Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación parálisis y opticospinal por la transferencia de la Acuaporina-4 (AQP4)-células de T específicas de AQP4 ratones- / - en ratones WT. Además, se demuestra cómo utilizar la tomografía de coherencia óptica serial para controlar la disfunción del sistema visual.

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Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

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Abstract

Si bien se reconoce que Acuaporina-4 (AQP4)-anticuerpos y células T específicas participan en la patogenia de la Neuromielitis óptica (NMO), una enfermedad desmielinizante autoinmune humana del sistema nervioso central (SNC), creación de un modelo objetivo de AQP4 con ambos manifestaciones clínicas e histologic de la autoinmunidad de la CNS ha demostrado ser un reto. Inmunización de ratones de tipo salvaje (WT) con péptidos de AQP4 produce proliferación de células T, aunque esas células de T no podían transferir la enfermedad a ratones receptores ingenuos. Recientemente, novela dos epítopos de células T de AQP4, péptido (p) 135-153 p201-220, se identificaron y al estudiar las respuestas inmunitarias de AQP4 en ratones deficientes de AQP4 (AQP4- / -), sugiriendo la reactividad de células T a estos epitopos es normalmente controlada por Timo selección negativa. AQP4- / - Th17 polarizado células T cebadas p135-153 o p201-220 inducido parálisis en receptoras ratones WT, que se asoció con predominante leptomeningeal inflamación de la médula espinal y nervios ópticos. Inflamación circundante los nervios ópticos y la participación de las capas retinianas internas (IRL) se manifiestan por cambios en la tomografía de coherencia óptica serial (OCT). Aquí, nos ilustran los enfoques utilizados para crear este nuevo modelo en vivo de la autoinmunidad de la CNS dirigido AQP4 (ATCA), que ahora puede ser empleada para estudiar mecanismos que permitan el desarrollo de patógenas células T específicas de AQP4 y cómo puede cooperar con B células en la patogénesis de la NMO.

Introduction

Neuromielitis óptica (NMO) es una enfermedad desmielinizante inflamatoria autoinmune de sistema nervioso central (SNC) que causa episodios recurrentes de parálisis y pérdida de la visión lleva a discapacidad neurológica permanente1. NMO es considerado sobre todo al ser una enfermedad autoinmune humoral2 se asocia con anticuerpos (Igs) contra Acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua que se expresa abundantemente en los astrocitos3,4. Sin embargo, la inflamación del CNS es un prerrequisito para la entrada del CNS de AQP4 Ig5,6. Por lo tanto, no ha sido posible establecer un modelo de NMO por la transferencia de anti-AQP4 Igs solamente. Las conclusiones que (1) patógenos Igs específicas de AQP4 en pacientes NMO son IgG11,2, un Ig de dependiente de la célula de T en NMO lesiones8,9 (3) NMO se identifican células de T de subclase7 (2) se asocia con ciertos genes de MHC II (por ejemplo, HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10y proinflamatorias (4) Dr. AQP4 reactiva-Th17 restringida que las células se expanden en la NMO pacientes11,12 todos indican que las células T específicas de AQP4 tienen un papel clave en la patogenia de la NMO. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos animales para determinar cómo las células T específicas de AQP4 pueden contribuir a la patogenesia NMO.

Hace varios años, se identificaron múltiples epitopos de células T de AQP4 en wild-type (WT) ratones13,14 y ratas15. Mientras que se observó que las células T reactivas con AQP4 podrían inducir inflamación opticospinal en ingenuo receptor ratas15,16, no se observaron signos clínicos significativos de la enfermedad del CNS. Del mismo modo, dirigir la inmunización de los ratones WT con los péptidos que contienen AQP4 T célula epitopos14,17, o transferencia de células proinflamatorias T dirigidas a los determinantes17, no provocó signos clínicos o histologic evidencia de autoinmunidad de la CNS.

Recientemente, se observó que inmunización de ratones C57BL/6 AQP4-deficientes (AQP4- / -) con AQP4 péptido (p) 135-153 o p201-220, dos determinantes predijo a MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad18, sacó fuerte CD4 + De las respuestas de células T17. Por el contrario, estos dos péptidos produce solamente modestas respuestas proliferativas en ratones WT. Además, el repertorio de T cell receptor (TCR) utilizado para el reconocimiento de estos determinantes por las células T de ratones- / - AQP4 era único. Colectivamente, estos resultados indican que la célula de T reconocimiento de AQP4 es regulada por tímica selección negativa. AQP4 p135-153-p201-220-específicos o células Th17 de AQP4- / - ratones donantes inducida por parálisis en casi el 100% de ratones de peso receptoras ingenuo; Esto se asoció con opticospinal infiltrados de células T, linfocitos B y monocitos. Serie opticospinal tomografía de la coherencia (OCT) demostró la implicación del sistema visual dinámico. Ratones con autoinmunidad mediada por células T dirigida AQP4 CNS (ATCA) se recuperaron de la parálisis y lesión del sistema visual. En contraste con EAE inducida por myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG) p35-55-linfocitos T específicos, que condujo a la enfermedad clínica persistente, ATCA inducida por las células T sólo no se asoció con pérdida axonal o la reducción en las células ganglionares de la retina (RGCs). Nuestros resultados han demostrado claramente que hay determinantes patógenos múltiples de la célula T de AQP4. Este nuevo modelo de ATCA es útil para el estudio de mecanismos que controlan el desarrollo de patógenas específicos de AQP4 las células T, aprendiendo cómo las células inducen inflamación del CNS y cómo puede cooperar con las células B específicas de AQP4 y anticuerpos para promover la patogenesia de la NMO .

