Induktion av förlamning och visuella systemet skada hos möss av T celler specifika för Neuromyelitis Optica Autoantigen akvaporin-4

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att inducera förlamning och opticospinal inflammation genom överföring av akvaporin-4 (AQP4)-specifika T-celler från AQP4- / - mössen i WT möss. Dessutom visar vi hur du använder seriell optisk koherenstomografi för att övervaka visuella systemet dysfunktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Medan det är erkänt att akvaporin-4 (AQP4)-specifika T-celler och antikroppar delta i patogenesen av neuromyelitis optica (NMO), människans centrala nervsystem (CNS) autoimmun demyeliniserande sjukdom, skapandet av en AQP4-riktade modell med både klinisk och histologisk manifestationer av CNS autoimmunitet har visat sig vara utmanande. Immunisering av vildtyp (WT) möss med AQP4 peptider framkallade T cell spridning, även om dessa T-celler inte kan överföra sjukdomen till naiva mottagarens möss. Nyligen har identifierades två roman AQP4 T cell epitoper, peptid (p) 135-153 och p201-220, när studera immunsvaret för AQP4 i AQP4-brist (AQP4- / -) möss, vilket tyder på T-cellsreaktivitet till dessa epitoper styrs normalt av thymic negativa urval. AQP4- / - Th17 polariserade T-celler som primärvaccinerats till antingen p135-153 eller p201-220 inducerad förlamning i mottagarens WT möss, som associerades med huvudsakligen leptomeningeal inflammation i ryggmärgen och synnerver. Inflammation omgivande synnerverna och engagemang av inre retinala lagren (IRL) var manifesteras av förändringar i seriell optisk koherenstomografi (OCT). Här, illustrera vi de metoder som används för att skapa denna nya in-vivo -modell av AQP4 riktade CNS autoimmunitet (ATCA), som nu kan användas för att studera mekanismer som tillåter utvecklingen av patogena AQP4-specifika T-celler och hur de kan samarbeta med B celler i NMO patogenes.

Introduction

Neuromyelitis optica (NMO) är en centrala nervsystemet (CNS) autoimmuna inflammatoriska demyeliniserande sjukdom som orsakar återkommande episoder av förlamning och visuell förlust leder till permanenta neurologiska funktionshinder1. NMO anses för närvarande främst vara en humorala autoimmun sjukdom2 eftersom det är associerade med antikroppar (Igs) inriktning akvaporin-4 (AQP4), en vattenkanal uttryckt rikligt på astrocyterna3,4. CNS inflammation är dock en förutsättning för CNS inmatning av AQP4 Ig5,6. Således har det inte varit möjligt att fastställa en modell av NMO genom överföring av anti-AQP4 Igs ensam. Resultaten att (1) patogena AQP4-specifika Igs NMO patienter är IgG11,2, en T-cell-beroende Ig underklass7 (2) T-celler påvisas i NMO lesioner8,9 (3) NMO är associerad med vissa MHC II gener (e.g. HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10och (4) proinflammatoriska AQP4-reaktivt DR-begränsad Th17 celler byggs i NMO patienter11,12 alla indikerar att AQP4-specifika T-celler har en nyckelroll i NMO patogenes. Därför är det viktigt att utveckla modeller för att avgöra hur AQP4-specifika T-celler kan bidra till NMO patogenes.

Flera år sedan, identifierades flera AQP4 T cell epitoper i vildtyp (WT) möss13,14 och råttor15. Samtidigt konstaterades att AQP4-reaktiva T-celler kan inducera opticospinal inflammation i naiva mottagarens råttor15,16, observerades inte betydande kliniska tecken på CNS-sjukdomar. På samma sätt direkt immunisering av WT möss med peptider som innehåller AQP4 T cell epitoper14,17, eller överföring av proinflammatoriska T celler inriktning dessa bestämningsfaktorer17, inte orsakar kliniska tecken eller histologisk tecken på CNS autoimmunitet.

Nyligen det observerades att immunisering av C57BL/6 AQP4-brist (AQP4- / -) möss med AQP4 peptid (p) 135-153 eller p201-220, två determinanter förutspådde för att binda MHC II (I-Ab) med hög affinitet18, framkallade starka CD4 + T-cell svar17. Dessa två peptider framkallade däremot endast blygsamma proliferativ svaren i WT möss. Ytterligare, T-cell receptor (TCR) repertoaren används för erkännande av dessa bestämningsfaktorer av T-celler från AQP4- / - möss var unik. Sammantaget tyder dessa fynd att T cell erkännande av AQP4 regleras i thymic negativa urval. AQP4 p135-153 - eller p201-220-specifika Th17-celler från AQP4- / - givare möss inducerad förlamning i nästan 100% av naiva mottagarens WT möss; Detta var associerade med opticospinal infiltrat av T-celler, B-celler och monocyter. Seriella opticospinal koherenstomografi (OCT) visat dynamiska visuella systemet engagemang. Möss med T-cell-medierad AQP4-riktade CNS autoimmunitet (ATCA) återhämtat sig från förlamning och visuella systemet skada. I motsats till EAE orsakas av myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) p35-55-specifika T-celler, som ledde till ihållande klinisk sjukdom, förknippades ATCA induceras av T-celler ensam inte med axonal förlust eller minskning av retinala ganglionceller (RGCs). Våra resultat har tydligt visat att det finns flera patogena AQP4 T cell bestämningsfaktorer. Denna nya modell av ATCA är användbar för att studera mekanismer som styr utvecklingen av patogena AQP4-specifika T-celler, lära sig hur dessa celler inducerar CNS inflammation och hur de kan samarbeta med AQP4-specifika B-celler och antikroppar att främja NMO patogenes .

I det föreliggande betänkandet beskriver vi de protokoll som används för att inducera och utvärdera T cell-inducerad ATCA. Vi börjar med de tekniker som används för immunisering, T cellkultur och Th17 polarisering för att generera patogena AQP4-specifika T-celler, flödescytometri Flödesanalys att bekräfta polarisering och överföring av dessa T-celler. Sedan beskriver vi metoder för att utvärdera klinisk och histologisk sjukdom och användning av seriell OCT att övervaka visuella systemet skada i mottagarens möss.

Protocol

alla djur förfaranden utfördes i enlighet med experimentella riktlinjer som godkänts av University of California, San Francisco institutionella djur vård och användning kommittén. C57BL/6 (h-2 b) honmöss, 8 veckors ålder, köptes och C57BL/6 AQP4 - / - möss tillhandahölls av A. Verkman.

1. immunisering av möss med AQP4 peptider

  1. förbereda komplett Freund ' s adjuvant (CFA) fungerande lager.
    1. Fint slipa en uttorkad beredning av M. tuberculosis (H37Ra) med hjälp av en mortel och mortelstöt.
    2. Lägg till marken H37Ra till ofullständig Freund ' s adjuvant till en slutlig koncentration på 4 mg/mL. CFA kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  2. Lös frystorkade antigen (Ag) AQP4 peptid i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 1 mg/mL. Underhåll vid 4 ° C eller på ice.
  3. Förbereda monteringen av 2 luer-lock sprutor, gick med en Avstängningskranen, innehållande CFA/peptid emulsionen.
    1. Bifoga en glasspruta luer-lock utan kolven till en 3-vägs nylon Avstängningskranen med 2 manlig luer-lock anslutningar. Stäng Avstängningskranen genom att växla spaken mot sprutan. Placera den öppna änden av sprutan upp, vilket gör att sprutan ska fungera som ett provrör. Placera detta i en tube rack för ökad stabilitet.
    2. Vortex CFA fungerande lager och Ag lösningen. Lägga till en 1:1 volym av peptid / CFA på öppna sprutan. 200 µL av CFA/Ag (4 x 50 µL) krävs per mus.
      Obs: Normalt ca 1 mL av preparatet förloras i Avstängningskranen, vilket kommer att minska beloppet som är tillgängligt för immunisering. Därför är det viktigt att införliva detta i beräkningen av total volym krävs.
      Exempel: för immunisering av 5 möss: (200 µL/djur x 5 djur) + 1 mL extra volym = 2 mL totalt CFA/Ag krävs.
    3. Infoga glas kolven i sprutan och medan du håller den på plats, Vänd sprutan så att avstängningskranen är riktad uppåt. Växla Avstängningskranen spaken till outnyttjade kvinnliga anslutningen. Noggrant utöva påtryckningar till glas kolven för att avlägsna överflödig luft ur sprutan. Vätskan fyller andra manlig luer-lock anslutning av Avstängningskranen.
    4. Bifoga en andra spruta av glas (kolven helt insatt) till andra manlig luer-lock anslutning av Avstängningskranen. Detta bör vara ett slutet system med 2 glas sprutor i samband med en Avstängningskranen som innehåller som lite överflödig luft som möjligt.
    5. Att skapa en emulsion, blanda genom att trycka kolvarna passera vätskan växelvis mellan de 2 sprutorna i ca 2 min. Chill sprutorna på is i ca 10 min. Upprepa kylning och blanda tills det finns en tydlig förändring i viskositet av preparatet , vilket resulterar i en mycket hård, vit emulsion. Kylskåp sprutor innehållande emulsionen vid 4 ° C eller underhålla på ice.
  4. Överföra alla emulsionen till en glasspruta luer-lock, ta bort tomma glassprutan och ersätta den med en 1 mL luer-lock spruta för injektion. Fylla nya sprutan med emulsion, ta bort den från Avstängningskranen och fäst en nål (25G x 5/8).
  5. " vatten-test " emulsionen för konsekvens. Utvisa en droppe av emulsionen i en liten skål med vatten. Emulsionen bör inte skingra, som anger att det är lämpligt injektionsvätska.
    1. Om emulsionen skingrar, det är inte redo för injektion; överföring vätska tillbaka in i glaset sprutor och fortsätter att blanda och sedan chill igen tills emulsionen är styva.
    2. Testa emulsionen igen tills rätt konsistens uppnåtts.
  6. Injicera givare AQP4 - / - möss subkutant (s.c.) med emulsion som innehåller AQP4 peptiden. Varje mus får 4 x 50 µL s.c. injektioner (200 µL total (100 µg peptid)). 4 webbplatser inkluderar båda sidor av nedre delen av buken, som avrinningen in i inguinal lymfkörtlar (LN), och båda sidor av bröstkorgen mediala till varje armhåla, som avrinningen in i armhålan LN. Adoptiv överföring kräver 1-2 immuniserade givare möss per mottagare mus.

2. T-cellkultur och Proinflammatory T cell polarisering

  1. 10-12 dagar efter immunisering, samla in LN från mössen.
    1. i en ISLÅDA, förbereda 60 mm petriskålar med en cell sil (mesh storlek 70 µm) och som innehåller kyld RPMI media med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) och 100 U/mL penicillin-100 µg/mL streptomycin (pen-strep) (RFPS).
    2. Euthanize möss av exponering för CO 2, följt av cervikal dislokation. Fördjupa möss i 70% etanol och sedan fästa varje footpad till en dissektion styrelse.
    3. Skär ett snitt med mittlinjen i huden från ljumsken till halsen och ner varje ben. Dra ut huden från bukhinnan och fästa den tautly till styrelsen. Dissekera inguinal och axillär LN och placera i petriskål innehållande RFPS, på is. 19
    4. för överföring experiment, kombinera LN från alla djur inom samma immunisering grupp. För flödescytometrisk flödesanalyser av Vβ användning, separata LN från enskilda djur.
  2. Placera cellen silen som innehåller LN på ett 50 mL centrifugrör som innehåller RFPS. Använda den platta änden av en steril 5 mL sprutkolven till tryck på LN cellerna genom silen, tvättning med 20-30 mL av RFPS att underlätta indrivning av cellerna. Upprätthålla LN celler på is under hela behandlingen tills tid för kultur.
  3. Tvätta två gånger, centrifugering vid 393 x g i 5 min. Efter den andra tvätten, resuspendera LN cellerna i T-cell media (TCM). TCM innehåller RPMI med 10% Värmeinaktiverade FBS, 292 µg/mL L-glutamin, 110 µg/mL natrium pyruvat, och 55 µM 2-merkaptoetanol och penna-strep. Vanligtvis en volym på 5 mL TCM per givare mus används.
  4. Räkna LN cellerna. Förväntade avkastningen är cirka 3-6 x 10 7 LN celler per immuniserade mus givare. Avsätta 3-4 x 10 6 för en proliferation assay (se avsnitt 3 nedan).
  5. Ställa in polariserande kulturer för överföring (avsnitt 6).
    1. Förbereda en Th17 polariserande kultur 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL rekombinant mus interleukin (IL) -23 och 10 ng/mL rekombinant mus IL-6 i TCM.
    2. Alternativt för Th1 polarisering, förbereda en kultur av 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag och 10 ng/mL rekombinant mus IL-12 i TCM.
    3. Tillsätt 2 mL (1 x 10 7 celler) per brunn av polariserande kultur blandningen till en 12-bra platta. LN cellerna från 2-4 givare möss kommer att fylla en 12-bra platta. Upprätthålla kulturer i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2 för 72 h.
    4. Kontrollera visuellt LN celler i kultur för aktivering på 48 h, 72 h. aktivt celler bildar omfattande kluster och T-cellerna kommer att öka i storlek, blir mer pleomorfa. Ökningen av ämnesomsättningen kommer att orsaka en sänkning av pH i media, ändra från persika till orange. Om pH-värdet är tillräckligt låg för gulna media, tillsätt 1 mL färsk TCM att förhindra toxicitet till celler i de återstående 24 h.
    5. Gå vidare till avsnitt 6 för överföring. Polarisering effektivitet kan verifieras av intracellulära cytokin färgning (ICS), som beskrbeskrivs i avsnitt 5.
  6. Ställa in kulturerna med LN från enskilda möss för flöde flödescytometrisk analys av surface Vβ uttryck (avsnitt 4).
    1. Förbereda 5 x 10 6 LN celler per mL med 10 µg/mL Ag i TCM.
    2. Tillsätt 2 mL (1 x 10 7 celler) av kulturen per brunn till en 12-bra platta. Kulturer bör bibehållas i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2 i 10 dagar. Fortsätt till avsnitt 4.

3. Proliferation Assay

Obs: detta fortsätter från avsnitt 2.4.

  1. Bereda 3-4 mL LN celler i ett rör, 2 x 10 6 celler per mL i TCM.
  2. Blanda försiktigt cellerna genom att vända rör flera gånger, och sedan överföra till en steril tråg.
  3. Bruk en multikanalpipett till plattan 100 µL av celler per brunn i en 96-väl runda vävnadsodling bottenplattan. Typiskt, tallrik 15 brunnar för tre exemplar provning av 4 Ag koncentrationer och ingen Ag referens.
  4. Späd Ag i TCM vid olika koncentrationer, vanligtvis 80, 20, 5, 1 och 0 µg/mL (för 2 x bestånd). Tillsätt 100 µL av varje koncentration i tre exemplar för en slutlig koncentration på 40, 10, 2,5. 0,5 och 0 µg/mL. Inkubera i ca 72 timmar vid 37 ° C.
    Obs: steg 3.5 genom 3,7 involvera radioaktivt material. Korrekt användning, övervakning och bortskaffande av radioaktivt material bör genomföras, enligt institutionella och statliga förordningar.
  5. Förbereda en arbetande stamlösning av 3 H-tymidin (40 µCi/mL) genom att lägga till 1 mCi 3 H-tymidin till 25 mL RPMI och lagras vid 4 ° C. Pipettera 0,5 mL arbetslösning i en steril tråg.
  6. Lägg till 25 µL av 3 H-tymidin (1 µCi) per väl använda en flerkanalig Pipettera. Inkubera i en ytterligare 18 h vid 37 ° C.
  7. Skörd celler på filtret glasull använder en 96 brunnar cell skördare och skölj med 70% etanol. Efter torkning, täta filter mattan till en plast prov påse med 5 mL scintillation vätska. Mäta radioaktiviteten i varje brunn med hjälp av en scintillationsräknare.

4. Flow flödescytometri analys för Cell Surface TCR Vβ uttryck

Obs: detta fortsätter från avsnitt 2.6. Antikroppar för mus TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 och 5.2, 6, 7, 8.1 och 8.2, 8.3, 9, 10b, 11, 12, 13, 14 och 17a finns kommersiellt för att testa uttrycket TCR Vβ.

  1. För påvisande av TCR Vβ, få bort T-celler från kultur plattan av pipettering flera gånger och överföra celler till en tub.
  2. Tvätta med FACS buffert (FB) som innehåller 2% FBS, 0,1% natriumazid och 2 mM EDTA i PBS.
  3. Överföring celler till en V-botten 96 brunnar tallrik på en densitet på 1 x 10 5 3 x 6 celler per brunn. Om hela Vβ panelen testas, cellerna bör fördelas i flera brunnar (en brunn per Vβ testas).
  4. Utesluta döda celler från flödet flödescytometrisk analys genom färgning med ett LIVE/DEAD livskraft färgämne, som reagerar med fria aminer exponeras av nekrotiska celler. Följ tillverkarens ' anvisningar för centrifugering och resuspension i livskraft dye. Inkubera på is för 10-20 min. i hela cellen färgning förfaranden, skydda celler från ljus och hålla på ice.
  5. Efter inkubation, tvätta plattan en gång i FB. För att upptäcka TCR Vβ, avbryta cellerna i 100 µL av FB som innehåller en spädning 1: 100 av antikroppar för CD4 (klona RM4-5) och TCR Vβ. Inkubera i 15-60 min på ice.
  6. Tvätta plattan en gång i FB och fixa cellerna genom att lägga till 200 µL 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PBS. Inkubera i 20 min på is. Tvätta plattan i FB och analysera genom flödescytometri.

5. Flow flödescytometrisk analys för intracellulära cytokin produktion

  1. för intracellulära cytokin färgning (ICS), behandla T cellkulturer med en 1:1,000 utspädning av protein transport hämmare reagens (t.ex. GolgiPlug) i TCM, 4 h före ICS att förhindra cytokin sekretion. På den tiden, aktivera T-celler med 50 ng/mL phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) och 500 ng/mL ionomycin för att förmå proteinproduktion.
  2. Efter 4 h kultur vid 37 ° C, rubba celler från kultur plattan av pipettering upp och ner och överföra till ett centrifugrör (15 eller 50 mL).
  3. Tvätta med FB. Återsuspendera cellerna i FB och överföring till en V-botten 96 brunnar tallrik på en densitet på 5 x 10 5 till 3 x 10 6 celler per brunn.
  4. Fläcken celler med livskraft färgämne som beskrivs ovan (avsnitt 4.2). Efter inkubering, tvätta plattan en gång i FB.
  5. Lägg till antikroppar för påvisande av ytmarkörer följande:
    1. för påvisande av ytmarkörer, upphäva cellerna i 100 µL av FB som innehåller en spädning 1: 100 av antikropp för CD4 (klona RM4-5).
    2. Inkluderar alternativt antikroppar för B220 (klona 30-F11) och CD11b (klona M1/70) vid en spädning på 1: 100 att förbättra gating av B-celler och monocyter/makrofager, respektive. Allmänhet, PE-Cy7 anti-CD4, FITC anti-B220 och PerCP-Cy5.5 anti-CD11b fungerar bra. Val av antikropp/fluorokrom konjugat bör vägledas av konfigurationen av flödescytometer skall användas för analys och optimala koncentrationer av antikroppar bör bestämmas empiriskt.
    3. Inkubera i 15-60 min på ice.
  6. Tvätta plattan med FB och resuspendera cellerna i 200 µL fixering/permeabilisering lösning för 20 min på is. Detta kommer att fixa cellerna och permeabilize membranen.
  7. För att upprätthålla permeabiliseringen av cellmembranen under den intracellulära färgning, använda Perm/tvättbuffert (PW) (utspädd 1:10 från 10 X lager) i stället för FB. Tvätta brunnarna i 200 µL PW.
  8. För ICS, förbereda en spädning 1: 100 av antikroppar för interferon (IFN)-γ och IL-17A med 1 x PW. Ett alternativ är APC anti-IFN-γ (klon XMG1.2) och PE anti-IL-17A (klon eBio17B7) som fungerar bra. Återsuspendera cellerna i 100 µL av den intracellulära antikroppen cocktail och sedan Inkubera i minst 15 minuter. Det är också möjligt att fortsätta den färgning över natten vid 4 ° C.
  9. Tvätta brunnarna i 200 µL PW och resuspension i FB för flödescytometri.
  10. Parallellt, utarbeta en ofärgade prov (celler i FB utan antikroppar) att optimera detektor spänningar och singel-färgade prover för varje enskild fluorokrom (dvs celler eller ersättning pärlor färgas med endast en antikropp/fluorokrom) till bestämma spillover kompensationsvärden.
  11. Använder en flödescytometer, förvärva ≥ 10.000 celler (händelser), gating på livskraftiga (LIVE/DEAD-negativ) CD4 + celler. För att säkerställa korrekt gating av T-celler, utesluta B220 + och CD11b + celler (B-celler och monocyter/makrofager, respektive). Inom CD4 + T cell subpopulationen, bestämma procentandelen av celler som uttrycker IFN-γ (Th1 härstamning) eller IL-17A (Th17 härstamning).

6. Adoptiv överföring av patogena AQP4-specifika T-celler

Obs: detta steg följer av avsnitt 2.5: T cell kultur och proinflammatoriska T cell polarisering.

  1. Recover polariserade celler från 12 brunnar genom pipettering upp och ner för att få bort, och överföra dem till en 50 mL tub. Maintain på is tills injektioner.
  2. Räkna cellerna, tvätta två gånger i kallt PBS och Preparera en suspension av 1 x 10 8 celler/mL i PBS. Allmänhet, injicera celler inom en timme.
  3. Försiktigt blanda cellerna genom omskakning och överför till en 1 mL spruta vid tidpunkten för injektion. Administrera 200 µL av cellerna (2 x 10 7) intravenöst (i.v.) till varje mus, genom svansen ven.
  4. Injicera varje mottagare mus i.p. med 200 ng av B. pertussis toxin utspädd i 200 µL av PBS den dagen och 2 dagar senare. Övervaka möss dagligen för tecken på klinisk sjukdom.

7. Klinisk bedömning av ATCA

  1. Undersök mottagarens möss dagligen i kliniska tecken på CNS autoimmunitet. I allmänhet visar möss tecken på CNS autoimmunitet 5-8 dagar efter överföring av AQP4-specifika T-celler. Mössen kommer att Visa kliniska symtom av neurologisk dysfunktion. Det är bra att utföra utvärderingar på en naiv mus att definiera normala förmågan hos en mus.
  2. Utvärdera möss för förlust av svans tonen. Håll mössen försiktigt vid basen av svansen och lyft upprätt. En svans som slokar kontinuerligt beskrivs som förlust av svans tona (1 Poäng). Förlust av svans ton är ofta det första tecknen på klinisk sjukdom.
  3. Test för rätande reflex genom att placera musen på ryggen på en plan yta. Långsam rätande är ett tecken på truncal inkoordination (2 Poäng). En naiv mus kommer helt emot försök att placera den på ryggen, så någon långsamhet i förmågan att rätt görs som en dysfunktion. Det är typiskt att testa musen 3 - 4 gånger för denna reflex.
  4. Utvärdera hållning och förflyttningar. Möss börjar visa en förändring i kroppsställning vilket resulterar i en sänkning eller dra av höfterna under förflyttningar (2,5 Poäng). Ytterligare sjukdom resultat i monoplegia, fullständig förlamning av en hind extremiteter (värdering av 3.0) och paraplegi, fullständig förlamning av båda hind lemmar (3,5 Poäng). Måttlig quadraparesis, svaghet i alla fyra extremiteter, resulterar i mycket långsam förflyttning framåt (4 Poäng). Svår quadraparesis tillåter nästan ingen förflyttning framåt (Poäng 4.5). Slutligen, med svår sjukdom kan de blir döende eller dö (betyg 5).
  5. Administrera till möss som förlorar förmågan att förvärva flytande eller fast livsmedel 1 mL 5% glukos i saltlösning i.p. alternativt använda tillskott med vätska gel cups, hög kalori/gel och bacon mjukisar att motverka uttorkning och mat deprivation. Euthanize döende möss.

8. Vävnad förberedelse och histologi

  1. söva möss med 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin, och sedan fästa varje footpad till en dissektion styrelse.
  2. Öppna upp bröstet, utsätta hjärtat. Incisionsfilm levern att tillåta blod utflöde. Bifoga en fjärilsnål till slangen av en miniflow variabel hastighet pumpen med en separat behållare för PBS och 10% formalin. Stick in nålen i vänster kammare i hjärtat och BEGJUTA med 5 mL PBS, följt av 25 mL 10% formalin.
  3. Ta bort huvudet och sedan ögonen. Behandla ögon och näthinnor som beskrivs tidigare 20. Skär över ögonhålor, infoga sax på näsan och skär skallen anterior posterior på varje sida.
    1. Ta bort skallen, exponera synnerverna, skär den optiska chiasm och placera i en kassett mellan 2 skum kuddar.
    2. Sänk i 10% formalin (24 h), och sedan 50% etanol (24 h) och sedan transfer till 70% etanol.
  4. Bort hjärnan och ryggraden och placera i 10% formalin. Seriellt avsnitt hjärnor i koronalt planet; avsnitt spinal sladdar i sagittal (ungefär hälften) och seriell koronala flygplan (cirka 20 tvärsnitt per mus).
  5. Process CNS prover rutinmässigt för inbäddning av paraffin. Fläcken 8 µm tjocka sektioner med hematoxylin och eosin (synnerverna) eller Luxol snabb blå-hematoxylin och eosin (hjärnan och ryggmärgen).
  6. Utvärdera synnerverna för förekomst av inflammation i den nerv och omgivande hjärnhinnor (optisk neurit) eller huvudsakligen i omgivande hjärnhinnor (fiberoptiska perineuritis).
  7. Räkna meningeal och parenkymal inflammatoriska foci (> 10 klustrade mononukleära celler) i hjärnan och ryggmärgen proverna för varje mus.

9. In Vivo Retinal Imaging av optisk koherenstomografi (OCT)

Obs: spektrala domänen OCT retinal imaging av möss utförs med kommersiell utrustning (t.ex., Spectralis med TruTrack eye tracker) att uppnå konsekvent okulär orientering och minska rörelse artefakter.

  1. Fem min innan imaging, vidgas elever med 1% tropikamid (en droppe per öga) och Placera musen för att avbildas i anestesi induktion kammaren, som ger ett stadigt flöde av 2 liter per minut (1,5% isofluran). Slå på värmen matta och förbereda efter anestesi återhämtning buren.
  2. Placera musen på imaging cylindern och omdirigera anestesi flödet med detta. Skydda ögonen med 0,3% hydroxipropylmetylcellulosa att hålla ögonen fuktiga och kontinuiteten av refraktion. Placera en anpassad kontaktlins på ögat undersökas.
  3. Guidade av infraröd fundus bilden, rikta lasern till ögat, se till att balken är centrerad på synnervspapillen. Vertikala och horisontella OCT skanningar bör bekräfta att näthinnan lägger vinkelrätt till lasern.
  4. Utför 25 B-skanningar i högupplöst läge och rastrera från 30 i genomsnitt A-skanningar.
  5. Efter imaging båda ögonen, ta bort kontaktlinser och applicera oftalmologiska gel. Lämnar musen i varm återvinning buren.

10. Bearbetning och analys av OCT

  1. använda den modulära bildhanteringsprogram för automatiserad segmentering.
    1. Manuellt rätta segment som motsvarar det inre begränsande membranet (ILM) och inre plexiform lagret (IPL), som representerar gränserna för den inre retinal lager (IRL) 21.
    2. Kontrollera att de retinala nervfiber skiktet (RNFL) och det ganglion celllagrar (GCL) uppehålla sig inom gränserna för IRL och inte överlappar.
  2. Beräkna IRL tjocklekar med tidig behandling diabetisk retinopati studie (ETDRS) 2 rutnätet med diametrar av 1, 2 och 3 mm centrerad på synnervspapillen och export till en kalkylbladsfil. Tjockleken på varje näthinnans skikt beräknar programvaran av genomsnitt varje rutnät sektor. Därför centrala segmentet, motsvarar synnervspapillen, är uteslutet.
  3. Analysera statistiska skillnader mellan grupperna vid varje tidpunkt. Analysera båda ögonen för varje mus, med generaliserad uppskatta ekvationer med en utbytbar korrelationsmatris och justeringar för intra föremål mellan ögat korrelationer 21.

Representative Results

I detta protokoll använde vi givare T celler från C57BL/6 AQP4- / - möss. Subkutan immunisering av dessa möss med AQP4 p135-153 eller p201-220, som innehåller patogena T cell epitoper, framkallade starka proliferativ T-cell svar i dränerande lymfkörtlar (figur 1), medan dessa två peptider inducerad mycket svagare T-cell spridning i WT möss. I jämförelse, immunisering med AQP4 p91-110, som innehåller en icke-patogena AQP4 T cell avgörande13eller MOG p35-55, en myelin peptid som aktiverar T-celler som orsakar experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)22,23 ,24, inducerad liknande omfattning T cell spridning i AQP4- /- och WT möss. Analys av TCR utilization av flöde flödescytometri färgning för enskilda Vβ eller Vβ familjer, visat att p135-153 - och p201-220-specifika T-celler från AQP4- / - möss utnyttjas unika TCR repertoarer. Selektiv hyper-spridning av AQP4 p135-153 och p201-220 i AQP4- / - möss, samt det unika TCR utnyttjandet (figur 2), anges att patogena T cell Svaren till dessa bestämningsfaktorer normalt regleras i thymic negativa urval, vilket understryker vikten av att använda AQP4- / - givare T celler i detta protokoll.

Innan överföring för induktion av ATCA odlades lymfkörtel celler från AQP4 peptid-primade möss in vitro i Th17 - eller Th1-polarisera villkor för tre dagar. Omfattningen av polarisering av givare CD4+ T celler var bekräftas av intracellulära cytokin färgning (ICS) och mätt med flödescytometri (figur 3). Naiva mottagarens möss injicerades intravenöst med 2 x 107 givare AQP4 peptid-specifika T-celler. Efter ungefär sex dagar utvecklat nästan 100% av mottagarens möss kliniska tecken på CNS autoimmuna sjukdomar, inklusive halta svansen och bakbenen förlamning (figur 4). Th17-polariserade AQP4-specifika T-celler inducerad mer svår klinisk sjukdom än Th1-polariserade AQP4-specifika T-celler. En representativ mus som fick Th17 AQP4-peptid-specifika och utvecklat kompletta bakben förlamning (paraplegi) visas i Video 1. I motsats till möss som utvecklade EAE efter administrering av MOG-specifika Th17-celler, mottagarens möss återhämtat sig från klinisk sjukdom orsakas av AQP4-specifika Th17-celler. När det gäller EAE orsakas av MOG p35-55-specifika Th17-celler, klinisk sjukdom inducerad av AQP4 p135-153-specifika eller p201-220-specifika Th17-celler var associerade med infiltration av mononukleära celler i CNS parenkymet och hjärnhinnorna (figur 5). Lesioner var rikligare i meningerna än i parenkymet för CNS autoimmunitet inducerad av AQP4-specifika Th17-celler.

Synnerven engagemang visades av Histologisk undersökning och av seriell OCT. AQP4-specifika och MOG-specifika Th17 celler både inducerad synnerven inflammation, som präglades av förekomst av mononukleära celler. AQP4-specifika Th17-celler som orsakats fiberoptiska perineuritis, inducerad MOG-specifika Th17-celler svår optikusneurit (figur 5). Använder seriell OCT, synnerven inflammation var uppenbart av svullnad och ökad inre retinal skikttjocklek (IRL) för klinisk sjukdom orsakas av AQP4-specifika eller MOG-specifika Th17-celler (figur 6). För AQP4 Th17-inducerad CNS autoimmunitet, IRL tjocklek återvände till baslinjen som möss återhämtat sig från klinisk sjukdom. Däremot persistens av EAE orsakas av MOG-specifika Th17 korresponderade med IRL gallring och, som vi visat tidigare17, var associerat med förlust av retinala ganglionceller.

Figure 1
Figur 1 : AQP4 p135-153 och p201-220 framkalla robust T cell spridning i AQP4- / - möss, men inte WT möss. Mössen vaccinerades s.c. med de angivna peptiderna i CFA. Elva dagar senare var lymfkörtlar bort och odlade sedan med antingen ingen antigen eller peptiden används för immunisering. Spridning mättes av 3H-tymidin inkorporering (medelvärde ± SEM, representativa 5 experiment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : AQP4-specifika T-celler från AQP4- / - möss utnyttja unika TCR repertoarer. AQP4- /- och WT mössen vaccinerades med de angivna peptiderna. Elva dagar senare lymfkörtlar avlägsnades och odlade med peptid används för immunisering. Celler skördats. TCR Vβ utnyttjande analyserades av flödescytometri (menar ± SEM, n = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Proinflammatoriska polarisering av givare AQP4-specifika T-celler. Elva dagar efter immunisering med AQP4 p135-153 eller p201-220, lymfkörtel celler skördas och odlade med peptiden används för immunisering i icke-polarisera villkor, Th1 - eller Th17-polarisera villkor. Th17 eller Th1 polarisering undersöktes av ICS och flöde flödescytometri för IL-17 eller IFN-γ, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Th17-polariserade AQP4-specifika T-celler inducerar förlamning i WT mottagarens möss. WT mottagarens möss fick 2 x 107 givaren Th17-polariserade AQP4 p135-153 eller p201-220-specifika T-celler från AQP4- / - möss. Th17-polariserade MOG-specifika T-celler fungerade som positiv kontroll. Resultaten är representativa för 8 experiment (n = 5/grupp). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : AQP4-specifika Th17-celler inducerar opticospinal inflammation i WT möss. Mottagarens möss fick 2 x 107 givare Th17 AQP4 p135-153 - eller p201-220-primade Th17 celler från AQP4- / - möss eller Th17 MOG p35-55-specifika celler och offrades 10 dagar senare. Ryggmärgen och synnerven vävnader var beredd och färgas med H & E/LFB ska utvärderas för tecken på inflammation och demyelinisering, respektive. Resultaten är representativa för 5 möss/grupp. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Synnerven inflammation framkallas av AQP4-specifika Th17-celler kan övervakas av längsgående retinal OCT. WT mottagarens möss fick 2 x 107 givaren Th17-polariserade AQP4 p201-220-specifika eller MOG p35-55-specifika T-celler på dag 0. De undersöktes med OCT på dag 0 (före administrering av T-celler) och sedan på dag 4, 7, 8, 9 10, 11 14 och 21. IRL tjocklek var uppmätta (medelvärde ± SEM). Statistik visar en jämförelse med naiva kontroll. Resultaten är representativa för 3 experiment (5 möss/grupp). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

AQP4 identifierades som det primära målet i NMO IgG i 20053. Sedan kändes det som att det skulle vara viktigt att upprätta en AQP4-riktade djurmodell av CNS autoimmunitet. En sådan modell kan vara användbart att undersöka hur AQP4-specifika T och B celler deltar i utveckling av CNS autoimmunitet och testa kandidat therapeutics för NMO. Även om identifiering av AQP4-specifika T-cell epitoper i vildtyp möss rapporterades först i 201013, T-celler som svarar på dessa epitoper inte orsaka klinisk eller histologisk sjukdom14,17. Oförmåga att skapa en modell av CNS autoimmunitet utifrån immun reaktivitet till AQP4 förblev en gåta fram till 2015 när Jones, et al. 25 upptäckte att givaren AQP4 p135-153-primade T-celler från AQP4- / - möss kunde orsakar kliniska och histologiska tecken på CNS autoimmunitet i WT möss. Av intresse förutspås AQP4 p135-153 för att binda MHC II (I-Ab) med hög affinitet17. Endast en andra AQP4 amino syra ordnar, 201-220, förutspås för att binda I-Ab med liknande hög affinitet. Faktiskt, vi konstaterade att AQP4 p135-153 och p201-220 båda framkalla robust spridning i AQP4- / -, men inte WT, möss. Här har vi visat hur man kan isolera och expandera encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - och p201-220-reaktiva T-celler från AQP4- / - möss. När överförs till WT mottagarens möss, inducerad givare AQP4-reaktivt Th17-celler förlamning, som åtföljdes av Mononukleära cellinfiltrat i ryggmärgen och synnerven. Afferenta visuella systemet skada är väl känt hos patienter med AQP4-seropositiva NMOSD26. Här, observerat vi att synnerven inflammation framkallas av AQP4-reaktivt och MOG-reaktivt Th17 celler var tydlig. Medan AQP4-specifika Th17-celler inducerad optisk perineuritis, inducerad MOG-specifika Th17-celler svår optikusneurit. Vi har också beskrivit de tekniker som används för att övervaka synnerven inflammation framkallas av AQP4-specifika och MOG-specifika T-celler med seriell OCT. Andra utredare bör nu kunna tillämpa de protokoll som beskrivs här för att föra fram sina egna studier som fokuserade på patogena mekanismer för ATCA.

Man kan enkelt undvika tre potentiella fallgropar i våra protokoll. Första, adoptiv överföring av ATCA kräver användning av AQP4-specifika T-celler från AQP4- / - givare möss. Specifikt, orsaka givare WT AQP4 p135-153-specifika T-celler inte ATCA i mottagarens WT möss. För det andra är det viktigt att utföra en ”vatten-test” med en droppe av peptid/CFA emulsionen före immunisering av AQP4- / - möss (protokoll steg 1,5). Emulsionen bör inte skingra i vatten när det är lämpligt för s.c. injektion. Om emulsionen skingrar, bör man blanda emulsionen gång, chill igen och upprepa vatten-testet. Slutligen inducerar aktiveras givare CNS antigen-specifika T-celler CNS autoimmunitet mer effektivt än vilar T-celler. En bör inspektera dessa kulturer under mikroskopet ljus före skörd givare T-cellerna för överföring. Snabbt delande celler kan bilda kluster, som är lätt identifieras. Också, när kulturer innehåller många aktiverade T-celler, media kan övergång från rosa till orange eller till gult, på grund av sänkning av pH. Man kan också bedöma aktivering av givare AQP4-primade lymfkörtel T celler för spridning av 3H-tymidin införlivande, som beskrivs i protokollet steg 3.

Vår upptäckt att de två patogena AQP4 T cell epitoper är (1) förutspådde att binda MHC II med hög affinitet och (2) framkalla potenta proliferativ svar i AQP4- / -, men inte WT, möss tyder på att T-celler som inriktning dessa bestämningsfaktorer är normalt kontrolleras av thymic negativa urval17. TCR repertoarer utnyttjas för erkännande av AQP4 p135-153 och p201-220 i AQP4- / - möss är unik (figur 2), vilket är också förenligt med klonal deletion medieras av thymic medullär epitelceller. Andra tolerogena mekanismer kan normalt avhålla immun Svaren till AQP4. Efter vår första rapport17visat en annan grupp också att AQP4 p201-220 innehåller en encephalitogenic T cell avgörande27. När α/β (TCRα- / -) T-cell-brist möss var rekonstitueras med AQP4- / - CD4+ T celler, var det möjligt att framkalla ett encephalitogenic AQP4-specifika T-cellssvar, men inte en AQP4-specifika humorala svar, vilket innebär att i WT möss AQP4-specifika B-cell svaren, liknar AQP4-specifika T-cell svar, är föremål för negativa urval. Förlust av ryggmärgen axoner och RGCs, som inte observerades i WT möss med ATCA inducerad av AQP4-specifika T-celler som är ensam, kan faktiskt kräva deltagande av patogena AQP4-specifika antikroppar. Det är tydligt att mus-modeller av AQP4 riktade CNS autoimmunitet kommer att fortsätta att utvecklas när vi lär oss mer om de tolerogena mekanismer som normalt styr AQP4-specifika T-celler och B-cell immunitet.

Andra modeller av AQP4 riktade CNS autoimmunitet pågår också utvecklade6,16,28,29,30. Var och en kan erbjuda fördelar för att studera särskilda aspekter som är relevanta för NMO patogenes. AQP4-specifika T-celler har identifierats i WT råttor6,16,29. Dessa AQP4-specifika T-celler orsakade histologiska förändringar i CNS autoimmunitet men liknar observationer i möss, WT råtta AQP4-specifika T-celler orsakar inte betydande tecken på klinisk sjukdom. Mekanismerna för tolerans begränsar T cell och B cell AQP4-specifika immunsvar i WT möss är därför också operativa hos råttor. Oavsett, bör man inte underskatta kraften i att använda musmodeller för att studera mekanismer som är involverade i patogenesen av sjukdomen. Rikedomen av knock-out, transgena och reporter möss kan vara fördelaktigt. Det bör också erkännas att flera grundläggande upptäckter i autoimmunitet har gjorts med hjälp av musen EAE modeller. Till exempel demonstration att T cell kloner som är specifika för ett self-antigen kan medla autoimmun sjukdom31,32, identifiering av rollen av T-cell costimulation i autoimmunitet33 och upptäckten av den utvecklings väg för Th17 differentiering34 beskrevs först med hjälp av musen EAE modeller. Använda musmodell av ATCA som vi har utvecklat, har en nu möjlighet att studera utveckling och reglering av patogena AQP4-specifika immunsvar in vivo som bör ge viktiga insikter relaterade till NMO patogenes.

Disclosures

S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green och R.A. Sobel rapportera inga upplysningar. S.S. Zamvil är biträdande redaktör för neurologi, Neuroimmunologi och Neuroinflammation och är medlem i den rådgivande styrelsen för det internationella samhället för Neuroimmunologi. Han har tjänstgjort på redaktionen av Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology och The Journal of Neurological Sciences, och har varit en stadga medlem av grant granskningskommittén för den nationella institut studera avsnitt och nationell multipelskleros samhället (NMSS) Health (NIH) kliniska Neuroimmunologi och hjärnan tumörer (CNBT). Han har fungerat som konsult och fått arvode från Biogen-Idec, EMD-Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech och Teva Pharmaceuticals, Inc., och har tjänstgjort eller serverar Data säkerhet övervakning styrelserna för Lilly, BioMS, Teva och Opexa Therapeutics. Dr. Zamvil erhåller för närvarande, grant forskningsstöd från NIH, NMSS, The Maisin Foundation, Biogen och Celgene.

Acknowledgements

Stöd gavs till S.S.Z. av National Institute of Health (RO1 AI073737 och RO1 NS092835-01), nationell multipelskleros samfund (RG 4768, RG 5179 och RG 5180), Maisin Foundation och Guthy Jackson Charitable Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15, (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364, (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202, (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (1), 62 (2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66, (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66, (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7, (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24, (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2, (4), 110 (2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72, (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5, (11), 15050 (2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6, (1), 16083 (2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122, (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130, (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018 (2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86, (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25, (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, (2), 22 (2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210, (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28 (2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72 (2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4, (1), 82 (2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13, (1), 275 (2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317, (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162, (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80, (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, (7090), 235-238 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics