Author Produced

تحديد منطقة عضلة مستعرضة الضوئية عضلات الطيران غير المباشر الكبار Melanogaster المورفولوجية

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ونحن التقرير طريقة لتحديد حجم منطقة العضلات، وطريقة غير مباشرة لتحديد العضلات في البالغين المورفولوجية . علينا أن نظهر عضلات تطبيق منهجية لدينا من خلال تحليل هذه الرحلة غير المباشرة في نموذج المورفولوجية لمرض "الضمور ميوتونيك".

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Selma-Soriano, E., Artero, R., Llamusi, B. Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles. J. Vis. Exp. (133), e56179, doi:10.3791/56179 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العضلات الهزال، المعروف باسم ضمور العضلات وهو النمط الظاهري مشتركة في نماذج المورفولوجية للأمراض العصبية العضلية. وقد استخدمنا عضلات الطيران غير المباشر الذباب، على وجه التحديد عضلات طولية دورسو (DLM)، تجريبية تخضع لقياس النمط الظاهري ضامر الناجمة عن مختلف الأسباب الوراثية (إيفمس). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تضمين عضلات الصدر يطير لتقطيع شبه رقيقة، وكيفية الحصول على تباين جيد بين العضلات والأنسجة المحيطة، وكيفية معالجة صور المجهر الضوئي لاهتزازات الحصول على بيانات قابلة للقياس الكمي و تحليل. يصف لنا ثلاثة طلبات محددة من خط الأنابيب المنهجية. أولاً، نحن إظهار الكيفية التي يمكن بها تطبيق الأسلوب التحديد الكمي لضمور العضلات في نموذج يطير ضمور ميوتونيك؛ ثانيا، يمكن أن تساعد على قياس منطقة عضلة مستعرضة تحديد الجينات التي تعزز أو منع ضمور العضلات و/أو ضمور العضلات؛ ثالثا، يمكن تطبيق هذا البروتوكول تحديد ما إذا كان مركب مرشح قادراً على تعديل كبير النمط الظاهري ضامر معطى الناجم عن طفرة المسببة للمرضأو بواسطة مشغل بيئية.

Introduction

الصدر ذبابة الفاكهة يحتوي على فئتين مختلفتين من عضلات الطيران، ومتميزة وظيفيا وفسيولوجيا وتشريحيا. هذه العضلات: التحكم في عضلات الرحلات غير المباشرة (IFM)، التي تتألف من طولية دورسو (DLM) والعضلات دورسو البطني (طبيب بيطري) (الشكل 1)، والرحلة متزامن العضلات1،2. هذه العضلات معا توليد الطاقة الميكانيكية المرتفعة المطلوبة للرحلة. الحجم والتوزيع والتصرف إيفمس rostro والذيلية السماح اتجاه سهل ل تقطيع مستعرضة3 (الشكل 2A). ولهذا السبب، اخترنا هذه العضلات لدراسة ضمور العضلات في melanogaster المورفولوجية.

Figure 1
رقم 1. الرسم التخطيطي للصدر ذبابة الفاكهة عرض عضلات الطيران غير المباشر الترتيب (إيفمس). (يسار) يمثل وجهة نظر أفقي و (يمين) مقطع عرضي من القفص الصدري. إيفمس تتكون من عضلات دورسو-طولية (DLM) (باللون الأحمر) والعضلات دورسو-البطني (طبيب بيطري) (باللون الأخضر).

الحفاظ على بنية الأنسجة والسيطرة على اتجاه محور دورسو البطني من أقسام نسيجية ذات الأهمية الحاسمة لضمان التقييم السليم لمنطقة عضلة مستعرضة. للحفاظ على بنية العضلات قمنا باستخدام خليط تثبيت معدلة من توملينسون et al. 4 . وعلاوة على ذلك، نظراً لعضلات الأنسجة الداخلية، هي مشكلة كتثبيت لا يمكن اختراق الخلائط للأنسجة المستهدفة كتوم من الهيكل الخارجي المورفولوجية. للتحايل على هذه المشكلة، ازلنا يطير الرأس والساقين، وأجنحة وآخر الجزئين من البطن لخلق الثقوب التي يسمح للمخلوط التثبيت لإدخال. كجزء من تثبيت البروتوكول شملنا المعاملة مع أكسيد الاوزميوم (أوسو4)5، الذي يستخدم على نطاق واسع بسبب قدرته على إصلاح الدهون، بما في ذلك الثلاثية. أوسو4 يحافظ على معظم هياكل جيد للغاية، لا سيما على مستوى الخلوية، وفي نفس الوقت يوفر على النقيض من الصورة. بعد التثبيت، تم تضمينها ثوراسيس المورفولوجية في الراتنج لمستعرضه شبه رقيقة تقطيع (1.5 ميكرومتر). لتحسين التباين والأنسجة يمكن أن يكون بالإضافة إلى ذلك ملطخة تولويدين الأزرق. أخذت صور ثوراسيس كاملة في 10 X وكان كمياً منطقة العضلات بيناريزينج الصور (من أبعاد متساوية) والتحديد الكمي للنسبة المئوية المقابلة لانسجة العضلات (بكسل سوداء) من أصل المجموع، مع برنامج إيماجيج بكسل.

التعديلات على مخاليط إعداد وتثبيت الأنسجة، كالزيادة في تركيز حل4 و glutaraldehyde أوسو، وعرض في هذا البروتوكول، يسمح الحفاظ على فريدة من نوعها لانسجة العضلات. يرجع ذلك إلى أن يتجنب البروتوكول بالتدهور وتشوه النسيج، مما يجعل التحليل اللاحق للعينات أكثر موثوقية حتى في ظروف شديدة ضامر المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية العضلية مثل ضمور ميوتونيك (ألماني). في شكله أكثر شيوعاً، ومارك ألماني من النوع 1، جلبت هذه الاضطرابات الوراثية النادرة يكرر CUG الموسع في نصوص الضمور myotonic البروتين كيناز (دمبك). الجيش الملكي النيبالي دمبك متحولة المجاميع البؤر ريبونوكلير النموذج الذي عزل البروتينات ربط الحمض النووي الريبي النووي مثل موسكليبليند (MBNL1-3؛ 6من موسكليبليند (Mbl) في المورفولوجية). أننا إنشاء نموذج المورفولوجية "الضمور ميوتونيك" بالإعراب عن 250 CTG يكرر تحت المروج سلسلة ثقيلة العضلات الميوسين (Mhc-Gal4). نموذج الذباب كانت يطير مع النمط الظاهري نموذجي 'عقدت حتى أجنحة' وخطيرة عضلة ضمور في هذه إيفمس (الشكل 2). وأظهرت الدراسات السابقة التي أجريت في المختبر أن تصميم منطقة العضلات إيفمس طريقة موثوقة قياس آثار المعدلات الكيميائية أو الوراثية المختلفة من ضمور العضلات في هذه الذباب النموذجي7. وكمثال على ذلك، تحقق overexpression isoform Mbl ج في الذباب معربا عن 250 CTG يكرر في العضلات، إنقاذ منطقة العضلات، كما يتم استنفاد Mbl بعزل العامل المسبّب في DM1 المرضية8 (الشكل 2). كما تم إنقاذ منطقة العضلات بعد تغذية نموذج مارك ألماني الذباب مع Abp1، هيكسابيبتيدي مع DM1 مكافحة ثبت النشاط9 (الشكل 2D).

Figure 2
رقم 2. التحديد الكمي للمقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج. العضلات الرحلات غير المباشرة (أ-د) من melanogaster المورفولوجية الوراثية ذات الصلة المشار إليها. (أ) مراقبة الذباب (yw). (ب) التعبير عن 250 غير الترميز CTG يكرر في العضلات (UAS-CTG(250)x) تسبب انخفاض منطقة العضلات في دلمس بالمقارنة مع مراقبة الذباب. (ج) هذا النمط الظاهري ضمور العضلات قد انقذته overexpression موسكليبليند (MblC) (UAS-CTG (250) × UAS-MblC) و (د) تغذية الذباب النموذجي مع هيكسابيبتيدي Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). في جميع الصور الجانب الظهرية في الأعلى. كانت مدفوعة المتسلسلات العضلات باستخدام أحد المروجين ثقيلة-سلسلة الميوسين (Mhc)-Gal4. (ه) التحديد الكمي للنسبة المئوية لمساحة العضلات بالنسبة للذباب التحكم أكدت أن الخلافات كانت كبيرة. ويبين الرسم البياني وسائل ± S.E.M. * *ف< 0.01 و * ف < 0.05 (الاختبار t Student´s). شريط الحجم: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الطريقة التي ذكرت هنا سوف تكون موضع اهتمام الباحثين تركز على تنمية العضلات وصيانة، والشيخوخة، وباثولوجيا المرض واختبار المخدرات كما أنها توفر معلومات موثوقة حول كيفية استجابة أنسجة العضلات للعوامل الداخلية والخارجية على حد سواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التثبيت وتضمينها الراتنج