En el presente informe, se describen los protocolos utilizados para inducir y evaluar inducida por células T ATCA. Comenzamos con las técnicas utilizadas para que inmunización, cultivo de células de T y polarización Th17 para generar patógenas células T específicos de AQP4, análisis de citometría de flujo para confirmar la polarización y transferencia adoptiva de las células T. A continuación describimos los métodos utilizados para evaluar enfermedad clínica e histologic y el uso de OCT serial para controlar lesiones del sistema visual en los ratones receptores.

Protocol

animal todos los procedimientos fueron realizados en cumplimiento de directrices experimentales aprobadas por la Universidad de California, San Francisco institucional Animal cuidado y uso. Ratones hembra C57BL/6 (H-2 b), 8 semanas de edad, fueron comprados y AQP4 C57BL/6 - / - ratones fueron proporcionadas por A. Verkman.

1. inmunización de ratones con péptidos de AQP4

  1. preparación de Freund completo ' bolsa de trabajo de ayudante (CFA) s.
    1. Moler finamente un preparado deshidratado de M. tuberculosis (H37Ra) utilizando un mortero y una maja.
    2. Agregar tierra H37Ra a Freund incompleto ' adyuvante s a una concentración final de 4 mg/mL. CFA puede almacenarse a 4 ° C hasta por 6 meses.
  2. Disolver liofilizado péptido de AQP4 antígeno (Ag) en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración final de 1 mg/mL. Mantener a 4 ° C o en hielo.
  3. Preparar el montaje de 2 jeringas luer-lock, con una llave de paso, que contiene la emulsión CFA/péptido.
    1. Acople una jeringa luer-lock de cristal sin émbolo a una llave de paso de nylon de 3 vías con 2 conexiones luer-lock macho. Cerrar la llave de paso cambiando la palanca hacia la jeringa. Coloque el extremo abierto de la jeringa hacia arriba, permitiendo que la jeringa como un tubo de ensayo. Esto coloca en un bastidor de tubo para mayor estabilidad.
    2. Bolsa de trabajo
    3. vortex el CFA y la solución de Ag. Añadir un volumen de 1:1 del péptido / CFA a la jeringa abierta. 200 μL de CFA/Ag (4 x 50 μL) se requiere mouse.
      Nota: Normalmente, se pierde aproximadamente 1 mL de la preparación en la llave de paso, que reduce la cantidad disponible para la inmunización. Por lo tanto, es importante incorporar esto en el cálculo del volumen total requerido.
      Ejemplo: para la inmunización de 5 ratones: (animales de 200 μL/animal x 5) + 1 mL volumen extra = 2 mL total CFA/Ag necesario.
    4. Inserte el émbolo de vidrio en la jeringa y manteniendo en su lugar, invierta la jeringa para que la llave de paso está orientado hacia arriba. Interruptor de la palanca de llave de paso para el conector hembra. Con cuidado presionar el émbolo de vidrio para eliminar el exceso de aire de la jeringa. El líquido llena la segunda conexión luer-lock macho de la llave de paso.
    5. Acople una jeringa de vidrio de segunda (émbolo insertado completamente) la segunda conexión luer-lock macho de la llave de paso. Esto debe ser un sistema cerrado de 2 jeringas de vidrio conectado con una llave de paso que contengan como poco exceso de aire posible.
    6. Para crear una emulsión, mezcla empujando los émbolos para pasar el líquido alternativamente entre las 2 jeringas por unos 2 minutos Chill las jeringuillas en el hielo durante unos 10 minutos repetición el enfriamiento y mezcla hasta que haya un claro cambio en la viscosidad de la preparación , dando como resultado una emulsión blanca, muy dura. Refrigere las jeringas que contiene la emulsión a 4 ° C o mantener en hielo.
  4. Transferencia de la emulsión en jeringa de luer-lock de un vaso, retire la jeringuilla de cristal vacía y reemplazarla con una jeringa de luer-lock de 1 mL para la inyección. Llene la jeringa nuevo con emulsión, sacar de la llave de paso y conecte una aguja (25 x 5/8).
  5. " prueba de agua " la emulsión para la consistencia. Vierta una gota de la emulsión en un plato pequeño de agua. La emulsión no debe dispersarse, lo que indica que es conveniente para la inyección.
    1. Si la emulsión se dispersa, no está listo para la inyección, transferencia el líquido nuevamente en el vidrio jeringas y continuar mezclar y luego enfriar otra vez hasta que la emulsión quede tiesa.
    2. Prueba la emulsión otra vez hasta conseguir la consistencia adecuada.
  6. Ratones - / - donantes AQP4 inyectar en forma subcutánea (s.c.) con emulsión que contiene el péptido de AQP4. Cada ratón recibe inyecciones de 4 x 50 μl s.c. (200 μL total (100 μg péptido)). Los 4 sitios incluyen ambos lados del abdomen inferior, que drenan en los ganglios linfáticos inguinales (LN), y ambos lados de la pared torácica medial a cada axila que drenan en LN. axilar La transferencia adoptiva requiere 1-2 ratones de donantes inmunizados por ratón receptor.

2. Cultivo de células de T y T Proinflammatory polarización de la célula

  1. 10-12 días después de la inmunización, recoger LN de los ratones.
    1. En una bandeja de hielo, preparar platos de Petri 60 mm equipado con un filtro de la célula (malla tamaño 70 μm) y que contiene fríos medios RPMI con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 100 U/mL penicilina-100 μg/mL estreptomicina (pen-strep) (RFPS).
    2. Euthanize ratones por la exposición al CO 2, seguido por dislocación cervical. Sumerja los ratones en etanol al 70% y luego prender cada bandolero a una tabla de disección.
    3. Cortar una incisión del midline en la piel de la ingle hasta el cuello y abajo de cada pierna. Tire de la piel lejos del peritoneo y pin tenso a la Junta. Disección inguinal y axilar LN y colocar en la placa Petri que contiene RFP, en hielo. 19
    4. para experimentos de transferencia adoptiva, combinar LN de animales dentro del mismo grupo de inmunización. Para análisis de citometría de flujo de uso Vβ, separar LN de determinados animales.
  2. Colocar el filtro de la celda que contiene el LN en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene RFPS. Utilice el extremo plano de un émbolo de la jeringa estéril de 5 mL para las células de LN por colador, se lava con 20-30 mL de RFP para facilitar la recuperación de las células. Mantener las células de la LN en el hielo durante todo el proceso hasta el momento de la cultura.
  3. Lavado dos veces, centrifugando a 393 x g durante 5 minutos. Después del segundo lavado, resuspender las células LN en medios de comunicación de la célula de T (TCM). TCM contiene RPMI con 10% FBS, 292 μg/mL de L-glutamina, 110 μg/mL sodio piruvato y 55 μm 2-Mercaptoetanol y pen-strep inactivadas por calor. Normalmente, se utiliza un volumen de 5 mL TCM por ratón donante.
  4. Contar las células de la LN. Rendimiento esperado es aproximadamente 3-6 x 10 células de 7 LN por donantes del ratón inmunizado. Reservar 3-4 x 10 6 para un ensayo de proliferación (véase la sección 3 más abajo).
  5. Configurar polarizante culturas para transferencia adoptiva (sección 6).
    1. Preparar una cultura polarización Th17 de 5 x 10 6 LN células / mL con 10 μg/mL Ag, 20 ng/mL ratón recombinante interleukin (IL) -23 y IL-6 en TCM del ratón 10 recombinante ng/mL.
    2. Alternativamente, para la polarización Th1, preparar un cultivo de 5 x 10 6 LN células / mL con 10 μg/mL de Ag y recombinante ng/mL 10 ratón IL-12 en la MTC.
    3. Añadir 2 mL (1 x 10 7 células) por el bien de la mezcla de cultura polarizante en una placa de 12 pozos. Las células de LN de ratones donantes de 2-4 llenarán una placa de 12 pozos. Mantener las culturas en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO 2 para 72 h.
    4. Revise las celdas de la LN en cultura para la activación a las 48 h y 72 h. activado células formarán racimos extensos y las células T aumenta de tamaño, cada vez más pleomórfico. El aumento en el metabolismo puede causar una disminución del pH en los medios de comunicación, cambiando de durazno a la naranja. Si el pH es suficientemente bajo como para los medios de comunicación se ponen amarillas, añadir 1 mL de TCM fresco para evitar toxicidad a las células en los restantes 24 h.
    5. Proceder a la sección 6 para la transferencia adoptiva. Eficiencia de la polarización puede ser verificada por citoquinas intracelulares (ICS), la coloración como descrIBED en la sección 5.
  6. Configurar culturas usando LN de ratones individuales para el análisis cytometric del flujo de la expresión superficial de Vβ (sección 4).
    1. Preparar 5 x 10 6 células de LN por mL con Ag en TCM de 10 μg/mL.
    2. Añadir 2 mL (1 x 10 7 células) de la cultura por pozo en una placa de 12 pozos. Culturas deben mantenerse en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO 2 durante 10 días. Proceder a la sección 4.

3. Ensayo de proliferación

Nota: esto continúa desde el punto 2.4.

  1. Preparar 3-4 mL de células de la LN en un tubo, en 2 x 10 6 células / mL en la MTC.
  2. Mezclar suavemente las células invirtiendo el tubo varias veces y luego se transfieren a una estéril a través de.
  3. Placa de cultivo de tejidos de inferior
  4. uso una pipeta multicanal para placa 100 μl de células por pocillo en una ronda de 96 pocillos. Por lo general, la placa de 15 pozos para la prueba por triplicado de 4 concentraciones de Ag y no referencia Ag.
  5. Diluir el Ag en TCM a diferentes concentraciones, por lo general 80, 20, 5, 1 y 0 μg/mL (existencias de x 2). Añada 100 μl de cada concentración por triplicado para una concentración final de 40, 10, 2.5. 0,5 y 0 μg/mL. Incuban durante aproximadamente 72 h a 37 ° C.
    Nota: medidas 3.5 a 3.7 implican materiales radiactivos. El uso adecuado, control y eliminación de materiales radiactivos deben realizarse, según los reglamentos institucionales y gubernamentales.
  6. Preparar una solución stock de trabajo de 3 H-timidina (40 μCi/mL) por adición de 1 mCi 3 H-timidina a 25 mL RPMI y guarde en 4 ° C. Pipetear 0.5 mL de la solución en una cubeta estéril.
  7. Añadir 25 μl 3 H-timidina (1 μCi) por pocillo con una pipeta multicanal. Incubar un adicional 18 h a 37 ° C.
  8. Cosechar células sobre una estera de filtro de vidrio utilizando una cosechadora celular de 96 pozos y enjuagar con etanol al 70%. Después del secado, sello de la estera del filtro en una bolsa de plástico de la muestra con líquido de centelleo de 5 mL. Radioactividad medida en cada pocillo con un contador de centelleo.

4. Flow Cytometry análisis de la expresión célula superficie TCR Vβ

Nota: esto sigue de la sección 2.6. Anticuerpos de ratón TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 y 5.2, 6, 7, 8.1 y 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 y 17a están disponibles comercialmente para las pruebas de la expresión de TCR Vβ.

  1. Para la detección de TCR Vβ, desalojar las células de T de la placa de cultivo mediante pipeteo varias veces y transferir las células a un tubo de.
  2. De lavado con tampón FACS (FB) que contiene 2% FBS, 0.1% de azida sódica y EDTA en PBS de 2 mM.
  3. Las células de transferencia a una placa de 96 V-inferior-bien en una densidad de 1 x 10 5 a 3 x 10 6 células por pocillo. Si todo el panel Vβ está siendo probado, las celdas deberían distribuirse en varios pozos (uno bien por Vβ ensayada).
  4. Excluir las células muertas de análisis cytometric del flujo mediante tinción con un colorante de viabilidad de vivos o muertos, que reacciona con las aminas libres expuestas por las células necróticas. Siga el fabricante ' instrucciones para la centrifugación y resuspensión en tinte de viabilidad. Incubar en hielo durante 10-20 minutos a lo largo de la célula procedimientos de tinción, proteger a las células de la luz y mantener en hielo.
  5. Después de la incubación, lavar la placa una vez en FB. Para detectar el TCR Vβ, suspender las células en 100 μl de FB que contiene una dilución 1: 100 de anticuerpos para CD4 (clon RM4-5) y TCR Vβ. Incube durante 15-60 min en hielo.
  6. Lavar la placa una vez en FB y fijar las células mediante la adición de 200 μL de paraformaldehído al 4% diluido en PBS. Incubar por 20 min en hielo. Lave la placa en FB y analizar mediante citometría de flujo.

5. Flujo cytometric del análisis para la producción de citocinas intracelulares

  1. para cytokine intracelular tinción (ICS), tratar las culturas de célula de T con una dilución de 1:1,000 del reactivo de proteína transporte inhibidor (por ejemplo, GolgiPlug) en TCM, 4 h antes de ICS para evitar secreción de citoquinas. En aquel momento, activar las células T con 50 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y 500 ng/mL ionomycin para inducir la producción de proteínas.
  2. Después de 4 h de cultivo a 37 ° C, desalojar las células de la placa de cultivo mediante pipeteo arriba y abajo y transferir a un tubo de centrífuga (15 o 50 mL).
  3. Lavado con FB. Resuspender las células en FB y transferencia a una placa de 96 V-inferior-bien en una densidad de 5 x 10 5 3 x 10 6 células por pocillo.
  4. Tinción de las células con tinte de viabilidad como se describió anteriormente (sección 4.2). Después de la incubación, lavar la placa una vez en FB.
  5. Añadir anticuerpos para detección de marcadores de superficie como sigue:
    1. para la detección de marcadores de superficie, suspender las células en 100 μl de FB que contiene una dilución 1: 100 del anticuerpo para CD4 (clon RM4-5).
    2. Opcionalmente, incluir anticuerpos para B220 (clon 30-F11) y CD11b (clon M1/70) a una dilución 1: 100 para mejorar el control de las células de B y monocitos/macrófagos, respectivamente. En general, PE-Cy7 anti-CD4, anti-B220 FITC y PerCP-Cy5.5 anti-CD11b funcionan bien. Elección de los conjugados de anticuerpos/fluorocromo debe guiarse por configuración de citómetro de flujo utilizado para el análisis y concentración óptima de anticuerpos debe determinarse empíricamente.
    3. Incube durante 15-60 min en hielo.
  6. Lavar la placa con FB y resuspender las células en 200 μL de solución de fijación/permeabilización por 20 min en hielo. Esto fijar las células y permeabilizar las membranas.
  7. Para mantener la permeabilización de las membranas celulares durante la tinción intracelular, utilizar el tampón de Perm/lavado (PW) (diluido 1:10 del stock de X 10) en lugar de FB. Lavar los pozos de 200 μL de PW.
  8. Para ICS, preparar una dilución 1: 100 de los anticuerpos para el interferón (IFN)-γ y la IL-17A con 1 x PW. Una opción es APC anti-IFN-γ (clon XMG1.2) y PE anti-IL-17A (clon eBio17B7) que funciona bien. Resuspender las células en 100 μl del anticuerpo intracelular cóctel y luego incubar durante al menos 15 minutos. También es posible seguir la tinción durante la noche a 4 ° C.
  9. Lavar los pozos de 200 μL de PW y resuspensión en FB para citometría de flujo.
  10. En paralelo, preparan una muestra sin manchas (células en FB sin anticuerpos) para optimizar los voltajes del detector y manchado solo muestras para cada fluorocromo individual (es decir, las células o cuentas de compensación teñidas con anticuerpos sola/fluorocromo) a determinar valores de derrame compensación.
  11. Usando un citómetro de flujo, adquirir ≥ 10.000 células (eventos), que bloquean en viables (vivos/muertos-negativo) CD4 + las células. Para asegurar la sincronización exacta de las células T, excluir el B220 + y CD11b + las células (linfocitos B y monocitos/macrófagos, respectivamente). En el CD4 + T célula subpoblación, determinar el porcentaje de células que expresan IFN-γ (Th1 linaje) o IL-17A (linaje Th17).

6. Células de transferencia de patógenos específicos de AQP4 T adoptivas

Nota: este paso sigue de sección 2.5: polarización de la célula de T cultura y proinflamatorias T cell.

  1. Recuperar polarizado células de las placas 12-bien por pipeteo arriba y abajo para desplazar y transferirlos a un tubo de 50 mL. MAintain en hielo hasta inyecciones.
  2. Contar las células, Lave dos veces en PBS frío y preparar una suspensión de 1 x 10 8 células/mL en PBS. En general, inyectar las células dentro de la hora.
  3. Suavemente las células se mezclan agitando y transferir a una jeringa de 1 mL en el momento de la inyección. Administrar 200 μL de células (2 x 10 7) por vía intravenosa (i.v.) a cada ratón, a través de la cola vena.
  4. Inyectar cada ratón receptor i.p. con 200 ng de B. pertussis toxina diluida en 200 μL de PBS ese día y 2 días más adelante. Controlar ratones diariamente para detectar signos de enfermedad clínica.

7. Evaluación clínica de ATCA

ratones receptores
  1. Examine diariamente para signos clínicos de autoinmunidad de la CNS. En general, ratones mostrará signos de autoinmunidad CNS 5-8 días después de la transferencia adoptiva de células T específicas de AQP4. Los ratones muestran síntomas clínicos de disfunción neurológica. Es útil realizar las evaluaciones en un ingenuo ratón para definir la capacidad normal de un ratón.
  2. Tono de
  3. evaluar ratones para la pérdida de la cola. Mantener los ratones suavemente en la base de la cola y elevación vertical. Una cola que cae continuamente se describe como la pérdida de la cola de tono (grado 1). Pérdida del tono de la cola es a menudo el primer signo de enfermedad clínica.
  4. Prueba de enderezamiento reflejo colocando el ratón en su parte posterior sobre una superficie plana. Corregir lento es un signo de incoordinación truncal (grado 2). Un ingenuo ratón totalmente resistirá cualquier intento de colocar en su parte posterior, por lo que cualquier lentitud en la capacidad de derecho se anotó como una disfunción. Es típico para probar el ratón 3 - 4 veces para este reflejo.
  5. Evaluar postura y la deambulación. Ratones comienzan a mostrar un cambio en la postura lo que resulta en una disminución o arrastre de las caderas durante la deambulación (score de 2.5). Más resultados de la enfermedad en monoplegia, parálisis completa de un hind extremidad (puntuación de 3.0) y paraplejia, parálisis completa de ambos posteriores miembros (puntuación de 3.5). Quadraparesis moderada, debilidad de las cuatro extremidades, se traduce en avance muy lento (grado 4). Quadraparesis severa no permite casi ningún movimiento hacia adelante (puntuación de 4.5). Finalmente, con una enfermedad grave puede ser moribundos o morir (grado 5).
  6. Administrar a los ratones que pierden la habilidad para adquirir alimento líquido o sólido 1 mL de glucosa 5% en solución salina i.p. alternativamente, uso de suplementación con líquido gel calóricos softies de gel y tocino tazas, alto para contrarrestar la deshidratación y la carencia de alimentos. Eutanasia a ratones moribundos.

8. Preparación de tejido y la histología

  1. anestesiar ratones con 100 mg/kg ketamina y xilacina de 10 mg/kg, y luego prender cada bandolero a una tabla de disección.
  2. Abierta hasta el pecho, exponer el corazón. Haga una incisión en el hígado para permitir la salida de sangre. Coloque una aguja de mariposa en el tubo de una bomba de velocidad variable de medida usando un reservorio aparte de PBS y 10% formalina. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón y perfusión con 5 mL de PBS, seguido de 25 mL de formol al 10%.
  3. Quitar la cabeza y los ojos. Proceso ojos y retinas como se describió anteriormente 20. Corte a través de los zócalos del ojo, introducir las tijeras en la nariz y cortar el cráneo anterior a posterior en cada lado.
    1. Quitar el cráneo, exponer los nervios ópticos, corta el quiasma óptico y coloque un cassette entre los cojines de espuma 2.
    2. Sumergir en formol al 10% (24 h) y luego 50% etanol (24 h) y luego traslado a etanol al 70%.
  4. Quitar el cerebro y la columna vertebral y en formol al 10%. Sección en serie de cerebros en el plano coronal; cables de sección espinal en sagital (aproximadamente la mitad) y coronal serie planos (aproximadamente 20 perfiles por ratón).
  5. Muestras de SNC de proceso rutinario para inclusión en parafina. Tinción de secciones gruesas de 8 μm con hematoxilina y eosina (nervios ópticos) o Luxol fast blue-hematoxylin y eosina (cerebro y médula espinal).
  6. Evaluar los nervios ópticos para detectar la presencia de inflamación en el nervio y meninges circundantes (neuritis óptica) o predominante en las meninges circundantes (perineuritis óptica).
  7. Contar focos inflamatorios meníngeos y parenquimatosos (> 10 células mononucleares agrupadas) en las muestras de cerebro y la médula espinal para cada ratón.

9. En Vivo Proyección de imagen por tomografía de coherencia óptica (OCT) de retina

Nota: dominio espectral OCT retina la proyección de imagen de ratones se realiza mediante equipos comerciales (e.g., Spectralis con TruTrack perseguidor del ojo) para lograr ocular consistente orientación y reducir los artefactos de movimiento.

  1. Cinco minutos antes de la proyección de imagen, dilatar las pupilas con tropicamida 1% (una gota por ojo) y coloque el ratón para ser reflejada en la cámara de inducción de la anestesia, proporcionando un flujo constante de 2 litros por minuto (1,5% isoflurano). Encienda la estera de calor y preparar la jaula de recuperación post-anestésica.
  2. Colocar el ratón en el cilindro de imagen y redirigir el flujo de anestesia en consecuencia. Proteger los ojos con hidroxipropilmetilcelulosa 0.3% para mantener el ojo húmedo y para asegurar la continuidad de la refracción. Colocar una lente de contacto personalizada en el ojo a examinar.
  3. Guiado por la imagen de fondo de infra-rojo, dirigir el láser a los ojos, asegurando que el rayo se centra en la cabeza del nervio óptico. Las exploraciones OCT vertical y horizontales deben confirmar que la retina encuentra perpendicular al láser de.
  4. Promedio de realizar 25 B-SCAN en modo de alta resolución y Rasterizar de 30 exploraciones A.
  5. Después de imágenes de ambos ojos, retire lentes de contacto y aplicar gel oftálmico. Deja el ratón en la jaula de recuperación caliente.

10. Procesamiento y análisis de OCT

  1. utilizar el modular software para segmentación automatizada de imágenes.
    1. Manual correctos segmentos correspondientes a la interna limitando la membrana (ILM) y la capa plexiforme interna (IPL), que representa los límites de la retina interna capas (IRL) 21.
    2. Verificar que la capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL) y la capa de células ganglionares (GCL) residen dentro de los límites del IRL y no se superponen.
  2. Espesores de IRL calcular utilizando la cuadrícula de 2 principios tratamiento diabético retinopatía estudio (ETDRS) con diámetros de 1, 2 y 3 mm en el disco óptico y la exportación en un archivo de hoja de cálculo. El software calcula el espesor de cada capa de la retina por un promedio de cada sector de la cuadrícula. Por lo tanto, se excluye el segmento central, correspondiente a la cabeza del nervio óptico,.
  3. Analizar diferencias estadísticas entre los grupos en cada momento. Analizar ambos ojos para cada ratón, uso generalizado estimando ecuaciones con una matriz de correlación intercambiables y ajustes para correlaciones entre ojo intra sujeto 21.

Representative Results

En este protocolo, se utilizaron células de un donante T de AQP4 C57BL/6- / - ratones. Vacunación subcutánea de estos ratones con AQP4 p135-153 o p201-220, que contienen epítopos de células T patógenas, generó respuestas fuertes proliferativa de la célula T en nodos de linfa de drenaje (figura 1), mientras que estos dos péptidos inducido mucho más débil de la célula T proliferación de ratones WT. En comparación, la inmunización con AQP4 p91-110, que contiene una no patógena AQP4 T célula determinante13, o MOG p35-55, un péptido de mielina que activa las células T que causar encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)22,23 ,24, inducida por la magnitud de la proliferación de células T en ratones WT AQP4- / - y similar. Análisis de la utilización de TCR manchando flujo cytometry de Vβ individuales o familias Vβ, demostrado que p135-153 y p201-220-T células específicas de AQP4- / - ratones utilizaron único repertorio TCR. Hiper proliferación selectiva de AQP4 p135-153 y p201-220 en ratones- / - AQP4, así como la utilización única de TCR (figura 2), indica que las respuestas de células T patógenas a estos determinantes normalmente es regulada por negativo tímico selección, destacando la importancia para el uso de células de donante T de AQP4- / - en el presente Protocolo.

Antes de la transferencia adoptiva para la inducción de ATCA, las células del nodo de linfa de AQP4 péptido preparado ratones fueron cultivadas in vitro en condiciones de polarización Th17 o Th1 durante tres días. El grado de polarización de donantes CD4+ T las células fue confirmada por citoquinas intracelulares tinción (ICS) y medido por citometría de flujo (figura 3). Ingenuo receptoras ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 2 x 107 donantes AQP4 péptidos específicos de células T. Después de aproximadamente seis días, casi 100% de los ratones receptores desarrollaron signos clínicos de enfermedad autoinmune de la CNS, incluyendo parálisis flácida de la cola y extremidades (figura 4). Células T específicas de AQP4 polarización Th17 inducidos por una enfermedad clínica más severa que las células T específicas de AQP4 polarización Th1. Un ratón representante Th17 AQP4-péptido-específico y había desarrollado completa extremidades parálisis (paraplejia) se muestra en el Video 1. En contraste con los ratones que EAE se convirtió después de la administración de células Th17 MOG-específicos, ratones receptores recuperaron de clínica de la enfermedad inducida por las células Th17 específicas AQP4. En cuanto a EAE inducida por las células Th17 MOG p35-55-específicas, clínica de la enfermedad inducido por la AQP4 p135-153-específicas o las células Th17 p201-220-específicas se asoció con infiltración de células mononucleares en el parénquima de la CNS y meninges (figura 5). Las lesiones fueron más abundantes en las meninges que en la parenquimia de autoinmunidad CNS inducida por las células Th17 específicas AQP4.

Implicación del nervio óptico fue demostrada por la evaluación histológica y por serial OCT. AQP4 específicos y Th17 MOG-específicos de las células tanto inflamación inducida del nervio óptico, que se caracterizó por la presencia de células mononucleares. Mientras que las células Th17 específicas AQP4 causaron perineuritis óptica, las células Th17 MOG-específicos inducidos por neuritis óptica severa (figura 5). Usando OCT serial, inflamación del nervio óptico fue evidente por la hinchazón y mayor espesor de la capa retiniana interna (IRL) para clínica de la enfermedad inducida por AQP4 específicos o células Th17 MOG-específicos (figura 6). Para autoinmunidad inducida por la AQP4 Th17 CNS, grueso IRL regresado a los valores basales como ratones recuperado de la enfermedad clínica. En cambio, la persistencia de EAE inducida por MOG-específicos Th17 correspondió con adelgazamiento de la IRL y, como hemos demostrado anteriormente17, se asoció con pérdida de células ganglionares de la retina.

Figure 1
Figura 1 : AQP4 p135-153 y p201-220 provocan proliferación de robusta célula de T en ratones- / - AQP4, pero no ratones WT. Ratones fueron inmunizados s.c. con los péptidos indicados en CFA. Once días más tarde, los nodos de linfa fueron quitados y entonces cultivados con o sin antígeno, o con el péptido que se utiliza para la inmunización. Proliferación se midió por la incorporación de 3H-timidina (media ± SEM, representativo de 5 experimentos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Las células de T específicas AQP4 de AQP4- / - ratones utilizan repertorios TCR únicos. AQP4- / - y WT ratones fueron inmunizados con los péptidos indicados. Once días más tarde, los nodos de linfa fueron quitados y cultivados con el péptido que se utiliza para la inmunización. Las células se cosecharon. Utilización de TCR Vβ fue analizada por citometría de flujo (media ± SEM, n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Polarización proinflamatorias de las células donantes específicos AQP4 T. Once días después de la inmunización con AQP4 p135-153 o p201-220, las células del nodo de linfa fueron cosechadas y cultivadas con el péptido que se utiliza para la inmunización en condiciones de no polarización, las condiciones de polarización Th1 o Th17. Polarización Th17 o Th1 fue examinado por el ICS y flujo cytometry para IL-17 o IFN-γ, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Las células T específicas de AQP4 polarización Th17 inducen parálisis en ratones receptores WT. Ratones receptores WT recibieron 2 x 107 donantes AQP4 polarización Th17 p135-153 o p201-220-específicos de células T de ratones- / - AQP4. Las células de T de MOG-específicos polarización Th17 sirven como control positivo. Resultados son representativos de 8 experimentos (n = 5/Grupo). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Las células Th17 específicas AQP4 inducen inflamación opticospinal en ratones WT. Receptoras ratones recibieron 2 x 107 donantes Th17 AQP4 p135-153 - o p201-220-cebada Th17 células de ratones- / - AQP4 o MOG Th17 p35-55-específico y se sacrificaron 10 días más tarde. Los tejidos de la médula espinal y del nervio óptico fueron preparados y teñidos con H & E/LFB para evaluar evidencia de inflamación y desmielinización, respectivamente. Resultados son representativos de 5 ratones/grupo. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Inflamación del nervio óptico inducida por las células Th17 AQP4 específicos puede controlarse por octubre retinianos longitudinales PESO receptoras ratones recibieron 2 x 107 donantes AQP4 polarización Th17 p201-220-específico o MOG p35-55-específicos de células T en el día 0. Fueron examinados por OCT en el día 0 (antes de la administración de células T) y luego en los días 4, 7, 8, 9 10, 11 14 y 21. Espesor de la IRL fue medido (media ± SEM). Las estadísticas indican una comparación con el control de ingenuo. Resultados son representativos de 3 experimentos (5 ratones/grupo). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

AQP4 fue identificado como el objetivo principal de IgG de la NMO en 20053. Entonces, se reconoció que sería importante establecer un modelo animal de AQP4-dirigido de la autoinmunidad de la CNS. Tal modelo podría ser útil para investigar cómo las células T específicas de AQP4 y B participan en el desarrollo de la autoinmunidad de la CNS y prueba terapéutica de candidato para NMO. Aunque el reconocimiento específico de AQP4 T epítopos de tipo salvaje ratones primero fue divulgado en 201013, las células T en respuesta a los epitopos no causó enfermedad clínico o histológico14,17. La incapacidad para generar un modelo de autoinmunidad CNS basado en la reactividad inmune a AQP4 seguía siendo un enigma hasta 2015 cuando Jones, et al. 25 descubrió que el donante AQP4 p135-153-preparado las células T de ratones- / - AQP4 eran capaces de provocar signos clínicos e histologic de la autoinmunidad de la CNS en los ratones WT. De interés, AQP4 p135-153 se predice para MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad17. Solamente un otro AQP4 secuencia de aminoácidos, 201-220, se prevé enlazar-Ab con alta afinidad similar. De hecho, observamos AQP4 p135-153 y p201-220 ambos provocan proliferación sólida de AQP4- / -, pero no peso, ratones. Aquí, hemos mostrado cómo se puede aislar y ampliar encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 y p201-220-reactiva las células de T de los ratones- / - AQP4. Cuando transfieren a ratones receptores WT, las células Th17 AQP4 reactiva donante inducida por parálisis, que fue acompañada por la célula mononuclear infiltra en la médula espinal y del nervio óptico. Lesión del sistema visual aferente es bien conocido en pacientes con AQP4 seropositivos NMOSD26. Aquí, observamos que la inflamación del nervio óptico inducida por las células Th17 MOG-reactiva y AQP4 reactivo era distinta. Mientras que las células Th17 específicas AQP4 inducen perineuritis óptica, las células Th17 MOG-específicos inducidos por neuritis óptica severa. También hemos descrito las técnicas utilizadas para controlar la inflamación del nervio óptico inducida por células específicas de AQP4 y T MOG-específicos por OCT serial. Otros investigadores ahora deben ser capaces de aplicar los protocolos descritos aquí para avanzar en sus estudios se centró en los mecanismos patogénicos de ATCA.

Fácilmente uno puede evitar tres escollos potenciales en nuestro protocolo. Primera transferencia adoptiva de ATCA requiere uso AQP4 específicos de células de T de los ratones de AQP4- / - donante. En concreto, las células donantes WT AQP4 p135-153-específico T no causó ATCA en receptoras ratones WT. En segundo lugar, es importante realizar una "prueba de agua" con una gota de la emulsión de péptido/CFA antes de inmunización de AQP4- / - ratones (protocolo paso 1.5). La emulsión no debe dispersarse en agua cuando es conveniente para la inyección s.c.. Si la emulsión dispersa, uno debe mezclar la emulsión una vez más, descansar otra vez y repita la prueba de agua. Por último, las células de T del antígeno específico activado donantes CNS inducen autoinmunidad CNS más eficientemente que la reclinación de las células T. Uno debe inspeccionar visualmente las culturas bajo el microscopio de luz antes de la cosecha de las células de T del donante para la transferencia adoptiva. Rápidamente dividiendo las células puede formar racimos, que son fácilmente identificables. También, cuando las culturas contienen muchas células T activadas, los medios de comunicación pueden transición de color rosado naranja o amarillo, debido a la reducción en el pH. También se puede evaluar activación de las células de ganglio AQP4 preparado T donantes de proliferación por la incorporación de 3H-timidina, tal como se describe en el protocolo de paso 3.

El descubrimiento que los epitopos de células T AQP4 patógenos dos son (1) predice para MHC II se unen con alta afinidad y (2) provocar potentes respuestas proliferativas en AQP4- / -, pero no peso, ratones sugieren que las células T dirigidas a los determinantes son normalmente controlado por selección negativa tímica17. El repertorio TCR para reconocimiento de AQP4 p135-153 y p201-220 en ratones- / - AQP4 es únicas (Figura 2), que también es consistente con la canceladura clónica mediada por las células epiteliales medulares tímicas. Otros mecanismos de tolerogénicas normalmente pueden limitar inmunorespuestas a AQP4. Después de nuestro informe inicial17, otro grupo también demostró que la AQP4 p201-220 contiene un encephalitogenic determinante de la célula de T27. Cuando ratones α/β (TCRα- / -) deficiencia de la célula de T fueron reconstituidos con AQP4- / - CD4+ T las células fue posible provocar una respuesta de células T encephalitogenic AQP4 específicos, pero no una AQP4 específica respuesta humoral, lo que implica que en Los ratones WT respuestas de células B de AQP4 específicas, similares a respuestas de células T específicas de AQP4, son objeto de selección negativa. De hecho, la pérdida de axones de la médula espinal y RGCs, que no se observó en los ratones WT con ATCA inducida por las células T específicas de AQP4 solo, puede requerir participación de anticuerpos patógenos específicos de AQP4. Está claro que modelos murinos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 continuará evolucionando conforme aprendemos más sobre los mecanismos de tolerogénicas normalmente controlan AQP4 específicos de la célula T y célula de B de la inmunidad.

Otros modelos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 también están siendo desarrollados6,16,28,29,30. Cada uno puede ofrecer ventajas para el estudio de determinados aspectos que son relevantes para la patogenesia NMO. Se han identificado linfocitos T específicos de AQP4 en WT ratas6,16,29. Esas células T específicas de AQP4 causaron cambios histologic de la autoinmunidad de la CNS, pero similar a las observaciones en los ratones, las de células T específicas de AQP4 rata WT no causan señales significativas de enfermedad clínica. Por lo tanto, los mecanismos de tolerancia restringiendo la célula de T y células B específicas de AQP4 las respuestas inmunitarias en ratones WT funcionan también en ratas. A pesar de todo, uno no debe subestimar el poder en el uso de modelos de ratón para el estudio de mecanismos implicados en la patogenia de la enfermedad. La riqueza de knock-out, transgénico y ratones reportero puede ser ventajosa. También debe reconocerse que varios descubrimientos fundamentales en la autoinmunidad se hicieron usando modelos de ratón EAE. Por ejemplo, demostración que T cell clones específicos para un antígeno de uno mismo puede mediar enfermedad autoinmune31,32, identificación de la función de coestimulación de la célula de T en autoinmunidad33 y el descubrimiento de la Desarrollo vía de diferenciación Th1734 primero fueron descritos usando modelos de ratón EAE. Usando el modelo del ratón del ATCA que hemos desarrollado, uno ahora tiene los medios para estudiar el desarrollo y la regulación de patógenos específicos de AQP4 inmunorespuestas en vivo, que debe proporcionar penetraciones importantes relacionadas con la patogénesis de la NMO.

Disclosures

Sagan S.A. A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green y R.A. Sobel no informan revelaciones. S.S. Zamvil es Editor adjunto de Neurología, Neuroinmunología y neuroinflamación y es miembro del Comité Consultivo de la sociedad internacional de Neuroinmunología. Él ha servido en el Consejo Editorial de la Revista de investigación clínica, El diario de la inmunología y La revista de ciencias neurológicasy ha sido miembro del Comité de examen de beca de los institutos nacionales de Neuroinmunología clínica de la salud (NIH) y tumores de cerebro (CNBT) estudio de la sección y la sociedad nacional de esclerosis múltiple (NEM). Él ha servido como consultor y recibió honorarios de Biogen Idec, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech y Teva Pharmaceuticals, Inc., ha servido y sirve en tableros de control de seguridad datos de Lilly, BioMS, Teva y terapéutica de Opexa. Actualmente, Dr. Zamvil recibe apoyo de la beca de investigación de los NIH, NEM, la Fundación de Maisin, Biogen y Celgene.

Acknowledgements

Se prestó apoyo a S.S.Z. por el Instituto Nacional de salud (AI073737 to1 y to1 NS092835-01), sociedad nacional de esclerosis múltiple (4768 RG y RG 5179 5180 RG), Fundación de Maisin y Jackson Guthy Charitable Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

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References

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