마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

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Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

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Abstract

그것은 인식 하는 동안 그 aquaporin-4 (AQP4)-특정 T 세포와 항 체 neuromyelitis optica (NMO), 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 면역 demyelinating 질병, 둘 다 AQP4 타겟 모델의 생성의 병에 참여 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 발현 어려운 입증 했다. 그 T 세포 순진한 받는 사람 마우스 질병을 전송할 수 있지만 AQP4 펩 티 드와 야생-타입 (WT) 쥐의 면역 T 세포 증식을 elicited. 최근에, 2 개의 소설 AQP4 T 셀 epitopes, 펩 티 드 (p) 135-153, p201-220, 발견 했다 공부 하는 T 세포 반응성이이 epitopes 제안 하는 AQP4 불충분 한 (AQP4-/-) 마우스에서 AQP4에 대 한 면역 응답을 일반적으로 thymic 의해 제어 부정적인 선택입니다. AQP4-/- Th17 편광 p135-153 또는 p201-220 유발된 마비에 받는 WT 쥐에서 척수와 시 신경의 주로 환자의 염증에 연결 됐다는 T 세포. 염증 주변 시 신경 및 내부 망막 레이어 (IRL)의 참여 변화 직렬 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 각 성 했다. 여기, 우리는이 생체 내에서 의 새로운 모델 AQP4 대상 CNS 면역 (ATCA), 병원 성 AQP4 전용 T 세포와 그들이 어떻게 B 협조 수 있습니다의 개발을 허용 하는 메커니즘을 연구를 지금 사용할 수를 만드는 데 사용 하는 방법 설명 NMO 병 인에 셀입니다.

Introduction

Neuromyelitis optica (NMO) 중앙 신경 시스템 (CNS) 자기 면역 염증 demyelinating 질병 잦은 마비와 영구적인 신경학 적 장애1로 이어지는 시각 손실의 원인입니다. NMO는 현재 간주 주로 체액 성 면역 질환2 aquaporin-4 (AQP4), 이다3,4에 풍부 하 게 표현 하는 수로 대상으로 하는 항 체 (Igs)와 관련으로. 그러나, CNS 염증 CNS AQP4 Ig5,6의 항목에 대 한 전제 조건입니다. 따라서, 그것은 안티-AQP4 Igs 혼자의 전송에 의해 NMO의 모델을 설치 하 게 가능 되지 않았습니다. NMO 환자에서 (1) 병원 성 AQP4 전용 Igs IgG11,2는 결과 T 세포 의존 Ig 서브 클래스7 (2) T 세포는 NMO 병 변8,9 (3) NMO 식별 됩니다 연결 된 특정 MHC II 유전자 (예: HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, 그리고 (4) proinflammatory AQP4-반응성 박사-제한 된 Th17 세포는 NMO 환자11,12 모든 확장 표시 AQP4 전용 T 세포는 중요 한 역할 NMO pathogenesis에서. 따라서, AQP4 전용 T 세포 NMO pathogenesis에 기여할 수는 어떻게 결정 하는 동물 모델을 개발 하는 것이 중요 하다.

몇 년 전, 여러 AQP4 T 셀 epitopes 야생-타입 (WT) 마우스13,14 와 쥐15에서 확인 되었다. AQP4 반응 T 세포 순진한 받는 사람 쥐15,16opticospinal 염증 유발 수 관찰 되었다, 그러나 CNS 질환의 중요 한 임상 증상 관찰 하지 했다. 마찬가지로, AQP4 T 셀 epitopes14,17를 포함 하는 펩 티 드와 WT 쥐의 면역을 직접 또는 그 결정 요인17를 대상으로 하는 proinflammatory T 세포의 전송, 임상 증상을 일으키지 않았습니다 또는 조직학 CNS 면역의 증거입니다.

최근에, 그것은 높은 선호도18C57BL/6 AQP4-결핍 (AQP4-/-) 마우스 AQP4 펩 티 드 (p) 135-153 또는 p201-220, MHC II (-Ab) 바인딩할 예측 결정 하는 2 개의 요인의 그 면역 관찰 했다, elicited 강한 CD4 + T 세포 응답17. 반면,이 두 펩 티 드 WT 쥐에만 겸손 증식 반응 elicited. 또한, AQP4/- 생쥐에서 T 세포에 의해 이러한 결정 요인의 인식에 대 한 사용 T 세포 수용 체 (TCR) 레 퍼 토리 독특한 했다. 샨 다, 이러한 연구 결과 AQP4의 T 세포 인식 thymic 부정적인 선택에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. AQP4 p135-153-또는 p201-220-특정 AQP4-/- 기증자 쥐에서 Th17 세포 유도 순진한 받는 WT 쥐;의 거의 100%에 마비 이 T 세포, B 세포, monocytes의 opticospinal 침투와 연관 되었다. 직렬 opticospinal 일관성 단층 촬영 (OCT) 시연 동적 시각적 시스템 참여. AQP4 대상 CNS T 세포 중재 면역 (ATCA)와 쥐 마비 비주얼 시스템 부상에서 회복. EAE myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) p35-55-특정 T 세포에 의해 지속적인 임상 질병 이끌어 유도 달리 혼자 T 세포에 의해 유도 된 ATCA axonal 손실 또는 감소 망막 신경 절 세포 (RGCs)에 연결 되지 않았습니다. 우리의 결과 명확 하 게 여러 병원 성 AQP4 T 셀 결정 요인 다는 것을 설명 했다. ATCA의이 새로운 모델은 어떻게 셀 CNS 염증을 유발 하 고 어떻게 그들이 AQP4 특정 B 세포 및 NMO 병 인을 촉진 하는 항 체와 협력 수 학습 병원 성 AQP4 전용 T 세포의 개발을 제어 하는 메커니즘을 공부 하는 데 유용 .

현재 보고서에서 우리는 유도 하 고 T 세포 유도 ATCA를 평가 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 면역, T 세포 배양 및 Th17 분극 병원 성 AQP4 전용 T 세포, 양극 화 및 그 T 세포의 입양 전송 흐름 cytometry 분석 생성을 사용 하는 기법으로 시작 합니다. 우리는 다음 임상 및 조직학 질병 및 직렬 OCT 비주얼 시스템 부상을 받는 사람 마우스 모니터를 사용 하 여 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

모든 동물 절차는 캘리포니아 대학, 샌 프란 시스 코 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 실험 지침에 따라 수행 했다. C57BL/6 (H-2 b) 여성 쥐, 나이, 8 주 구입 했다 고 C57BL/6 AQP4 /- 생쥐 A. Verkman에 의해 제공 되었다.

1. AQP4 펩 티 드와 마우스의 면역

  1. 준비 완료 Freund ' s 보조 (CFA) 작업 사진.
    1. 잘게 갈아 M. 결핵 (H37Ra)는 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여의 desiccated 준비.
    2. 추가 지상 불완전 한 Freund에 H37Ra ' 4 mg/mL의 최종 농도에 s 보조. CFA는 4 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
  2. 디졸브 동결 건조 된 항 원 (Ag) AQP4 펩 티 드 1 mg/mL의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에. 또는 얼음에 4 ° C에서 유지
  3. CFA/펩타이드 에멀젼을 포함 하는 자 지와 합류 2 luer 잠금 주사기 조립 준비.
  4. 연결 유리 luer 잠금 주사기 플런저 3 방향 나일론 자 지 2 남성 luer 잠금 연결을 하지 않고
      . 주사기로 레버를 전환 하 여는 자 지를 닫습니다. 수 있도록 테스트 튜브로 주사기 주사기의 오픈 엔드 위치. 추가 안정성을 위한 튜브 랙에 배치.
    1. 소용돌이 CFA 일 재고 고 Ag 솔루션. 펩 티 드의 1:1 볼륨 추가 / 오픈 주사기에 CFA. CFA/Ag (50 µ L x 4)의 200 µ L가 마우스 당 필요.
      참고: 일반적으로, 준비의 약 1 mL 접종에 사용할 수 있는 금액을 줄일 것입니다 자 지에 손실 됩니다. 따라서, 그것은 필요한 총 볼륨의 계산에이 통합 하는 것이 중요.
      예: 5 마우스의 면역에 대 한: (200 µ L/동물 x 5 동물) + 1 mL 여분의 볼륨 = 총 CFA/Ag 필요한 2 mL.
    2. 는 주사기에 유리 플런저를 삽입 하 장소에서 그것을 잡고, 주사기를 반전 하는 자 지는 위로. 사용 하지 않는 여성 연결을 자 지 레버를 전환 합니다. 신중 하 게 주사기에서 초과 공기를 제거 하기 위해 유리 플런저에 압력을 적용 됩니다. 액체는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결 채웁니다.
    3. 는 자 지의 두 번째 남성 luer 잠금 연결을 두 번째 유리 주사기 (플런저 완전히 삽입)을 연결 합니다. 이 가능한 작은 초과 공기 포함 하는 자 지와 2 유리 주사기의 닫힌된 시스템 이어야 한다.
    4. 에멀젼, 만들을 통과 하는 액체 또는 약 2 분 약 10 분에 대 한 얼음에 주사기를 반복 하는 냉 기에 대 한 2 주사기 사이 재미 plungers를 추진 하 고 준비의 점도 분명 변화 될 때까지 혼합 하 여 혼합 아주 뻣 뻣 한, 화이트 에멀젼의 결과로. 4 ° C에서 유제를 포함 하는 주사기를 냉장 보관 또는 얼음에 유지
  5. 한 유리 luer 잠금 주사기 유제의 모든 전송, 빈 유리 주사기를 제거 하 고 1 mL luer 잠금 주사기 주입을 위해. 유제와 새로운 주사기를 채우기는 자 지에서 제거 하 고 연결 바늘 (25G x 5/8).
  6. " 물-테스트 " 일관성 에멀젼. 물을 작은 그릇에는 유화 액의 한 방울을 추방. 유제, 주입을 위해 적합 하다는 것을 나타내는 분산 하지 해야 합니다.
    1. 유제 분 광, 경우 그것은 주입에 대 한 준비, 전송 액체 유리에 다시 주사기와 혼합 하 고 유제는 뻣 뻣 한 때까지 다음 다시 진정 계속.
    2. 적절 한 일관성을 달성 때까지 유제를 다시 테스트.
  7. 기증자 AQP4 /- 생쥐를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나) AQP4 펩 티 드를 포함 하는 유제와. 각 마우스 4 x 50 µ L 사우스 캐롤라이나 주사 (200 µ L 총 (100 µ g 펩타이드))를 받습니다. 4 사이트 (LN) 사 타 구니 림프절으로 배수 하는, 더 낮은 복 부의 측 및 액 ln.로 배수 중간 각 겨드랑이 가슴 벽의 양쪽 모두를 포함 입양 전송 받는 사람 마우스 당 1-2 면역된 기증자 마우스 필요 합니다.

2. T 세포 배양 및 Proinflammatory T 세포 분극

  1. 예방 접종, 10-12 일 쥐에서 LN 수집.
    1. 아이스 트레이 준비 60mm 접시 셀 스 트레이너 (메쉬 크기 70 µ m)를 장착 하 고 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 냉장된 RPMI 미디어 및 100 U/mL 페니실린-100 µ g/mL 스 (펜-strep) (RFP) 포함.
    2. CO 2, 자 궁 경관 탈 구 다음에 노출에 의해 Euthanize 쥐. 70% 에탄올에 쥐를 담가 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀.
    3. 잘라 중간 피부 절 개는 사 타 구니에서 목에 각 다리. 복 막 떨어져 피부를 당겨 하 고 엄격 하 게 보드에 그것을 핀. 사 타 구니와 겨드랑이 LN을 해 부하 고 얼음에 RFP를 포함 하는 배양 접시 합니다. 19
    4. 입양 전송 실험, 같은 예방 접종 그룹 내에서 모든 동물에서 LN을 결합. Vβ 사용의 흐름 cytometric 분석, 개별 동물에서 LN 분리.
  2. RFP 포함 50 mL 원심 분리기 튜브에 LN을 포함 하는 셀 여과기를 놓습니다. 살 균 5 mL 주사기 플런저의 평면 끝을 사용 하 여 셀의 회복을 촉진 하는 RFP의 20-30 mL로 세척 여과기를 통해 LN 셀을 누릅니다. 문화에 대 한 때까지 처리를 통해 얼음에 LN 셀 유지.
  3. 세척은 두 번, centrifuging 393 x g 5 분 동안에. 두 번째 세척 후 T 세포 미디어 (TCM)에 선 셀 resuspend. 한 의학 포함 된 RPMI FBS, 292 µ g/mL L-글루타민, 110 µ g/mL 나트륨 pyruvate 그리고 55 μ M 2-mercaptoethanol 및 펜 strep 10% 열 비활성화. 일반적으로, 기증자 마우스 당 5 mL TCM의 볼륨 사용 됩니다.
  4. LN 셀을 계산합니다. 예상된 수확량은 약 3-6 10 7 선 세포 면역된 한 마우스 기증자 당 x. 3-4 x 10 마련해 6 확산 분석 결과 (아래 섹션 3 참조).
  5. 입양 전송 (6) 문화 편광 설정.
    1. 준비 5 x 10의 Th17 편광 문화 10 µ g/mL Ag, 20 ng/mL 재조합 마우스 인터 루 킨 (IL)-23와 함께 mL 당 6 LN 셀과 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 일리노이-6.
    2. 또는 Th1 분극에 대 한 준비 5 x 10의 문화 10 µ g/mL Ag와 mL 당 6 LN 셀 및 10 ng/mL 재조합 마우스 중에 IL-12.
    3. 12-잘 접시에 편광 문화 혼합의 당 2 mL (1 x 10 7 셀)을 추가합니다. 2-4 기증자 쥐에서 LN 셀 한 12-잘 접시를 채울 것입니다. 72 헤에 대 한 5% CO 2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 문화 유지
    4. 시각적으로 확인 48 h에 활성화를 위한 문화에 선 셀와 72 h. 활성 셀 광범위 한 클러스터를 형성할 것 이다 T 세포 크기, 더 pleomorphic 되 고 증가할 것 이다. 신진 대사 증가 오렌지에 복숭아에서 변경 미디어에서 pH의 저하 될 수 있습니다. PH는 미디어 노란색을 충분히 낮은 경우 추가 1 mL의 나머지 24 h. 셀에 독성을 방지 하기 위해 신선한 TCM
    5. 섹션 6 진행 입양 전송 편광 효율 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine descr로 확인할 수 있습니다.섹션 5에서 ibed.
  6. 문화 흐름 표면 Vβ 식 (제 4)의 cytometric 분석에 대 한 개별 마우스에서 LN을 사용 하 여 설정.
    1. 준비 5 x 10 6 10 µ g/mL 중에 Ag와 mL 당 LN 셀.
    2. 12-잘 접시에 잘 당 문화의 2 mL (1 x 10 7 셀)을 추가합니다. 문화는 10 일 동안 5% CO 2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 유지 되어야 합니다. 제 4 이동.

3. 확산 분석 결과

참고: 2.4 절에서에서 계속이.

  1. 준비 3-4 mL 튜브, 2 x 10에 선 셀의 TCM에 mL 당 6 셀.
  2. 부드럽게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 세포를 혼합 하 고 살 균 구 유에 다음 전송.
  3. 96 잘 라운드로 사용 잘 당 세포의 플레이트 100 µ L 멀티 채널 pipettor 하단 조직 배양 플레이트. 일반적으로, 4 Ag 농도 및 아무 Ag 참조 triplicate 테스트용 15 우물 판.
  4. 다양 한 농도에서 TCM, 일반적으로 80, 20, 5, 1, 0 µ g/mL (2 x 주식)에 대 한 Ag 희석. 40, 10, 2.5의 최종 농도 대 한 3 중에 각 농도의 100 µ L를 추가 합니다. 0.5와 0 µ g/mL 약 72 h 37 품 어 ° c.
    참고: 단계 3.5 3.7 통해 방사성 물질을 포함. 적절 한 사용, 모니터링 및 방사성 물질의 폐기 지휘 되어야 한다, 기관 및 정부 규정.
  5. 3 H 티 미 딘 일 재고 솔루션을 준비 (40 µCi/mL)으로 25 ml RPMI, 1 mCi 3 H 티 미 딘을 추가 하 고 저장이 4 ° C. 피펫으로 멸 균 여 물통으로 작업 솔루션의 0.5 mL.
  6. 추가 25 µ L 3 H 티 미 딘 (1 µCi) 잘 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 당. 추가 18 h 37에 대 한 품 어 ° c.
  7. 96 잘 셀 수확기를 사용 하 여 유리 필터 매트에 세포를 수확 하 고 70% 에탄올으로 씻어. 건조 후, 필터 매트 5 mL 섬광 액체와 플라스틱 샘플 봉지에 밀봉. 잘 사용 하 여 각 섬광 카운터에서 측정 방사능.

4. 세포 표면 TCR Vβ 식 Cytometry 분석 흐름

참고:이 섹션 2.6에서 계속 됩니다. 항 체 마우스 TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 및 5.2, 6, 7, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14, 그리고 17a TCR Vβ 식 테스트를 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다.

  1. TCR Vβ의 검색, 여러 번 pipetting으로 문화 판에서 T 세포를 꺼내 려 하 고 튜브 셀 전송.
  2. FACS 버퍼 (FB) 2 %FBS, 0.1% 나트륨 아 지 드, 2 mM EDTA PBS에 들어와 씻고.
  3. 1 x 10 5 3 x 10의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 전송 셀 잘 당 6 셀. 경우 전체 Vβ 패널 테스트 되 고, 셀 여러 우물 (한 잘 테스트 되 고 Vβ 당)에 배포 해야 합니다.
  4. 회 저 성 세포에 의해 노출 되는 무료 아민과 반응 하는 라이브/죽은 생존 염료로 착 색 하 여 흐름 cytometric 분석에서 죽은 세포를 제외 합니다. 제조 업체에 따라 ' 원심 분리 및 생존 염색 물의 resuspension s 지시. 절차를 착 색 하는 셀에 걸쳐 10-20 분에 대 한 얼음에 품 어, 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 얼음에 계속
  5. 후 부 화, 세척 접시 한번 FB에. TCR Vβ를 검출 하기 위하여 중단 CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 FB의 100 µ L에 셀 (RM4-5 복제)와 TCR Vβ. 얼음에 15-60 분 동안 품 어
  6. FB에 접시를 한 번 세척 하 고 4% paraformaldehyde PBS에 희석의 200 µ L을 추가 하 여 셀을 해결. 얼음에 20 분 동안 품 어. FB에 접시를 세척 하 고 cytometry 분석.

5. 세포내 Cytokine 생산에 대 한 Cytometric 분석 흐름

  1. (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 대 한 치료 단백질 수송 억제제 시 약 (예, GolgiPlug)의 1:1,000 희석와 T 세포 배양 TCM에 방지 하기 위해 IC 이전 4 h cytokine 분 비입니다. 그 당시, 단백질 생산을 유도 하기 위하여 50 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)와 500 ng/mL ionomycin T 세포 활성화.
  2. 문화의 37 ° C에서 4 h, 후 아래로, pipetting으로 문화 판에서 셀을 꺼내 려 하 고 원심 분리기 튜브 (15 또는 50 mL)에 전송.
  3. 세척 FB와 함께입니다. FB에 5 x 10 5 잘 당 3 x 10 6 세포의 밀도에서 V-하단 96 잘 접시에 셀 resuspend.
  4. 얼룩 세포 생존 능력 (단원 4.2) 위에서 설명한 대로 염료. 부 화 후 접시 한 번에 씻어 FB.
  5. 표면 마커 검출을 위한 항 체를 다음과 같은 추가:
    1. 표면 마커 검출, 100 µ L의 FB CD4에 대 한 항 체의 1: 100 희석을 포함 하는 셀을 일시 중단 (복제 RM4-5).
    2. 선택적으로 B220에 대 한 항 체를 포함 (30-F11 복제) 및 CD11b (복제 m 1/70) 1: 100 희석 및 monocytes/대 식 세포, B 세포의 각각 게이팅 개선에. 일반적으로, PE Cy7 안티-CD4, FITC 안티-B220 및 PerCP Cy5.5 안티-CD11b 잘 작동합니다. 형광 색소의 항 체 어원이 같은 말의 분석을 위해 사용 될 흐름 cytometer의 구성에 의해 유도 해야 하 고 항 체의 최적 농도 실험적으로 결정 되어야 합니다.
    3. 얼음에 15-60 분 동안 품 어
  6. FB와 함께 접시를 세척 하 고 얼음에 20 분에 대 한 고정/Permeabilization 솔루션의 200 µ L 셀 resuspend. 이 셀을 수정 하 고는 막 permeabilize.
  7. 세포내 얼룩 동안 세포 막의 permeabilization를 유지 하기 위해
  8. FB 대신 파 마/워시 버퍼 (비밀 번호) (10 X 재고에서 희석된 1:10)를 사용 합니다. 비밀 번호의 200 µ L에 웰 스 워시.
  9. ICS에 대 한 인터페론 (IFN)에 대 한 항 체의 1: 100 희석 준비-γ와 IL-17A 1을 사용 하 여 x PW. 하나의 옵션은 APC 안티-IFN-γ (클론 XMG1.2) 및 PE 안티-일리노이-17A (클론 eBio17B7) 잘 작동. 세포내 항 체 칵테일의 100 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 적어도 15 분 동안 품 어. 그것도 하룻밤 4에서 얼룩이 계속 ° c.
  10. PW의 200 µ L에서 우물과 FB에 물의 resuspension cytometry에 대 한 세척.
  11. 병렬로 감지기 전압, 및 각 개별 형광 색소 (즉, 셀 또는 하나의 항 체/형광 색소로 얼룩진 보상 구슬)에 대 한 단일 스테인드 샘플을 최적화 하는 흠 없는 샘플 (항 체 없이 FB에 셀)을 준비 보상 좀 값 결정.
  12. 취득 교류 cytometer 사용 하 여, ≥에 가능한 (라이브/죽은-부정) CD4 게이팅 10000 셀 (이벤트), + 세포. T 세포의 정확한 게이팅 되도록 제외는 B220 + 및 CD11b + 세포 (B 세포, monocytes/대 식 세포, 각각). CD4 내 + T 세포 부분 모집단, IFN-γ (Th1 혈통) 또는 IL-17A (Th17 계보)를 표현 하는 셀의 비율을 결정.

6. 입양 전송의 병원 성 AQP4 전용 T 세포

참고:이 단계 섹션에서 다음과 같습니다: T 세포 문화와 proinflammatory T 세포 분극.

  1. 복구를 꺼내, 아래로 pipetting 50 mL 튜브에 전송 하 여 12-잘 접시에서 셀 편광. Ma주사까지 얼음에 intain.
  2. 셀 계산, 차가운 PBS에 두 번 세척 하 고 정지 1 x 10 8 셀/mL PBS에 준비. 일반적으로, 셀 시간 이내 주사.
  3. 부드럽게 소용돌이 의해 세포를 혼합 하 고 1 mL 주사기에 주입 시 전송. 관리 (2 x 10 7) 셀의 200 µ L 정 맥 (i.v.) 꼬리를 통해 각 마우스 정 맥.
  4. 주사 200 각 받는 사람 마우스 i.p. B. 백 일 해 독 소의 ng에 그 날 그리고 2 일 후 200 µ L의 PBS에 희석. 임상 질병의 표시를 위해 매일 마우스 모니터.

7. 임상 평가 ATCA

CNS 면역의 임상 표시를 위해 매일
  1. 검사 받는 사람 마우스. 일반적으로 쥐 CNS 면역의 AQP4 전용 T 세포의 입양 전송 후 5-8 일 표시 됩니다. 쥐 신경 부전의 임상 증상이 나타납니다. 그것은 마우스의 정상적인 능력을 정의 하는 순진한 마우스에 평가 수행 하는 데 도움이.
  2. 평가 쥐 꼬리의 손실에 대 한 음색입니다. 꼬리의 기지에서 쥐를 부드럽게 잡고 고 똑바로 들어. 꼬리는 꼬리의 손실로 설명은 지속적으로 드 톤 (1의 점수). 꼬리의 손실은 종종 임상 질병의 첫번째 표시.
  3. 평평한 표면에 그것의 뒤에 마우스를 배치 하 여의
  4. 테스트 righting 반사 Truncal incoordination의 기호를은 느린 righting (2의 점수). 순진한 마우스 완전히 그래서 어떤 느려짐 오른쪽 능력에 역 기능으로 득점의 뒷면에 배치 하는 어떤 시도 저항할 것 이다. 일반적으로이 반사에 대 한 3-4 회 마우스 테스트.
  5. 평가 자세 그리고 ambulation입니다. 쥐 자세를 낮추는 결과로 또는 ambulation 동안 엉덩이의 드래그에 변화를 표시 하기 시작 (2.5의 점수). 또한 질병 결과 monoplegia, 한 뒷 다리의 완전 한 마비에에서 사지 (3.0의 점수) 및 하반신 마비, 두 뒷 다리의 전체 마비 사지 (3.5의 점수). 매우 느린 전진 운동에 온건한 quadraparesis, 모든 4 개의 사지의 약점 결과 (4의 점수). 심한 quadraparesis 수 거의 앞으로 운동 (4.5의 점수). 마지막으로, 심각한 질병을 가진 그들은 죽어가는 될 수도 (5의 점수) 죽을.
  6. 관리 마우스 또는 액체 또는 고체 식품 염 분 i.p. 포도 당 5%의 1 mL를 획득 하는 능력을 잃게 하는 액체로 사용 보충 탈수 및 음식 부족을 중화 컵, 높은 칼로리 젤과 베이컨 나왔던 젤. 죽어가는 쥐를 안락사.

8. 조직 준비 및 조직학

  1. 쥐 100 mg/kg 마 취 제와 10 mg/kg xylazine, Anesthetize 그리고 다음 해 부 보드에 각 노상 강도 핀.
  2. 열기는 가슴을 노출 마음. 혈액 유출 허용 하도록 간 incise 나비 바늘 PBS와 10% 포 르 말린에 대 한 별도 저수지를 사용 하 여 miniflow 변속 펌프의 튜브에 연결 합니다. 심장의 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 뒤에 10% 포 르 말린의 25 mL PBS의 5 mL와 함께 perfuse.
  3. 머리 그리고 눈을 제거합니다. 프로세스 눈과 망막 앞에서 설명한 20. 눈 소켓을 가로질러, 코에서가 위를 삽입 하 고 각 측면에 후부 앞쪽 두개골을 잘라.
    1. 두개골을 제거, 노출 시 신경, 시 chiasm 잘라내어 2 거품 패드 사이 카세트에.
    2. 담가 10% 포 르 말린 (24 시간), 그리고 다음 50% 에탄올 (24 시간)에 70% 에탄올으로 다음 전송.
  4. 뇌와 척추를 제거 하 고 10% 포 르 말린에. 직렬 섹션 두뇌 코로나 비행기; 섹션 척추 코드에 화살 (약 절반) 및 직렬 코로나 비행기 (마우스 당 약 20 횡단면).
  5. 정기적으로 파라핀 포함에 대 한 프로세스 CNS 샘플입니다. 되며 고 오신 (시 신경) 또는 Luxol 빠른 블루 hematoxylin와 오신 (뇌와 척수) 8 µ m 두꺼운 부분 얼룩.
  6. 시 신경 염증 신경 및 주변 meninges (광 신경 염) 또는 주로 주변 meninges (광섬유 perineuritis)의 존재에 대 한 평가.
  7. Meningeal parenchymal 염증 foci 계산 (> 10 클러스터 된 단 세포) 각 마우스에 대 한 뇌와 척수 샘플에.

9. Vivo에서 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 이미징 망막

참고: 쥐의 스펙트럼 도메인 10 월 망막 이미징 일관 된 눈을 달성 하기 위해 상용 장비 (예를 들어, TruTrack 눈 추적기 Spectralis)를 사용 하 여 수행 오리엔테이션 및 모션 아티팩트를 줄일.

  1. 이미징, 이전 5 분 1 %tropicamide (눈 당 한 방울)과 눈동자를 팽창 하 고 당 분 (1.5 %isoflurane) 2 리터의 지속적인 흐름을 제공 하는 마 취 유도 실에서 이미지를 마우스. 열 매트 설정 하 고 준비 후 마 취 회복 케이지.
  2. 이미징 실린더에 마우스 놓고 마 취 흐름을 따라 이동 합니다. 0.3% 여기 스 눈을 축축한 유지 하 고 굴절 연속성을 보장 하기 위해 눈을 보호 합니다. 눈 검사에 사용자 지정 콘택트 렌즈 배치.
  3. 적외선 저 이미지에 의해 유도 빔 중심 시 신경 머리에 보장 눈에 레이저를 직접. 수직 및 수평 10 월 검사 망막 레이저에 수직 레이아웃 확인 해야 합니다.
  4. 고해상도 모드와 30에서 래스터화 수행 25 B-스캔 평균 A-스캔.
  5. 후 이미징 두 눈, 콘택트 렌즈를 제거 하 고 안과 젤을 적용. 따뜻한 복구 장에 마우스를 둡니다.

10. 처리 및 10 월의 분석

  1. 이미징 소프트웨어 자동된 분할에 대 한 모듈을 사용 하 여.
    1. 수동으로 올바른 세그먼트 내부 제한 막 (ILM)와 내부 plexiform 레이어 (IPL)에 해당, 안쪽 망막의 한계를 나타내는 레이어를 (IRL) 21.
    2. 망막 신경 섬유 층 (RNFL) 신경 절 세포 층 (GCL)는 IRL의 한계 내에서 거주 하 고 오버랩 되지 않는 확인 하십시오.
  2. 계산 IRL 두께 1, 2, 및 3 m m 광학 디스크에 스프레드시트 파일에 수출 중심의 직경을 가진 초기 치료 당뇨병 성 망막 증 연구 (ETDRS) 2 그리드를 사용 하 여. 소프트웨어는 각 그리드 부문 평균 하 여 각 망막 층의 두께 계산 합니다. 따라서, 시 신경 머리에 해당 하는 중앙 세그먼트는 제외 됩니다.
  3. 각 시간 지점에서 그룹 간의 통계적 차이 분석합니다. 일반화 추정 방정식 교환 상관 관계 매트릭스와 내부 주제 간 눈 상관 관계 21에 대 한 조정을 사용 하 여 각 마우스에 대 한 양쪽 눈 분석.

Representative Results

이 프로토콜에서 우리는 C57BL/6 AQP4/- 생쥐에서 기증자 T 세포를 사용합니다. 병원 성 T 세포 epitopes를 포함 하는 AQP4 p135-153 또는 p201-220,이 쥐의 피하 접종 elicited 강한 증식 T 세포 응답 배출 림프절 (그림 1)에이 두 펩 티 드 훨씬 약한 T 세포를 유도 하는 반면 WT 쥐에서 확산입니다. 비교에서는, AQP4 p91-110와 예방 접종 비 병원 성 AQP4 T 셀 결정13또는 MOG p35-55, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)22,23 시키는 T 세포를 활성화 하는 수 초 펩 티 드를 포함 하 ,24, 유도에 AQP4-/- WT 쥐 T 세포 확산의 유사한 크기. 교류 cytometry 얼룩 TCR 사용률 분석 개별 Vβ 또는 Vβ, AQP4/- 생쥐에서 p135-153-및 p201-220-특정 T 세포 독특한 TCR 레파토리 활용 시연에 대 한. 선택적 하이퍼-확산 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐로 독특한 TCR 활용 (그림 2), AQP4의 이러한 결정에 대 한 병원 성 T 세포 응답은 일반적으로 thymic 네거티브에 의해 규제 표시 선택, AQP4-/- 기증자 T 셀이이 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 중요성을 강조.

ATCA의 유도 대 한 입양 전송 전에 림프절 세포 AQP4 펩 티 드 액 쥐에서 3 일 동안 Th17 또는 Th1 편광 조건에서 생체 외에서 경작 했다. 어느 정도 분극 기증자 CD4의+ T의 세포 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 확인 되었고 cytometry (그림 3)에 의해 측정. 순진한 받는 사람 마우스는 2 x 107 기증자 AQP4 펩 티 드 관련 T 세포와 정 맥 주입 했다. 약 6 일 후, 거의 100% 받는 사람 마우스의 개발 CNS 자가 면역 질환, 다리를 절 며 꼬리와 뒷 다리 마비 (그림 4)를 포함 하 여 임상 증상. Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 Th1 편광 AQP4 전용 T 세포 보다 더 심한 임상 질환을 유발. Th17 AQP4-펩 티 드-특정 받은 완전 한 뒷 다리 마비 (하반신 마비)를 개발 하는 대표적인 마우스 비디오 1에 표시 됩니다. MOG 특정 Th17 세포의 관리 후 EAE를 개발 하는 쥐와 받는 사람 마우스 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 임상 질병에서 회복. EAE MOG p35-55-특정 Th17 세포에 의해 유도 된에 관해서는 p135-153-특정 AQP4에 의해 유도 된 임상 질환 또는 p201-220-특정 Th17 세포 CNS 실질에서 meninges (그림 5) 단 세포의 침투와 관련 되었다. 병 변 더 AQP4 특정 Th17 세포에 의해 유도 된 CNS 면역에 대 한 실질에 보다 meninges에 풍부 했다.

조직학 평가 및 직렬 10 월 AQP4 관련 하 여 시 신경 관련 입증 되었다 고 집 고 양이 특정 Th17 세포 두 유도 시 신경 염증, 단 세포의 존재에 의해 특징 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 발생 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 유도 심각한 광학 신경 염 (그림 5). 직렬 OCT를 사용 하 여, 시 신경 염증 분명 불어서 고 AQP4 또는 MOG 특정 Th17 세포 (그림 6)에 의해 유도 된 임상 질환에 대 한 내 망막 층 (IRL) 두께 증가. AQP4 Th17 유도 CNS 면역에 대 한 쥐로 기준선을 반환 IRL 두께 임상 질병에서 회복. 반면, EAE MOG 특정 Th17에 의해 유도 된의 지 속성 대응 IRL 엷게 하 고, 살펴본 바와 같이 이전17, 망막 신경 절 세포의 감소와 관련 되었다.

Figure 1
그림 1 : AQP4/- 생쥐 하지만 하지 WT 쥐에서 강력한 T 세포 증식을 유도 하는 AQP4 p135-153, p201-220. 마우스 접종 했다 CFA에 표시 된 펩 티 드와 사우스 캐롤라이나. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 중 아무 항 원 또는 펩 티 드 면역에 대 한 사용을 경작 했다. 확산 3H 티 미 딘 법인 (평균 ± SEM, 5 실험의 대표)에 의해 측정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : AQP4/- 생쥐에서 AQP4 전용 T 세포 활용 독특한 TCR 레파토리. 표시 된 펩 티 드 AQP4-/- 와 WT 쥐 접종 했다. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작 했다. 세포를 수확 했다. TCR Vβ 사용률 cytometry에 의해 분석 되었다 (± sem의 의미 n = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 기증자 AQP4 전용 T 세포의 양극 화 Proinflammatory. 11 일 AQP4 p135-153 또는 p201-220, 예방 접종 후 림프절 세포 수확 되었고 비 편광 조건, Th1 또는 Th17 편광 조건에서에서 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작. Th17 Th1 분극 시험 되었다 IC 및 흐름 cytometry에 의해 IL-17 또는 IFN-γ, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 유도 WT 받는 사람 마우스 마비. WT 받는 사람 마우스 AQP4/- 생쥐에서 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p135-153 또는 p201-220-특정 T 세포를 받았다. Th17 편광 MOG 전용 T 세포 긍정적인 컨트롤로 제공 됩니다. 8 실험의 결과 (n = 5/그룹). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : AQP4 특정 Th17 세포 유도 WT 쥐에 opticospinal 염증. 받는 사람 마우스 2 x 107 기증자 Th17 AQP4 p135-153-또는 p201-220-액 Th17 세포 AQP4/- 생쥐에서 또는 Th17 MOG p35-55-특정 셀을 접수 하 고 10 일 후를 희생 했다. 척수와 시 신경 조직 준비 되었고 H로 얼룩진 & E/LFB 염증과 demyelination의 증거에 대 한 평가를각각. 결과 5 쥐/그룹의 대표입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 시 신경 염증 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 경도 망막 10 월에 의해 모니터링할 수 있습니다 WT 받는 사람 마우스 하루 0에 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p201-220-특정 또는 MOG p35-55-특정 T 세포를 받았다. 그들은 전날 0 (T 세포의 관리)에 10 월에 의해 시험 되었다 일에 다음 4, 7, 8, 9 10, 11 14 및 21. IRL 두께 측정된 (평균 ± SEM) 했다. 통계는 순진한 컨트롤과 비교를 나타냅니다. 결과 3 실험 (5 쥐/그룹)의 대표. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

AQP4는 20053NMO IgG에 주 대상으로 확인 되었습니다. 다음, 그것은 CNS autoimmunity의 AQP4 대상 동물 모델을 확립 하는 것이 중요 될 것 이라고 인정 받았다. 이러한 모델 AQP4 전용 T와 B 세포 CNS autoimmunity의 개발에 참여 하는 방법을 조사 하 고 후보 치료제 NMO 테스트 유용할 수 있었다. 비록 야생-타입 마우스에서 epitopes 201013, 그 epitopes에 응답 하는 T 세포에에서 처음 알려졌다 AQP4 전용 T 세포의 임상 또는 조직학 질병14,17를 일으키지 않았습니다. CNS 면역 면역 반응성 AQP4 기반으로 모델을 생성 하는 무 능력 2015 때까지 수수께끼에 남아 있었다 존스, 외. 25 AQP4/- 생쥐에서 기증자 AQP4 p135 153 준비 하는 T 세포 WT 쥐에서 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 징후를 일으키는 수 있었다 발견 했다. 관심의 높은 선호도17와 MHC II (-Ab)을 바인딩할 AQP4 p135-153 전망 이다. 단 하나의 다른 AQP4 아미노산 시퀀스, 201-220-Ab 비슷한 높은 선호도 바인딩할 전망 이다. 사실, 우리 p201-220 두 AQP4-/-, 하지만 WT 쥐에서 강력한 확산 유도 그 AQP4 p135-153를 관찰. 여기, 우리가 어떻게 분리 수 있고 확장 encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153-및 p201-220-반응 T 세포 AQP4/- 생쥐에서 나타났습니다. WT 받는 쥐로 전송 하는 경우 기증자 AQP4 반응 Th17 세포 유도 마비, 척수와 시 신경에 단 세포 침투를 동행 했다. 성의 비주얼 시스템 부상 AQP4 seropositive NMOSD26를 가진 환자에서 잘 알려져 있다. 여기, 우리는 AQP4-반응성 고 집 고 양이 반응 Th17 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증은 뚜렷한 관찰 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 유도 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 심각한 광학 신경 염 유발. 우리는 또한 직렬 10 월 AQP4 및 MOG 전용 T 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증을 모니터링 하는 데 사용 하는 기법을 설명 했습니다. 다른 수 사관은 지금 ATCA의 병원 성 기계 장치에 집중 하는 그들의 자신의 연구를 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있어야 합니다.

하나는 쉽게 우리의 프로토콜에 3 개의 잠재적인 함정을 피할 수 있습니다. ATCA의 첫 번째, 입양 전송 AQP4-/- 기증자 쥐에서 AQP4 전용 T 세포의 사용을 요구 한다. 특히, 기증자 WT AQP4 p135-153-특정 T 세포 받는 WT 쥐 ATCA를 일으키지 않았습니다. 둘째, 그것은 "물-테스트" AQP4/- 생쥐 (프로토콜 단계 1.5)의 예방 접종 전에 펩 티 드/CFA 에멀젼 방울과 함께 수행 하는 것이 중요. 그것은 사우스 캐롤라이나 사출에 적합 때 유제 물에 분산 하지 해야. 유제 분 광 경우 하나 한 번 더 유제를 혼합 해야 다시 진정 고 물-테스트를 반복 합니다. 마지막으로, 활성화 된 기증자 CNS 항 원 특정 T 세포는 T 세포 휴식 보다 더 효율적으로 CNS 면역 유도. 하나는 시각적으로 입양 전송 위한 기증자 T 세포를 수확 전에 가벼운 현미경 그 문화를 검사 해야 합니다. 급속 하 게 세포 분할 클러스터, 쉽게 확인 양식 수 있습니다. 또한 때 많은 활성화 된 T 세포를 포함 하는 문화, 미디어 수 있습니다에서 전환 핑크 오렌지 또는 황색, ph에서 감소 때문. 프로토콜 단계 3에서 설명한 대로 하나 또한 확산에 대 한 기증자 림프절 AQP4 준비 하는 T 세포의 활성화 3H 티 미 딘 법인에 의해 평가할 수 있습니다.

두 개의 병원 성 AQP4 T 셀 epitopes는 (1) 예측 높은 선호도와 MHC II를 바인딩할 및 (2) AQP4-/-, 하지만 하지 WT에 강력한 증식 응답을 이끌어내는 우리의 발견, 쥐 그 결정을 대상으로 하는 T 세포는 일반적으로 제안 thymic 부정적인 선택17에 의해 제어. AQP4 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐에서의 인식에 대 한 활용 TCR 레파토리는 독특한 (그림 2),이 클론 삭제 thymic 골 수 상피 세포에 의해 중재와 일치. 다른 tolerogenic 메커니즘 수 있습니다 일반적으로 AQP4에 대 한 면역 응답을 제 지. 우리의 초기 보고서17, 이후에 다른 그룹도 시연 했다 AQP4 p201-220 encephalitogenic T 셀 결정27포함 되어 있습니다. 때 α/β (TCRα-/-) T 세포 결핍 마우스 AQP4-/- CD4 재구성 했다+ T 셀, encephalitogenic AQP4 전용 T 세포 응답, 하지만 하지는 AQP4 특정 체액 반응, 그 암시를 이끌어내는 것이 가능 했다 WT 쥐 AQP4 특정 B 세포 응답, AQP4 전용 T 세포 응답, 비슷한 부정적인 선택 될 수 있습니다. 사실, 혼자 AQP4 전용 T 세포에 의해 유도 된 ATCA WT 쥐에서 관찰 하지는, 척추 축 삭 및 RGCs, 손실 병원 성 AQP4 특정 항 체의 참여를 요구할 수 있습니다. 그것은 분명 AQP4 대상 CNS autoimmunity의 마우스 모델 tolerogenic 메커니즘을 일반적으로 AQP4 전용 T 세포 및 B 세포 면역 제어에 대 한 자세한 내용은 진화를 계속 하는 것입니다.

AQP4 대상 CNS 면역의 다른 모델도 되 고 개발된6,16,,2829,30. 각자 공부 NMO 병 인에 관련 된 특정 측면에 대 한 장점을 제공할 수 있습니다. AQP4 전용 T 세포 WT 쥐6,,1629에서 확인 되었습니다. 그 AQP4 전용 T 세포 발생의 CNS 면역 조직학 변화 하지만, 마찬가지로 쥐에서 관찰, WT 쥐 AQP4 전용 T 세포 발생 하지 않습니다 임상 질병의 중요 한 표시. 따라서, WT 쥐의 T 세포와 B 세포 AQP4 특정 면역 응답을 제한 하는 허용의 메커니즘은 쥐에서 작동도. 관계 없이, 하나 해야 마우스 모델을 사용 하 여 질병의 병 인에 관여 하는 메커니즘을 공부에 전력을 과소 평가 하지. 녹아웃, 유전자 변형 및 기자 쥐의 부 유리할 수 있습니다. 그것은 또한 몇 가지 기본적인 발견 면역 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 만들어진 인식 되어야 한다. 예를 들어 데모 그 T 세포 클론 자가 항 원에 대 한 특정 면역 질환31,32,33 면역에서 T 세포 costimulation의 역할 및의 발견을 중재할 수는 Th17 차별화34 에 대 한 개발 통로 처음 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 설명 했다. 우리가 개발한 ATCA의 마우스 모델을 사용 하 여, 하나 지금가지고 연구 개발 및 병원 성 AQP4 특정 면역 응답을 vivo에서의 규제 수단 NMO 병 인에 관련 된 중요 한 통찰력을 제공 한다.

Disclosures

소화기 세 이건, A. 크루즈-Herranz, 입방 미터 스펜서, 피 호, L. Steinman,이 그린, 그리고 R.A. 소블 아무 공개 보고. S.S. Zamvil 신경과, Neuroimmunology 및 Neuroinflammation의 부 편집장 이며 Neuroimmunology의 국제 사회에 대 한 자문 위원회의 회원입니다. 그는 임상 조사 저널, 면역학의 저널신경 과학의 저널의편집 위원회에 봉사 했다 그리고 국가 기관에 대 한 부여 검토 위원회의 위원 되었습니다. 건강 (NIH) 임상 Neuroimmunology 및 뇌 종양 (CNBT)의 연구 섹션와 국가 다 발성 경화 증 사회 (NMSS). 그는 컨설턴트를 역임 및 honoraria 바이오 젠 Idec, EMD-세로 노, Genzyme, 노바 티 스, 로슈/Genentech, Teva 제약, 주식 회사, 그리고 봉사 했다 또는 릴리, BioMS, Teva 및 Opexa 치료제에 대 한 데이터 안전 모니터링 보드에 제공. 현재, 박사 Zamvil NIH, NMSS, Maisin 재단, 바이오 젠 및 Celgene에서 연구 보조금 지원을 받습니다.

Acknowledgements

지원 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG 4768, RG 5179 및 RG 5180), Maisin 재단 및 Guthy 잭슨 자선 재단은 건강의 국립 연구소 (RO1 AI073737와 RO1 NS092835-01)에 의해 S.S.Z.를 제공 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

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References

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