步骤 3.4-3.6。
  8. 将鼠标从支架上取出, 并将其放在加热垫上。
  9. 反向麻醉的2拮抗剂的 medetomidine, 唑 (0.5 毫克/千克, ip), 或等待动物恢复从麻醉。
  10. 在后续的天数5、10和14中, 在麻醉动物中重复体内 SD OCT 和 FA 成像。

4. CNV 分级

  1. 赫在0天激光后立即采取的 OCT 图像和脉络膜 FA 图像的损伤等级如下:
    0-赫的膜未损坏
    1-赫膜的成功损坏
  2. 通过比较一系列视网膜 FA 图像中荧光素信号的动态观察, 发现有渗漏的激光斑点 CNV 的存在, 如下所示:
    0-视网膜的正常出现
    0.5-渗漏的微弱的染色
    1.0-漏的 CNV 区域
    注: 使用 oct 成像, 以进一步确认 CNV 或可疑 FA 中存在的 intraretinal 流体在 OCT 图像将建议 CNV 评分。

5. 视网膜厚度测量

  1. 使用自动分割软件进行视网膜厚度测量。确保视网膜总厚度被认为是从神经纤维层到 rpe (健康测量点) 的所有层的厚度, 或者是连接 rpe (激光站点) 周围的假想线 (也请参见图 7)。

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Representative Results

激光后立即出现气泡或视网膜出血并不总是可见的。因此, SD OCT 对于验证赫膜的损伤尤为重要。图 1显示了激光管理后在不同时间点的 OCT 成像的示例。

Figure 1
图 1: 眼睛眼底的 OCT (VIP 图像) 显示在白色、绿色和红色圆圈中勾勒出的三激光区域.OCT B 扫描图像之前采取的激光 (基线), 立即激光后, 以验证赫的膜断裂 (0 天, 箭头点的损害网站), 和 5, 10 和14天后, 激光管理。从白色 (第一排图像) 中所勾画的区域可以看出, CNV 在以后的 timepoints 中没有发展。在绿色和红色概述的区域开发了 CNV, 在跟随的天5被发现了。然而, 在10和14天 timepoints, 这些 CNV 病变退化。请单击此处查看此图的较大版本.

图2和 3显示了使用 FA 的串行成像, 它证实了赫的细胞膜在0天的所有三个斑点中的 C57BL/6jRj 老鼠的成功损伤。

Figure 2
图 2: 连续 FA 成像每年二十年代 (图像1到 18) 在脉络膜水平后立即激光管理.图像中的白色箭头1指向激光站点, 显示荧光素在以后的 timepoints (图18中为白色箭头)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 连续 FA 成像每年二十年代 (图像1到 18) 在视网膜水平后立即激光管理.CNV 地区, 有荧光素渗漏和评分 1 (漏 CNV) 是指出的白色箭头的图像18。注意在 FA 成像 (图8和11中的白色箭头) 期间, timecourse 的强度, 以及荧光素阳性区的增加。图18中白色轮廓的两个区域被分级为有微弱的 FA 信号 (等级 0.5)。请单击此处查看此图的较大版本.

除了 CNV 病理学的分级外, SD OCT 还可以在病变部位显示更多的信息,例如, 如, 视网膜液的存在, 水肿, 和 CNV 回归。图 4显示了激光诱导的 CNV 在小鼠体内的主要病理特征。

Figure 4
图 4: CNV 病理学的光谱域光学相干断层成像.SD OCT 提供了一个详细的 CNV 病理在视网膜组织, 从这些代表性的图像可以看到疤痕组织, CNV 形成, 和液体的积累。请单击此处查看此图的较大版本.

黄斑水肿是人体内湿型 AMD 的主要病理标志之一。在激光诱导的 CNV 模型中, 可以使用自动分割来评估视网膜厚度。人工测量选定的激光的地点是需要测量视网膜厚度在 CNV。图 5显示了自动分段后生成的报告的示例。

Figure 5
图 5: 视网膜厚度的定量.自动分割法测量视网膜厚度请单击此处查看此图的较大版本.

使用自动分割是一个快速的方法来提供视网膜厚度的概述 (表 1)。图 6A6B分别显示了来自健康视网膜区域和 CNV 病理的视网膜区域自动分割的典型例子。尽管在区分个别视网膜层方面存在微小的不精确性, 但总的来说, 该软件能可靠地识别色素小鼠的视网膜总厚度。

Figure 6
图 6: 视网膜层的自动分割.自动分割健康的视网膜区域 (A) 和包含 CNV 的视网膜区域 (在图像B中为星号)。请单击此处查看此图的较大版本.

为了评估激光地区的视网膜厚度, 每个激光区域都是人工测量的: 视网膜总厚度被认为是所有层的厚度, 从神经纤维层到连接 RPE 周围的假想线损坏 (图 7表 1)。

地区 5天 10天 14天
总视网膜厚度, μ m 218±7。8 220±7。2 221±9。8
激光面积1 200 204 214
激光面积2 226 217 220
激光面积3 222 223 227
数据显示为 mean±SD

表1。总视网膜厚度和视网膜厚度在 CNV 站点在14天的后续, 由自动分割使用 inVivoDiver 软件 (v 3.0.8) 确定。

Figure 7
图 7: 人工测量激光区视网膜厚度与 CNV 病理.黄线表明, 在激光管理的地方, 视网膜的总厚度从神经纤维层到假想的 RPE 层 (黑线)。请单击此处查看此图的较大版本.

组织学上, CNV 病变的确认使用 isolectin GS-IB4 标记 (图 8A)。图像分析软件图像 J 被用来计算 CNV 病变面积 (图 8B)。

Figure 8
图 8: 组织学分析.脉络膜 flatmount CNV 病变的组织学染色 (绿色、 A) 可以使用图像 J (B) 中的阈值进行量化。A的刻度线为50μ m。请单击此处查看此图的较大版本.
 

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Discussion

多模态成像为 CNV 病理评价提供了有价值的工具。在这里, 我们提出了一个成像协议, 包括 FA, SD OCT, 自动分割的快速, 重现性, 可靠的评价 CNV 病理。经激光管理后, 赫膜断裂。此外, 在这个阶段使用 SD OCT 也可以立即可视化可能的 intraretinal 和视网膜出血, 这可能混淆结果的解释。根据 FA 图像的荧光素信号对视网膜渗漏进行分级。使用 SD OCT 提供了更详细的描述 CNV 病理。此外, 纵向 SD OCT 分析在不同的时间点在整个随访期强调的时间差异的病理, 将仍然难以捉摸, 如果依赖于 FA 单独。

用自动分割法测量视网膜总厚度。人工测量 CNV 诱导的视网膜厚度。对脉络膜 flatmount 的组织学评价进行了验证, 用图像分析软件图像 J 对新生血管面积进行了测量。

可视轴的正确透明度对于所提出的协议的成功执行至关重要。角膜干燥和白内障的形成是诊断的主要因素。因此, 一旦鼠标被麻醉, 眼睛应该不断水合与人工泪液或凝胶保持适当的角膜水化。建议的协议应在10分钟内优先进行麻醉诱导。延长麻醉时间可能导致白内障的形成, 并防止在体内成像。

所描述的协议仅限于基于视网膜水平血管渗漏的 CNV 进展的观察分级。可以使用海德堡 Spectralis 软件增加对视网膜渗漏的定量评估, 允许对泄漏区域进行划定, 并提供有关区域的定量数据。此外, 苏莱曼和同事 (2015) 最近提出了一个计算 CNV 体积从在体内获取 OCT 图像使用椭球方法10。椭圆形模型最有可能引入偏倚, 以估计病变体积的 CNV 在大多数情况下有一个不规则的形状。然而, 从 OCT 图像的共焦分析和建议的椭球量化的体积测量之间的高度相关性, 提供了证据证明该方法是定量评估 CNV 卷的重要工具10.

最后, 我们认为, 不同的在体内成像模式的组合, 以及自动分割和组织学分析, 提供了可重复和可靠的评估 CNV 病理学临床前研究。该方法对于概念治疗干预研究的证明尤其有用。

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Disclosures

作者 Symantas Ragauskas, 博士是 Experimentica Ltd. 的一名雇员 (研究科学家) 和股东, 提供合同研究服务, 采用了本文所用的临床前 CNV 模型。

作者 Eva Kielczewski 是一个员工 (研究应用工程师, oct) 的徕卡系统, 生产的 SD oct 在本文中使用。

作者约瑟夫万斯是一个雇员 (NA oct 销售总监) 的徕卡微系统, 生产的 SD oct 体系在本文中使用。约瑟夫. 万斯也是 Spective 的总裁兼董事总经理。

作者西蒙卡洛特尼斯卡娅博士是 Experimentica Ltd. 的顾问首席科学官和股东, 这是一家提供合同研究服务的临床前合同研究机构, incl. 了本文所用的临床前 CNV 模型。西蒙卡洛特尼斯卡娅, 博士也是 & p 科学, LLC, 生命科学咨询公司的首席执行官, 并担任 Dr. 约翰 p 和苔蕾丝 e. 马尔卡希在 Stritch 医学院芝加哥大学的眼科教授。这项安排的条款已根据其利益冲突政策, 由美国芝加哥大学学院审查和批准。

作者 Giedrius Kalesnykas, 博士是 Experimentica Ltd. 的一名雇员 (CEO) 和股东, 提供合同研究服务, 采用本文所用的前 CNV 模型。

Acknowledgments

作者要感谢 Yuliya Naumchuk (芝加哥大学) 和 Agne žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) 的优秀技术和录像支持。Dr. 卡洛特尼斯卡娅的研究项目是由 Dr. 的约翰 P 和苔蕾丝马尔卡希在美国芝加哥大学的眼科教授的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medetomidine (commercial name Domitor) Orion Vnr 01 56 02 Anesthesia
Ketamine Intervet Vnr 51 14 85 Anesthesia
0,9% NaCl B Braun 357 0340 Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet) Bayer vnr 14 89 99 Anesthesia
Tropicamide Santen Vnr 04 12 36 Mydriatic agent
Viscotears Alcon Vnr 44 54 81 Lubricant
Systane Alcon  - Lubricant
5% Fluorescein sodium salt Sigma Aldrich F6377-100G Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan) Orion Vnr 47 19 53 Anesthesia

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References

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