  1. تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) أو عن طريق استخدام كتلة جليد في انخفاض درجة حرارة الجسم. استخدام مجهر تشريح (مع انخفاض التكبير لرؤية الطاير كاملة) ومقص لإزالة الساقين والرأس وأجنحة الجزء الطرفي من البطن لتسهيل تغلغل مثبت. المعالجة الدقيقة للذبائح غير مطلوب في هذه الخطوة لتفادي تشوه الصدر.
    ملاحظة: تبدأ مع الذباب على الأقل 12 في النمط الوراثي لضمان وجود عدد كاف من الأفراد المجهزة بشكل صحيح في نهاية الإجراء.
  2. نقل الجثث إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد (وضع حد أقصى للأفراد 6 في أنبوب) التي تحتوي على ميليلتر 200 من الحل 1.
    ملاحظة: لا يمكن أن تظل الذبائح في الحل 1 لأكثر من 20 دقيقة.
    1. لحل 1، خلط المكونات في هذه النسب وحدة التخزين: ¼ 4% بارافورمالدهيد ¼ 8 ٪ glutaraldehyde و ¼ م 0.2 غ،2هبو4 و NaH 0.2 M ¼2ص4.
  3. إضافة 200 ميليلتر للحل 2 واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    1. الحل 2: ميكس الحل 1 و أوسو4 بنسبة 1:1 (v/v).
      تنبيه: أوسو4 بالغة السمية. معالجته في غطاء دخان باتخاذ التدابير المناسبة في مجال السلامة والتخلص منها.
  4. قم بإزالة جميع السائل. إضافة 200 ميليلتر للحل 2 واحتضان على الجليد ح 1-2.
  5. إزالة الحل ويذوي العينات من خلال سلسلة إيثانول متدرج كما يلي: مرة في 30%، 50%، 70%، 90%، ومرتين في الإيثانول المطلقة؛ كل 5 دقائق. أضف 1 مل إيثانول لتغطية العينات.
    ملاحظة: حالما يتم وضع الأنسجة في الإيثانول 90%، يمكن تنفيذ الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان كل حضانة العينات مرتين في أكسيد البروبيلين لمدة 10 دقائق.
    تنبيه: أكسيد البروبيلين السامة، واستخدامها في غطاء دخان.
  7. تحل محل أكسيد البروبيلين خليط 1:1 (v/v) من أكسيد البروبيلين وراتنج الإيبوكسي واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    تنبيه: الراتنج بالغة السمية في حالة سائلة. الراتنج متاح كمجموعة من أربعة عناصر (ألف، باء، جيم ودال).
    1. راتنج الإيبوكسي، إضافة في كوب المتاح ز 54 من الراتنج (A)، ز 44.5 من مقوى 2.5 g مسرع (ج) و 10 غم من الملدنات (ب) (د). الجمع بين جميع المكونات الراتنج في غطاء دخان. تخزين الراتنج في مختبرين في-20 درجة مئوية (لمدة تصل إلى 6 أشهر) أو في-80 درجة مئوية (لعدة سنوات).
    2. لتجاهل الراتنج، خبز على 70 درجة مئوية ح 24 لأن راتنج الصلبة غير السامة. تجاهل جميع الحلول السابقة في مجموعة المعادن الثقيلة ووفقا للإجراءات الدولية المناسبة، لأن الحلول يمكن أن تحتوي على آثار أوسو4-
  8. محل الخليط السابق مع الراتنج 100%، واحتضان هذه العينات ح 4.
  9. نقل الجثث إلى قوالب بلاستيكية تحتوي على راتنج جديد (الذبيحة واحد في كل بئر من العفن). استخدام عصا خشبية شحذ أو إبرة لنقل وتوجيه الذبائح في الآبار وترك الراتنج بلمرة بين عشية وضحاها في فرن باستور في 70 درجة مئوية.
    ملاحظة: لضمان التوجه المناسب للذبائح للتشذيب الخلفي وتمزيقها، الذبائح ينبغي أن يكون الكذب على الجانب الطويل، مع الجزء الأمامي من الذبيحة قريب جداً من حافة البئر.

2-قص وتقطيع كتل

  1. إزالة كتل الراتنج مبلمرة من القوالب. استخدام شفرات الحلاقة لتقليم بعيداً من الراتنج وشكل شكل المنحرف المحيطة بالذبيحة وإعطاء التوجيه المناسب في مبضع. بدء تقطيع جميع الذبائح بعد خياطة عرضية للحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
    ملاحظة: يجب أن يكون القسم عمودي على محور الصورة دلمس تقليم العينة بشكل صحيح ( الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3 . مقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج من ضمور Myotonic نموذج الذباب. في (أ)، لم يكن تشذيب العينة الصحيحة حسب القسم في الجزء الأيسر الظهرية الصورة ليست تماما مستعرضاً للعضلات. نتيجة لذلك، يبدو أن حزم العضلات الثلاث على الجانب الأيمن العلوي أكبر من تلك التي في الجانب الأيسر. يؤدي هذا الخطأ في المبالغة في منطقة العضلات. (ب) قسم من كتلة راتنج المشذبة بشكل صحيح. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.

  1. قص 1.5 ميكرومتر أبواب سميكة مع أولتراميكروتومي ونقل المقاطع إلى قطرات الماء عبر الشرائح مهيلم.
    1. الحصول على المقاطع من الجزء ميسوثوراكس لجميع العينات للحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
  2. ضع الشرائح التي تحتوي على الأقسام المتعلقة بكتلة تدفئة في 70-80 درجة مئوية حتى يتبخر ح2س. عند هذه النقطة، يمكن ملاحظة العينات مع التباين4 أوسو (الشكل 4 أ).

3-تلوين الأقسام IFM

  1. تغطية المقاطع بما يكفي تولويدين الأزرق لما يقرب من 30 ثانية على كتلة التدفئة.
    1. لحل تولويدين الأزرق، حل 1% تولويدين الأزرق و 1% من الحفر في ح2o.
  2. شطف مع ح2س وترك الشرائح على طبق دافئ يتبخر الماء. كرر تلطيخ مع تولويدين الأزرق إذا كان التباين يجب أن يكون تعزيز (الشكل 4 باء).

Figure 4
الشكل 4 . مقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج مع تباين مختلفة ستينينجس- كلا الفريقين تظهر صور ذباب نموذج DM1 التي تتغذى على Abp1 كما هو الحال في 2D الشكل. (أ) صورة مقطع مع التباين4 أوسو. (ب) قسم ملطخة تولويدين الأزرق يسمح التصور أفضل من حزم العضلات. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.

4-تركيب أبواب IFM

  1. الجاف للشرائح مع كتلة التدفئة حتى يتبخر ح2س.
  2. وضع قطرات 1 أو 2 من المتوسطة المتصاعدة على الأقسام ووضع ساترة.
    تنبيه: القيام بهذه الخطوة في غطاء دخان سبب السمية المتوسطة المتصاعدة.

5-اقتناء الصور وتحديدها كمياً من ناحية العضلات

  1. أن الصور في التكبير المنخفض حتى مجموعة كاملة من العضلات DLM في التركيز. ونحن عادة استخدام 10 X.
    1. لإجراء تحليل إحصائي اتخاذ صور المسلسل على الأقل 5 في الطيران وتحليل الذباب 5 على الأقل من كل مجموعة تجريبية.
  2. حدد الصورة التي تحتوي على عضلات كاملة (الشكل 5A). فحص المحور أو التوجه للقسم وتجاهل العينات مع التوجه غير المناسب، الذي سوف يشوه النتائج (مقارنة الأرقام 3A/3B للتمييز بين شدة والمقاطع الموجهة جيدا، على التوالي).
  3. استخدام برنامج إيماجيج لتحديد منطقة (بالبكسل) التي تحتوي على فقط دلمس (الشكل 5A/5B). للمقارنة بين مختلف المجموعات التجريبية، سيكون مجال مرجعي لاستخدامها دائماً الطاير مع عضلات أكبر. في كل الصور من الأنماط الجينية المختلفة لمقارنة، حدد منطقة تحتوي على دلمس أبعاد متساوية إلى منطقة مرجعية (الشكل 5 (ب)).
  4. بيناريزي الصور باستخدام الأمر صورة-ي: عملية/ثنائي/جعل ثنائي وحذف مناطق أو وحدات البكسل التي لا تتوافق مع العضلات للفائدة (الشكل 5).
    1. في الحالة التي تظهر البقع السوداء أرتيفاكتوال في مناطق أخرى عدا العضلات، حذفها بواسطة الأمر أدوات الرسم وحدد رمز الممحاة.

Figure 5
الشكل 5 . صورة إجراء تحليل لتحديد منطقة العضلات. (A) الفرع مستعرضة من ضمور Myotonic نوع 1 نموذج يطير الصدر مع مستطيل تحتوي على DLM. (ب) المحدد من المنطقة مع عضلات الطيران غير المباشر فقط والأمعاء (*). (ج) بيناريزيد الصورة. المناطق السوداء تتوافق مع العضلات للفائدة. وقد محيت الأمعاء التقدير الكمي دقيق لمنطقة العضلات. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.

  1. تقدير النسبة المئوية المقابلة لانسجة العضلات (بكسل سوداء) مجموع مع الأمر بكسل: تحليل/القياس وحدد الخيار منطقة الكسر. هذه النسبة المئوية لمساحة يتم تقدير كتلة العضلات DLM كل ذبابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد ما إذا كان overexpression MblC أو إدارة Abp1 أي تأثير في النمط الظاهري الضموري حثل Myotonic نموذج يطير ركزنا على دلمس، التي جزء من إيفمس (الشكل 1). عقدنا العزم أن الذباب النموذجي، الذي أعرب عن 250 يكرر CTG غير الترميز في جميع أنحاء الجهاز العضلي مدفوعا بالمروج الميوسين الثقيلة-سلسلة (Mhc)-Gal4، بتخفيض 50% من منطقة العضلات مقارنة بالسيطرة على الذباب. على النقيض من ذلك، التعبير المشارك MblC ويكرر CTG الموسعة مع السائق نفسه، قمعت بشدة مثل هذا النمط الظاهري، وكانت منطقة العضلات كروسيكشونال 70% ذباب (العادي) عنصر التحكم. إدارة هيكسابيبتيدي Abp1 في وسائل الإعلام الغذائية وبالمثل قمعت بالنمط الظاهري ضامر، والذباب النموذجي الذي اتخذ المجمع أظهرت حوالي 60% منطقة العضلات العادية (بدلاً من 50% التي نموذجية من الذباب DM1؛ الشكل 2E). للتحديد الكمي لهذه العينات، استخدمنا المقاطع ملطخة تولويدين الأزرق لتعزيز التباين (أرقام 4 و 5).

ونلاحظ أن عددا من الأخطاء التقنية إلى حد كبير قد تتداخل مع التقدير الكمي النهائي أثناء الإجراء. مشترك أن كتل الراتنج يتم لا بشكل صحيح قطع، التي قد ميسورينت العينة ويؤدي إلى تمزيقها منحرف دلمس. نتيجة لذلك، قد تبدو بعض العضلات DLM أكبر على جانب واحد مقابل واحد كونترالاتيرال (انظر على سبيل المثال الشكل 3)، الذي يدخل إلى خطأ كبير في التقدير الكمي النهائي. خطأ آخر قد تحدث هو عدم كفاية اختراق مثبت في أنسجة العضلات (الشكل 6)، التي تبدو المتدهورة ومشوه مما يجعل من المستحيل تقدير دقيق من منطقة العضلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد ثبت أن melanogaster المورفولوجية هو نموذج مفيد لدراسة الأمراض العصبية العضلية البشرية7،10،11، بما في ذلك "ضمور ميوتونيك"، التي تتميز بمظهر ضمور العضلات. البروتوكول المعروضة هنا أداة مفيدة للتحديد الكمي لضمور العضلات الناجم عن ظهور أو تطور مرض معين في نموذج الطيران. على سبيل المثال، من الممكن أيضا تتبع وقياس انحطاط ألياف العضلات عن طريق إجراء هذا التحليل في الذباب من مختلف الإعمار.

وهناك خطوات حاسمة في البروتوكول. ويجب التقليل من الوقت اللازم لتشريح الذباب قبل انتهاء التثبيت لتجنب تدهور الأنسجة. لاختراق الحل مثبت في العضلات (الشكل 6)، من المهم إزالة الرأس، وأجنحة وارجل الذباب لضمان الوصول إلى الحلول للمناطق داخلية الطاير. من الضروري الحصول على مقاطع مستعرضة فيها عضلات الفائدة مرئية تماما. بيناريزيشن العينات للقياس الكمي ضروري حتى يتم تحديد ملاحظة أن البيكسلات المحددة (بكسل سوداء) مطابقة للأنسجة للفائدة والمنطقة كلها لمصلحة.

Figure 6
الشكل 6. الكبار المورفولوجية الصدر مع عدم كفاية اختراق مثبت في العضلات (*)، مما يتسبب في تدهور وتشوه النسيج أثناء معالجة العينة. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.

واحد من الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول هو أوسو4، الذي يحافظ على معظم هياكل جيد للغاية، لا سيما على مستوى الخلوية، وفي نفس الوقت يوفر التباين ل الصورة5. عيب هام للأسلوب غير سمية4أوسو ويجب دائماً أن تستخدم غطاء دخان، ويتطلب المناولة الآمنة والتخلص منها. يسمح هذا البروتوكول ليس فقط دقة التحديد الكمي لانسجة العضلات بسبب تحديد والتضمين الداخلي، ويمكن استخدامه أيضا لتطبيق آخر مثل الميكروسكوب الإلكتروني (م) إعداد. ومع ذلك، فإنه يعاني قيداً جوهرية لأن المقاطع النسيجي الناتج لا يمكن استخدامه في الاختبارات اللاحقة، مثل إيمونوهيستوتشيميستري.

وأخيراً، هذا الأسلوب هو الأمثل أيضا للكشف عن الاختلافات منطقة العضلات الصغيرة مما يسمح بتحديد معدلات موثوقة في الجينية أو الكيميائية شاشات8،9. على الرغم من ذلك، نظراً لمجال زيادة العضلات لا تعني بالضرورة أفضل وظيفة العضلات، تحديد منطقة عضلة مستعرضة ينبغي أن يكون مثالي يرتبط بالاختبارات الوظيفية مثل رحلة فحوصات12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر أعضاء متعدية الجينوميات المجموعة وكاثرين ي هانسون للتغذية المرتدة والتحسينات التي أدخلت على هذا البروتوكول. نفذ هذا المشروع بمنحه بحثية SAF2015-64500 آر، الذي يشمل "صناديق التنمية الإقليمية الأوروبية" ومنحته وزارة دي ايكونوميا y كومبيتيتيفيداد R.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image-J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome Leica Leica UC6
Microscope Leica Leica MZ6 Bright field technique.
Razor blades Electron Microscopy Sciences 71970 Several alternative providers exist.
Scissors World Precision World 14003 Several alternative providers exist.
Embedding molds Electron Microscopy Sciences 70900 Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde Fluka (Sigma) 49624 Toxic.
OsO4 Polyscience 0972A Extremely toxic.
Propylene oxide Sigma Aldrich 82320-250ML Extremely toxic.
resin (Durcupan) Sigma Aldrich 44611-44614 Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue Panreac 251176 Toxic.
Mountant Medium (DPX) Sigma Aldrich 44581 Dangerous.
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148-500G Harmful.
Na2HPO4 Panreac 122507 0.2 M dilution.
NaH2PO4 Panreac 121677 0.2 M dilution.
Borax Panreac 3052 Toxic.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
  2. Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
  3. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. 1-57 (1993).
  4. Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
  5. Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
  6. Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
  7. Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
  8. Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
  9. García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
  10. van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
  11. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. 1184 (2010).
  12. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. e51223 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics