تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

JoVE Journal
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويرد على بروتوكول فحص كفاءة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال في الخلايا الجذعية جليوبلاستوما (جسكس). ويستند المقايسة مراسل تمايز خلايا الجذعية حيث التعبير عن تعزيز التجارة والنقل (اجفب) بدافع المروج توصيني البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56176, doi:10.3791/56176 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والأكثر فتكاً في البالغين، مما تسبب في وفاة 14,000 تقريبا كل سنة في الولايات المتحدة وحدها. متوسط البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص أقل من 15 شهرا مع العلاج الكيميائي الاستئصال، والإشعاع، وتيموزولوميدي الجراحية القصوى. وقد أصبح واضحا بصورة متزايدة التحديات الكامنة في تطوير علاجات أكثر فعالية في الخليج للحاسبات الآلية، وتشمل اختزاع لا ينضب، ومقاومته للعلاجات القياسية، وتعقيد الوراثية والتكيف الجزيئي والفئات السكانية الفرعية من الخليج للحاسبات الآلية الخلايا مع التشابه المظهرية للخلايا الجذعية الطبيعية، يشار هنا إلى جليوبلاستوما الخلايا الجذعية (جسكس). لأن جسكس مطلوبة لنمو الورم والتقدم، يمثل العلاج القائم على التمييز بين طريقة معالجة ناجعة لهذه الأورام المستعصية.

البروتوكول التالية تصف مجموعة من الإجراءات إنشاء إنتاجية عالية فحص منصة تهدف إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال GSC. في جوهر هذا النظام الدبقية فيبريلاري حمضية بروتين (توصيني) تمايز مراسل-بناء. ويتضمن البروتوكول الإجراءات العامة التالية: (1) إنشاء خطوط مراسل التمايز غسك؛ (2) اختبار/التحقق من أهمية المراسل بالنسبة للقدرات الذاتية-تجديد/كلونوجينيك غسك؛ وتدفق عالية القدرة (3)-الخلوي على أساس فحص المخدرات.

منصة الفحص يوفر نهج بسيطة وغير مكلفة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز جسكس. وعلاوة على ذلك، استخدام المكتبات للأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وينطوي على إمكانية للتعرف على العوامل التي يمكن أن تكون أغراض أخرى أكثر سرعة. أيضا، يتوقع العلاجات التي تعزز سرطان الخلية الجذعية التمايز تآزر مع العلاجات "معيار الرعاية" الحالية التي أثبتت لاستهداف والقضاء على الدرجة الأولى أكثر من الخلايا السرطانية المتباينة.

Introduction

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أورام تحتوي على عدد صغير من سكان من الخلايا، وتسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) أو الشروع في ورم الخلايا، التي هي المسؤولة عن تطور الورم وورم خبيث، ومقاومة للعلاج الكيماوي وراديو 1، 2-وجود الخلايا الجذعية السرطانية وعلى نسلها أكثر تمايزاً داخل الأورام يعتبر عاملاً مهما في تعزيز عدم تجانس intratumoral وهكذا يمثل عقبة رئيسية في علاج السرطانات3. والهم التسلسل الهرمي لخلية الورم، قدمتها سرطان الخلية الجذعية من الناحية النظرية، وضع استراتيجيات جديدة لعلاج السرطان 4. نهج واحد لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية هو تحديد وتمنع المسارات مما يشير إلى أن من المعروف أن تكون مطلوبة خلال التطور الجنيني للجهاز المتأثر. في الواقع، نحن وآخرون قد نشرت سابقا أوراق متعددة تصف الاحتياجات الجارية ذات الصلة بالخلايا الجذعية إشارات المسارات العصبية القنفذ سونيك والشق في جليوبلاستوما5،،من67. وقد ساعد هذا العمل في توطيد الأساس المنطقي لعدة تجارب سريرية في الخليج للحاسبات الآلية. ثمة نهج ثان لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية تعزيز هذه التفرقة. هذا النهج قد تلقت الكثير من الدعم بسبب نتائج إيجابية من الدراسات السريرية والاكلينيكية في علاج اللوكيميا الحادة بروميلوسيتيك مع الأحماض الريتينويك (ATRA، بث فيتامين (أ)). هنا وجد ATRA إزالة كتلة النضوج وتعزيز سرطان الخلية التمايز8. في الآونة الأخيرة، بيكسيريلو والزملاء أناقة أظهرت أن BMP-4 يعزز التمايز غسك إلى astrocytes مع GBM مكافحة كبير الأثر في المختبر و في فيفو9.

الأساس المنطقي للدراسة الحالية تستند إلى نهج "عكس هندسة" لاستهداف جسكس. ونظرا لعدم تجانس الواسعة الحالية في الخليج للحاسبات الآلية ومع التمايز الفقيرة كونها واحدة من السمات المميزة للسرطان، سألنا إذا نحن يمكن أن تعزز النمط الظاهري أكثر إيجابية-التفريق في دولة مثل أستروسيتي. هنا، لم يكن لدينا علم مسبق بالممرات مما يشير إلى أن الحفاظ على جسكس في عينة ورم معين ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى تحقيق النمط الظاهري المطلوب (مثلاً توصيني الإيجابية).

ويصف هذا التقرير الإجراءات المستخدمة لإنشاء غسك التمايز مراسل خطوط من توصيل الثقافات إثراء غسك غسك اختيار الاستنساخ. تم إنشاء خطوط نيوروسفيري جليوبلاستوما المستخدمة في مختبر البروفيسور أنجيلو فيسكوفي من المرضى مع تشخيص جليوبلاستوما الأولية في "مستشفى سان رافائيل"-ميلانو، إيطاليا. وقد درست هذه الخطوط على نطاق واسع في عدة منشورات 6،10،،من1112،،من1314. يوصي بشدة أن الأفراد الذين يرغبون في تنفيذ هذه التقنيات في المختبر تحديد أهمية المراسل بالنسبة لسرطان الخلايا الجذعية الذاتي تجديد القدرات في الخلايا أنهم يخططون للدراسة (وهذا صحيح بالنسبة لأي مراسل). بروتوكول مفصل لواحدة من في المختبر كلونوجينيك فحوصات المقبولة في المجال يتم توفيرها لإنجاز هذا15،16. وأخيراً، يرد بروتوكول مفصلة تصف الاستفادة من التمايز المراسل الخطوط في شاشة المخدرات تدفق-الخلوي على أساس في النهاية. من المذكرة، وبالمثل إلى نظام التمايز أستروجليال الموصوفة هنا، لدينا بنجاح المنشأة والتحقق من صحة غسك مراسل خطوط دمج مراسل (تمايز الخلايا العصبية) MAP2:GFP. ولذلك، تصف المنهجيات في هذه الورقة يمكن تطبيقها على دراسة التمايز الخلوي إلى مختلف الخلايا الأنساب.

يمكن العثور على بعض الأرقام الواردة في هذا التقرير في منشور صدر مؤخرا: "اتراكوريوم بزيلات وغيرها من العوامل حظر الأعصاب تشجيع التمايز أستروجليال وتستنزف جليوبلاستوما الخلايا الجذعية البالغة18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم شراء أستروجليال ونظم مراسل lentivirus الخلايا العصبية الاستعدادات لينتيفيرال المعلبة، ومركزة. المعرفة الأساسية للتدفق الخلوي تقنية مطلوب. أيضا، الاستخدام كامل لهذا البروتوكول سوف يحتاج المستخدم الوصول إلى سيتوميتير تدفق مع قدرة إنتاجية عالية (يقبل لوحات 96-جيدا كمصدر العينة).

1-نظام مراسل النسخي لينتيفيرال

ملاحظة: في جميع التحليلات سيتوميتريك التدفق، استخدام الخلايا الأبوية، غير ترانسدوسيد، أو ترانسدوسيد ناقل الخلايا (غير الفلورية) لإنشاء خط الأساس الأسفار. أيضا، علما بأن في كل الخطوات حيث يسمى تريتوريشن الميكانيكية، أن يكون لطيف. تريتوريشن قاسية يمكن قتل عدد كبير من جسكس الهشة والتأثير على نتائج التدفق الخلوي.

  1. بلايت 1 × 106 خلايا في 2 مل من الخلايا الجذعية العصبية كاملة النمو المتوسطة في لوحة 6-مولتيويل.
  2. ترانسدوسي الخلايا عن طريق إضافة lentivirus مراسل في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) تساوي 5.
  3. إضافة 2 ميليلتر من بوليبريني لتركيز نهائي 8 ميكروغرام/مل.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة النمو لإزالة الفيروسات غير منضم. ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 واحتضانها ح 24.
  6. الحصاد 0.5 مل الحجم الإجمالي؛ زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 360 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطي 15 مل وإزالة المادة طافية بالطموح. إضافة 0.5 مل متوسط نمو جديدة من الخلايا الجذعية العصبية إلى الخلايا المتبقية وإعادة اللوحة إلى حاضنة لاستمرار التوسع.
  7. إضافة 200 ميليلتر من كاشف الانفصال واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. فصل الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: قد يؤدي تريتوريشن قاسية قتل كبير من جسكس، وعادة ما يتحقق الانفصال التام بعد 20-30 مرة.
  9. للتقليل من مرفق خلية أو التجميع، إضافة 800 ميليلتر من موازنة الملح الحل (حبس هانك) لوحدة تخزين نهائي 1 مل.
  10. نقل 200 ميليلتر من كل تعليق خلية إلى بئر صفيحة 96-مولتيويل.
  11. لتنفيذ هذا الإجراء، استخدام cytometer تدفق benchtop مع قدرة لوحة 96-جيدا مزودة بليزر أزرق للإثارة ولديها القدرة على الكشف عن بروتين فلوري أخضر. أداء تحليل تدفق سيتوميتريك مع خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10,000 للحصول على كل.
  12. تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا عن طريق التدفق الخلوي.

2-سوبكلون التحديد والتوسع، والتحقق من الصحة

  1. لوحة خلايا في 100 ميليلتر من متوسط الخلايا الجذعية العصبية في كثافة الخلايا 0.7 كل من صفيحة 96-مولتيويل جيدا.
  2. ثقافة استنساخ لمدة 11 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. هذه الخطوة هو درجة عالية من نوع الخلية التابعة وسيتطلب على الأرجح تعديلاً على أساس خط الخلية المستخدمة. كقاعدة عامة، قطر مجال 100 ميكرومتر ≥ مؤشرا جيدا على وجود كلونوجينيك جسكس في نيوروسفيريس.
  3. استخدام مجهر فلوري مزودة بعامل تصفية فيتك، وضع علامة على الآبار التي تحتوي نيوروسفيري واحد حيث ~ 1-5 ٪ الخلايا هي الحاملات للتجارة والنقل.
    ملاحظة: تحديد النسبة المئوية الدقيقة للخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية ليست حاسمة جداً في هذه المرحلة. سيتم تقييم كل من سوبكلونيس في وقت لاحق بالتدفق الخلوي. يتم إجراء هذه الخطوة للحد من المجموع عدد من الحيوانات المستنسخة تحليلها مع التركيز على نيوروسفيريس التي تنشأ قبل متمايز، توصيني سالب، GSC.
  4. قم بتوسيع استنساخ مراسل المحدد حتى هناك عدد كاف من الخلايا لتحليلها بالتدفق الخلوي. بئر الفرعية المتلاقية للوحة 6-مولتيويل التي تحتوي على 1.5x10 ≤5 خلايا/مل ينبغي توفير عدد كاف من الخلايا.
    ملاحظة: إجراء مفصل للعزل والتوسع في جسكس هو متاح 17.

3-تحديد التعبير GFAP:GFP بالتدفق الخلوي

  1. الحصاد قاسمة للخلايا (0.5 مل) من كل استنساخ مراسل والضوابط غير ترانسدوسيد لتحديد النسبة المئوية الدقيقة للخلايا الحاملات للتجارة والنقل. تفكر في الحيوانات المستنسخة مراسل التي تحتوي على خلايا الحاملات للتجارة والنقل ~ 1-5%.
  2. تدور الخلايا في 360 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة طافية بالطموح.
  3. إضافة 200 ميليلتر من الخلية تفكك كاشف كل بيليه، واحتضان هذه الأنابيب في حمام مائي بتعيين إلى 37 درجة مئوية.
  4. تريتوراتي الخلايا بلطف تحقيق تعليق خلية مفردة (عادة ما بين 20 إلى 30 مرة).
  5. للتقليل من مرفق خلية أو التجميع، إضافة 800 ميليلتر حبس إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل.
  6. نقل 200 ميليلتر كل من صفيحة 96-مولتيويل جيدا من كل تعليق خلية.
  7. لتنفيذ هذا الإجراء، استخدام cytometer تدفق benchtop مع قدرة لوحة 96-جيدا. أداء تحليل تدفق سيتوميتريك مع خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10,000 للحصول على كل.

4-الدا الذاتي تجديد المقايسة لتقييم قدرة كلونوجينيك

ملاحظة: لعناصر التحكم، كلا الوالدين، غير ترانسدوسيد، فضلا عن الإعراب عن التجارة والنقل ترانسدوسيد lentivirus، ينبغي استخدام الخلايا لتحديد إمكانات كلونوجينيك النسبية خطوط مراسل التمايز غسك إلى الثقافات غسك الأصلية التي كانت مشتقة.

  1. ننأى سوبكلونيس مراسل التمايز في تعليق خلية واحدة كما هو موضح أعلاه.
  2. لوحة خلايا في لوحات 96-مولتيويل في 100 ميليلتر من وسائط النمو كاملة من الخلايا الجذعية العصبية في الخلية كثافة تتراوح ما بين 5 و 500 الخلايا الواحدة وكذلك.
  3. احتضان خلايا لمدة 9 إلى 11 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  4. نقاط إيجابية الآبار التي تصور مباشرة من نيوروسفيريس تحت مجهر خفيفة. ينبغي النظر في بئر "إيجابيا" إذا كان يحتوي على نيوروسفيري كبير واحد على الأقل.
  5. قم بتوصيل البيانات: عدد الآبار التي تم تحليلها والعدد من الآبار الإيجابية باستخدام واجهة على شبكة الإنترنت الدا المتاحة في http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5-المخدرات مكتبة إضعاف إعداد

  1. إزالة لوحات مكتبة من مخزن في-80 درجة مئوية، وتغطي برقائق الألومنيوم (حماية مركبات حساسة للضوء). ذوبان الجليد لما يقرب من 30 دقيقة إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. استخدام 12-قناة بيبيتور متعدد القنوات لتمييع المركبات المكتبة إلى 0.2 مم في المتوسط كاملة من الخلايا الجذعية العصبية. [دمس] مخفف إلى 10 في المائة في متوسط النمو
    ملاحظة: ينبغي أن يكون تركيز النهائية [دمس] 0.1% عند إضافة إلى الخلايا. قد يؤدي وجود تركيز أعلى من [دمس] في الثقافة سمية. ولهذا السبب، من المستحسن اختبار حساسية إلى [دمس] في خط الخلية المستخدمة، قبل العلاج.
  3. استخدام [دمس] كمراقبة المركبات لعلاج الخلايا الموجودة في الأعمدة اليمنى واليسرى لكل لوحة (الأعمدة 1 و 12؛ آبار A إلى H).
  4. تغطي لوحات مكتبة المخفف مع رقائق الألومنيوم وإرجاع لوحات مكتبة الأصلي للثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

6-المخدرات الشاشة

ملاحظة: يجب استخدام الخلايا المعالجة [دمس] تعيين fluorescence الأساس وضبط النابضة.

  1. لوحة 5 × 103 خلايا في صفيحة 96-مولتيويل في ميليلتر 99 من الخلايا الجذعية العصبية كاملة النمو المتوسطة.
  2. استخدام 12-قناة بيبيتور متعددة القنوات، يعامل الخلايا مع مركبات مكتبة المخفف بتركيز نهائي 2 ميكرومتر (1 ميليلتر من المخدرات 0.2 مم إلى 99 ميليلتر من تعليق خلية) أو مع [دمس] (تحكم). احتضان لوحات ح 72 شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
  3. 12-قناة بيبيتور متعدد القنوات باستخدام إضافة 150 ميليلتر من كاشف تفكك خلية لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. فصل الخلايا من تريتوراتينج برفق مع 12-قناة بيبيتور الأقنية حتى يتحقق تعليق خلية مفردة (عادة ما بين 20 إلى 30 مرة). يختلف مقدار الوقت المطلوب لفصل نيوروسفيريس تماما بين خطوط GSC. بينما الكاشف تفكك خلية الموصى بها (انظر المواد) آمنة والحضانة لمدة تصل إلى 45 دقيقة قد لا يؤثر على استمرارية في عدة أسطر غسك اختبار، التحقق من كل خط المؤسسة العلمية العالمية لاستخدامه في الفرز.
    ملاحظة: وحدة التخزين النهائي في كل كذلك ينبغي أن يكون حوالي 250 ميليلتر (100 ميليلتر من تعليق خلية + 150 ميليلتر من كاشف تفكك الخلية).
  5. تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن مراسل GFAP:GFP من التدفق الخلوي. استخدام استراتيجية النابضة القياسية. أولاً، ينثر الأرض إلى الأمام والجانب للحصول على شعور عام بحجم الخلية وقدرتها على البقاء. قم بوضع بوابة على السكان خلية واحدة قابلة للحياة. هذا هو عدد السكان الذي سيتحدد الفلورية الخضراء (اجفب). مجمع أي أن النتائج زيادة في النسبة المئوية للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا بأكثر من ثلاثة انحرافات معيارية السيطرة على (يعامل [دمس]) يعتبر إيجابيا "ضرب". وينبغي تعديل هذه العتبة وفقا لتطبيق معين والصرامة المطلوبة.
    ملاحظة: لسرعة نقل عالية ينصح الشاشة استخدام سوبكلون مراسل غسك واحد. وبعد تحديد ضرب، يجب التحقق من كل ضرب ضد سوبكلونيس مراسل إضافية من نفس الخط GSC. لزيادة الثقة ليضرب الحقيقي هو يوصي أيضا باختبار المركبات ضد سوبكلونيس مراسل معزولة عن مختلف GSC نيوروسفيريس خطوط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت ترانسدوسيد مع المراسل أستروجليال lentivirus ترميز للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) تنصهر في إطار مع كاسيت مقاومة زيوسين ثلاثة خطوط مستقلة نيوروسفيريس المستمدة من المريض ومدفوعة بواسطة توصيني المروج العنصر البشري ( الشكل 1). استنساخ الفردية التالية تم عزلة بواسطة طلاء الخلايا 0.7 كل بئر في صفيحة جيدا 96 (الشكل 2)، وأعقب ذلك التدفق سيتوميتريك تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن التجارة والنقل (الشكل 3). استنساخ نيوروسفيري، المستمدة من الخلايا المفردة التي تحتوي على دي فايف % بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا يشار إلى GL (توصيني منخفض) بينما يشار إلى هرمون النمو (توصيني عالية) الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء % إيه سيفن فايف الخلايا إيجابية وتعتبر أن تكون أكثر تمايزاً بالمقارنة مع جي ال سوبكلونيس (الشكل 4).

تحديد العوامل والمسارات التي يمكن التحكم بتمايز أستروجليال في جسكس وأجرى على شاشة الصغيرة-جزيء المخدرات استخدام مكتبات "المعاهد الوطنية للصحة السريرية جمع" اثنين. الخلايا وعولج 72 ساعة مع وكلاء مكتبة 727 من المعاهد الوطنية للصحة السريرية جمع الأول والثاني، حددت في تركيز 2 ميكرومتر أو وحدة تخزين متساوية من [دمس] كعنصر تحكم. تم اختبار تأثير هذه العوامل على بقاء الخلية في جميع أعمالنا المستمدة من المريض GBM نيوروسفيري خطوط بتركيزات تتراوح بين 0.2 ميكرون 20 ميكرومتر، قبل فحص المخدرات. تركيز المستخدمة في هذا البروتوكول التي سمحت لنا بالتعرف على المركبات التي كانت قادرة على حمل التمايز أستروجليال، وفي الوقت نفسه، فإنه تصغير التأثيرات السمية المحتملة خارج الهدف بسبب المخدرات تركيزات أعلى.

وبعد الحضانة، عقدنا العزم النسبة المئوية للخلايا معربا عن مراسل توصيني-التجارة والنقل بالتدفق الخلوي. حددت خطوط الأساس للبقاء والنسبة المئوية للخلايا الحاملات للتجارة والنقل في على الأقل ثلاثة آبار لكل لوحة المكتبة، وتقرر ضرب إيجابية كزيادة في النسبة المئوية للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا من ثلاثة انحرافات معيارية فوق خط الأساس ([دمس]) وحدا أدنى من 25% بروتينات فلورية خضراء الخلايا إيجابية. وقد حددنا المخدرات 12 بفعل زيادة كافية في السكان الحاملات للتجارة والنقل (الجدول 1).

Figure 1
الشكل 1: أستروجليال التمايز مراسل النظام.
رسم تخطيطي لمراسل GFAP:GFP بجرينزيو. جسكس لا تعبر عن مزيج مناسب من عوامل النسخ اللازمة لتنشيط مروج الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني) و لذلك سوف لا تعبر عن التجارة والنقل (اللوحة العلوية). ومع ذلك، عندما تكون عوامل النسخ المناسبة موجودة (مثلاً عندما تكتسب الخلايا مصير أستروجليال-التفريق) المروج توصيني تصبح نشطة، والخلايا وسيعبر عن مراسل التجارة والنقل (أسفل اللوحة). (GSC-الخلايا الجذعية الدبقي، T2A-بروتين رابط، زو-R-زيوسين المقاومة الجينات، TF-عامل النسخ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: التفريق بين أستروجليال-سوبكلون التحديد.
صور الممثل من سوبكلونيس "غسك" هسر GBM1 يعبر عن مستويات منخفضة (GL) أو مستويات عالية (غ) مراسل GFAP:GFP استخدام مجهر الأسفار (40 X التكبير تظهر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التدفق الخلوي لتحديد الفلورية الخضراء.
هسر-GBM1 نيوروسفيري المستمدة من المريض الخط كان ترانسدوسيد مع GFAP:GFP lentivirus مراسل، واختير سوبكلونيس متعددة استناداً إلى تعبير بروتينات فلورية خضراء في نيوروسفيري الشروع-الخلية وأكدته التدفق الخلوي. أسماء هذه الحيوانات المستنسخة GL (توصيني منخفضة) أو هرمون النمو (توصيني عالية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الوصف الوظيفي هسر-GBM1 GFAP:GFP سوبكلونيس.
سوبكلونيس GL هي أكثر كلونوجينيك في المختبر كما هو مبين بزيادة غسك الترددات التي يتم قياسها بتحليل تمييع الحد المتطرفة (الدا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الاسم إضعاف الزيادة في التجارة والنقل + الخلايا الوصف حاجز الدم في الدماغ احتمال البنك المخدرات
فينوريلبيني 8.97 العلاج الكيميائي لمكافحة الانقسامية - 0.88
Diphenoxylate 13.89 أنتيديارهيل + 0.96
لوميريزيني 10.89 مانع قناة الكالسيوم/دماغي وعائي نا نا
فينبروباماتي 10.73 والمركنه/العضلات ارتخاء، تعمل بشكل مركزي نا نا
6-أزاوريديني 15.07 أنتيميتابوليتي/المضادة للفيروسات نا نا
ايرينوتيكان 14.14 توبيسوميراسي أنا المانع + 0.63
اتراكوريوم بزيلات 8.16 ارتخاء العضلات نونديبولاريزينج + 0.93
جليميبيريدي 8.75 الألم + 0.73
الهيكساكلورفين 9.83 مطهر + 0.92
الديجوكسين 8.23 غليكوزيد كارديوتونيك - 0.72
فليكينيدي 10 وكيل المضادة عدم انتظام ضربات القلب + 0.86
نيسولديبيني 5.05 مانع قناة الكالسيوم - 0.95

الجدول 1: الجزيئات الصغيرة الذي يحفز التعبير مراسل توصيني-التجارة والنقل في هسر-GBM1 جي-1
تم العثور على اثني عشر مركبات لزيادة النسبة المئوية للخلايا معربا عن التجارة والنقل إلى حد كبير (يظهر زيادة إضعاف) واستيفاء المعايير الصارمة للانحرافات المعيارية إيه ثري عبر خط الأساس، الخلايا المعالجة [دمس]، ومع لا يقل عن 25% بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا. قدرة واحتمال وجود عميل معين لعبور حاجز الدم في الدماغ (المخدرات بنك (−). اختصار: NA (المعلومات غير متوفرة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في حين أن معظم الدراسات السابقة من جسكس وركزت أساسا على العلامات التي تحدد لهم، في هذه الدراسة قررنا اتخاذ نهج عكسي. نحن تركز أساسا على نسلها متمايزة المتولدة عن جسكس (مثلاً، يعبر عن أستروجليال وعلامات العصبية الخلايا). هنا نظهر استخدام المخدرات إنتاجية عالية يستند إلى الخلية فحص النظام، الذي يستند إلى توصيني البشرية تعتمد على مروج التعبير عن التجارة والنقل. أجريت جميع التجارب التي تستخدم خطوط الخلايا جليوبلاستوما نيوروسفيري المستمدة من المريض. يتم وصف بروتوكول مفصلة تصف العزلة والتوسع في هذه الخطوط في جالي et al17.

هذا النظام ليس فقط مساعدة لنا في التعرف على الجزيئات الصغيرة التي هي قادرة على استحثاث التمايز الخلوي من جسكس ولكن أيضا ساعدتنا على تحديد شكل لا لبس فيه أن يحدد التعبير عن علامة التمايز أستروجليال توصيني كلونوجينيك قدرة خلايا فردية في الخليج للحاسبات الآلية عن طريق مقارنة الترددات GSC. وضعت المقايسة الدا ييفانج هو جين تاو وجوردون ك. سميث. القراء مدعوون إلى قراءة المخطوطة لفهم متعمق ل تحليل القوة والضعف15. تشكيل مستعمرة سجل خطوة عالية يعتمد نوع الخلية وسيتطلب على الأرجح تعديلاً على أساس خط الخلية المستخدمة. وعلاوة على ذلك، كقاعدة عامة، نحن نستخدم المجال القطر إيه وان زيرو زيرو مكم كمؤشر جيد على أن نيوروسفيري قد نشأت عن طريق كلونوجينيك GSC.

وعلاوة على ذلك، يسمح المخدرات فحص نظام يصف لنا هنا لتحديد مسارات الرواية (على وجه التحديد النقل أستيل والكالسيوم) المطلوبة للحفاظ على جسكس في الحالة غير متمايزة (انظر الجدول 1). قد تختلف تركيز المخدرات بداية على الخط المكتبة والخلية المستخدمة. أيضا، قد تحتاج إلى الوقت اللازم للتمايز الخلوي التكيف. وعلاوة على ذلك، يتطلب التحقق من صحة الورمية مرات المخدرات بدء ورم في فيفو الاعتداء 18.

يحتمل أن حد طفيفة لهذا الأسلوب هو أن يحدث التمايز عفوية لا محالة في أي ثقافة أثرت على الخلايا الجذعية، وهذه الظاهرة تميل إلى زيادة عدد من الممرات في الثقافة ويختلف بين سوبكلونيس الفردية. وفي الواقع، لاحظنا التمايز عفوية في أعمالنا سوبكلونيس عموما بعد مرور 15. ولذلك، نحن محدودة تحليلاتنا تمايز الثقافات في أرقام المرور لا تتجاوز خمسة.

ولذلك، ربما أهم نقطة حرجة في هذه المنهجية للحفاظ على باساجينج في المختبر من هذه جسكس إلى الحد الأدنى، وعندما تعمل في المختبر، الحفاظ على كثافة الثقافة أدناه 1.5x105 خلايا/مل. وعلاوة على ذلك، فإنه ينصح بشدة أن كل دواء "ضرب" التحقق من صحة ضد سوبكلونيس مراسل إضافية من نفس خط المؤسسة العلمية العالمية، وكذلك، ضد سوبكلونيس مراسل معزولة عن نيوروسفيريس غسك المستمدة من المريض مختلف الخطوط. وهذا سيزيد ثقة حقيقية "ضرب" هو في متناول اليد.

براعة المنهجية المبينة في هذا البروتوكول قوية يعزز قيمة العلاج من المخدرات التي يسببها سرطان الخلية الجذعية التفريق، وينبغي أن تساعد في تحديد العقاقير الجديدة كاستراتيجيات علاجية رواية محتملة للخليج للحاسبات الآلية وغيرها من الأورام. وأخيراً، يمكن تحسين المقايسة لاستخدامها مع غير الورمية الخلايا الجذعية العصبية، وغيرها من أنواع السرطان، وتمايز مختلف الصحفيين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ودعمت هذا العمل تم جزئيا ب R01CA187780 المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ESGRO Complete Accutase EMD Millipore SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Sigma Aldrich H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) SBI (System Biosciences) SR10015VA-1
50 ml sterile disposable reagent reservoirs Corning 4870
6 well plate Thermo Fisher Scientific 130184
96 well plate Falcon 353072
Biolite T25 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130189
Biolite T75 cm² Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130190
15 ml Centrifuge tubes Celltreat 229411
1.5ml Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 - 20uL VistaLab Technologies 1060-0020
Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL VistaLab Technologies 1060-0250
Multi 12-channel pipette tips 25 μl VistaLab Technologies 4060-1002
Multi 12-channel pipette tips 250 μl VistaLab Technologies 4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer EMD Millipore 0500-4005
NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries Evotec
Name Company Catalog Number Comments
For the preparation of neural stem cell media (500 mL) Final concentration
BSA GoldBio.com A-421-250 0.20%
DMEM/F12 10X Corning 90-091-PB 1X
Heparin sodium salt Sigma Aldrich H3149 0.0002%
HEPES 1M Sigma Aldrich H4036 5.4 mM
Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) Life Technologies 41400-045 1X
NaHCO3 Sigma Aldrich S-5761 14.5 mM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X Gibco 15140-122 1X
Progesterone Sigma Aldrich P8783 16 nM
Putrescine Sigma Aldrich P5780 4.8 µM
Basic FGF (FGF2), Human GoldBio 1140-02-50 10 ng/ml
EGF, Human GoldBio 1150-04-100 20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind Corning 431160 Use to filter sterlize media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71, (12), 4055-4060 (2011).
  3. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, (7120), 756-760 (2006).
  4. Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77, (6), 655-666 (2010).
  5. Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170, (1), 347-355 (2007).
  6. Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19, (12), 3224-3233 (2013).
  7. Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16, (24), 6060-6070 (2010).
  8. Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324, (20), 1385-1393 (1991).
  9. Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, (7120), 761-765 (2006).
  10. Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, (10), 2524-2533 (2007).
  11. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177, (3), 1491-1502 (2010).
  12. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50, (4), 357-368 (2012).
  13. Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33, (35), 4433-4441 (2014).
  14. Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25, (6), 724-732 (2014).
  15. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347, (1-2), 70-78 (2009).
  16. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), 851-856 (2015).
  17. Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, (19), 7011-7021 (2004).
  18. Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7, (1), 459-472 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics