Neuromyelitis Optica के लिए विशिष्ट टी कोशिकाओं द्वारा चूहों में पक्षाघात और दृश्य प्रणाली चोट की प्रेरण Aquaporin-4

* These authors contributed equally
Immunology and Infection
 

Summary

यहां, हम WT चूहों में AQP4-/- चूहों से aquaporin-4 (AQP4)-विशिष्ट टी कोशिकाओं के हस्तांतरण के द्वारा पक्षाघात और opticospinal सूजन पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इसके अलावा, हम प्रदर्शन कैसे धारावाहिक ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग करने के लिए दृश्य प्रणाली में शिथिलता की निगरानी ।

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Sagan, S. A., Cruz-Herranz, A., Spencer, C. M., Ho, P. P., Steinman, L., Green, A. J., Sobel, R. A., Zamvil, S. S. Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (126), e56185, doi:10.3791/56185 (2017).

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Abstract

हालांकि यह मान्यता है कि aquaporin-4 (AQP4)-विशिष्ट टी कोशिकाओं और एंटीबॉडी neuromyelitis optica (NMO) के रोगजनन में भाग लेते हैं, एक मानव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) स्व-प्रतिरक्षित demyelinating रोग, दोनों के साथ एक AQP4-लक्षित मॉडल का निर्माण सीएनएस-प्रतिरक्षण की नैदानिक और histologic अभिव्यक्तियां चुनौतीपूर्ण साबित हुई हैं । जंगली प्रकार के प्रतिरक्षण (WT) AQP4 पेप्टाइड्स के साथ चूहों टी सेल प्रसार, हालांकि उन टी कोशिकाओं भोली प्राप्तकर्ता चूहों को रोग हस्तांतरण नहीं कर सकता था । हाल ही में, दो उपंयास AQP4 टी सेल epitopes, पेप्टाइड (पी) 135-153 और p201-220, की पहचान की गई जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन AQP4 में AQP4-कमी (AQP4-/) चूहों, इन epitopes के लिए टी सेल जेट सुझाव आम तौर पर thymic द्वारा नियंत्रित है नकारात्मक चयन । AQP4-/- Th17 p135-153 या p201-220 के लिए प्राइमेड टी कोशिकाओं-प्राप्तकर्ता WT चूहों में पक्षाघात प्रेरित, कि रीढ़ की हड्डी और ऑप्टिक नसों की मुख्य रूप से leptomeningeal सूजन के साथ जुड़ा हुआ था । ऑप्टिक नसों और भीतरी रेटिना परतों (IRL) की भागीदारी के आसपास सूजन धारावाहिक ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) में परिवर्तन द्वारा प्रकट किया गया । यहाँ, हम AQP4-लक्षित सीएनएस प्रतिरक्षण (ATCA), जो अब तंत्र है कि रोगजनक AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के विकास की अनुमति और कैसे वे बी के साथ सहयोग कर सकते हैं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है के इस नए vivo में मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण को समझाने कक्षों में NMO रोगजनन ।

Introduction

Neuromyelitis optica (NMO) एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) स्व-प्रतिरक्षित भड़काऊ demyelinating रोग है जो पक्षाघात और दृश्य हानि के आवर्तक प्रकरणों को स्थायी neurologic विकलांगता के लिए अग्रणी का कारण बनता है1. NMO वर्तमान में मुख्य रूप से माना जाता है एक विनोदी स्व-प्रतिरक्षित रोग2 के रूप में यह एंटीबॉडी के साथ जुड़ा हुआ है (Igs) लक्ष्यीकरण aquaporin-4 (AQP4), एक पानी चैनल astrocytes पर प्रचुर मात्रा में व्यक्त3,4. हालांकि, सीएनएस सूजन AQP4 ़5,6के सीएनएस प्रवेश के लिए एक शर्त है । इस प्रकार, यह अकेले विरोधी AQP4 Igs के हस्तांतरण द्वारा NMO का एक मॉडल स्थापित करने के लिए संभव नहीं किया गया है । निष्कर्ष है कि (1) रोगजनक AQP4-NMO रोगियों में विशिष्ट Igs है IgG11,2, एक टी सेल-निर्भर ़ उपवर्ग7 (2) टी कोशिकाओं NMO घावों में पहचान की जाती है8,9 (3) NMO जुड़ा हुआ है कुछ MHC द्वितीय जीन के साथ (उदा. एचएलए-DR17 (DRB1 * ०३०१))10, और (4) भड़काऊ AQP4-प्रतिक्रियाशील डॉ प्रतिबंधित Th17 कोशिकाओं NMO रोगियों में विस्तार कर रहे हैं11,12 सभी इंगितकरतेहैं कि AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं एक महत्वपूर्ण भूमिका है मे NMO रोगजनन । इस प्रकार, यह कैसे AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं NMO रोगजनन में योगदान कर सकते है निर्धारित करने के लिए पशु मॉडल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

कई साल पहले, मल्टीपल AQP4 टी सेल epitopes जंगली में पहचाने गए प्रकार (WT) चूहों13,14 और चूहों15। हालांकि यह देखा गया कि AQP4-प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं भोली प्राप्तकर्ता चूहों में opticospinal सूजन पैदा कर सकता है15,16, सीएनएस रोग के महत्वपूर्ण नैदानिक लक्षण नहीं देखा गया. इसी प्रकार, AQP4 टी सेल epitopes14,17, या भड़काऊ टी कोशिकाओं के स्थानांतरण उन निर्धारकों को लक्ष्यीकरण के साथ WT चूहों के प्रत्यक्ष प्रतिरक्षण17, नैदानिक लक्षण या histologic कारण नहीं था सीएनएस प्रतिरोधक क्षमता का सबूत ।

हाल ही में, यह देखा गया कि C57BL/6 AQP4-कमी (AQP4-/) चूहों के साथ AQP4 पेप्टाइड (पी) 135-153 या p201-220 के प्रतिरक्षण, दो निर्धारकों ने उच्च अपनत्व के साथ MHC द्वितीय (I-Ab) बाँधने की भविष्यवाणी की18, मजबूत सीडी + टी सेल प्रतिक्रियाएं17। इसके विपरीत, इन दो पेप्टाइड्स WT चूहों में केवल मामूली प्रफलन प्रतिक्रियाओं में लाना. इसके अलावा, टी सेल रिसेप्टर (TCR) AQP4 से टी कोशिकाओं द्वारा इन निर्धारकों की पहचान के लिए प्रयोग की जाने वाली प्रदर्शनियों-/ चूहों अद्वितीय था । सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों AQP4 के टी सेल मान्यता thymic नकारात्मक चयन द्वारा विनियमित है कि संकेत मिलता है. AQP4 p135-153-या p201-220-AQP4 से विशिष्ट Th17 कोशिकाओं-/ दाता चूहों भोली प्राप्तकर्ता WT चूहों के लगभग १००% में पक्षाघात प्रेरित; यह टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और monocytes के opticospinal घुसपैठियों के साथ जुड़ा हुआ था । धारावाहिक opticospinal जुटना टोमोग्राफी (OCT) गतिशील दृश्य प्रणाली की भागीदारी का प्रदर्शन किया । टी कोशिका मध्यस्थता AQP4-लक्षित सीएनएस प्रतिरक्षण (ATCA) पक्षाघात और दृश्य प्रणाली चोट से बरामद के साथ चूहों । myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन द्वारा प्रेरित EAE के विपरीत (मोग) p35-55-विशिष्ट टी कोशिकाओं, जो लगातार नैदानिक रोग के लिए नेतृत्व किया, अकेले टी कोशिकाओं द्वारा प्रेरित ATCA axonal नुकसान या रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs) में कमी के साथ संबद्ध नहीं था । हमारे परिणाम स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि वहां कई रोगजनक AQP4 टी कोशिका निर्धारकों हैं । ATCA के इस नए मॉडल रोगजनक AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के विकास को नियंत्रित करने के तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, सीखने कैसे उन कोशिकाओं सीएनएस सूजन के लिए प्रेरित है और वे AQP4-विशिष्ट बी कोशिकाओं और एंटीबॉडी के साथ सहयोग कर सकते हैं NMO को बढ़ावा देने के लिए रोगजनन .

वर्तमान रिपोर्ट में, हम टी सेल प्रेरित ATCA के लिए प्रेरित और मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन । हम प्रतिरक्षण के लिए इस्तेमाल तकनीक के साथ शुरू, टी सेल संस्कृति और Th17 ध्रुवीकरण रोगजनक AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए, प्रवाह cytometry विश्लेषण ध्रुवीकरण और उन टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए. हम तो नैदानिक और histologic रोग और सीरियल OCT के उपयोग के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में दृश्य प्रणाली की चोट की निगरानी का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन ।

Protocol

< p class = "jove_content" > कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रयोगात्मक दिशानिर्देशों के अनुपालन में सभी पशु प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । C57BL/6 (एच-2 बी ) मादा चूहे, 8 सप्ताह की आयु, खरीदे गए और C57BL/6 AQP4 -/- चूहों द्वारा प्रदान किए गए A. Verkman.

< p class = "jove_title" > 1. AQP4 पेप्टाइड्स के साथ चूहों का प्रतिरक्षण

  1. तैयार पूर् Freund & #39; स सहायक () काम स्टॉक.
    1. बारीक पीस एक शुष्क तैयारी M. तपेदिक (H37Ra) एक मोर्टार और मूसल का प्रयोग ।
    2. Add भगाए H37Ra to अपूर्ण Freund & #39; s सहायक 4 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए । 6 महीनों तक के लिए 4 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. भंग lyophilized प्रतिजन (एजी) AQP4 पेप्टाइड में फॉस्फेट बफर (पंजाब) 1 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए । बनाए रखने पर 4 & #176; ग या पर आइस.
  3. 2 luer-लॉक सिरिंजों की असेंबली तैयार करते हैं, जिसमें एक टोंटी के साथ शामिल किया गया है, जिसमें
    1. 2 पुरुष टोंटी-ताला कनेक्शन के साथ एक 3 तरह नायलॉन luer के लिए सवार बिना एक ग्लास luer-लॉक सिरिंज देते हैं । सिरिंज की तरफ लीवर स्विच करके टोंटी को बंद कर दीजिये. सिरिंज के खुले अंत स्थिति, सिरिंज एक परीक्षण ट्यूब के रूप में कार्य करने की अनुमति. जोड़ा स्थिरता के लिए एक ट्यूब रैक में इस जगह ।
    2. भंवर काम कर रहे शेयर और एजी समाधान । ओपन सिरिंज के लिए एक 1:1 मात्रा पेप्टाइड/ २०० & #181; र, एजी (4 x ५० & #181; l) के l प्रति माउस की आवश्यकता है ।
      नोट: आमतौर पर, लगभग 1 मिलीलीटर की तैयारी टोंटी में खो जाती है, जो प्रतिरक्षण के लिए उपलब्ध राशि को कम कर देगा । इसलिए, यह आवश्यक कुल मात्रा की गणना में शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      उदाहरण: 5 चूहों के प्रतिरक्षण के लिए: (२०० & #181; L/पशु x 5 पशु) + 1 मिलीलीटर अतिरिक्त मात्रा = 2 मिलीलीटर कुल की आवश्यकता/
    3. डालने के लिए सिरिंज में गिलास सवार और जब यह जगह में पकड़े, सिरिंज इतना उलटा है कि टोंटी ऊपर की ओर उन्मुख है. अप्रयुक्त महिला कनेक्शन के लिए टोंटी लीवर स्विच । सावधानी से ग्लास सवार करने के लिए दबाव लागू करने के लिए सिरिंज से अतिरिक्त हवा को हटाने के लिए. तरल टोंटी के दूसरे पुरुष luer-ताला कनेक्शन भरता है.
    4. एक दूसरे ग्लास सिरिंज (पूरी तरह से डाला सवार) टोंटी के दूसरे पुरुष luer-ताला कनेक्शन करने के लिए संलग्न । यह संभव के रूप में कम अतिरिक्त हवा के रूप में युक्त एक टोंटी के साथ जुड़े 2 ग्लास सीरिंज की एक बंद प्रणाली होना चाहिए.
    5. एक पायस बनाने के लिए, plungers धक्का के बारे में 2 मिनट के लिए 2 सीरिंज के बीच वैकल्पिक रूप से तरल पास से मिश्रण द्वारा मिक्स । लगभग 10 मिनट के लिए बर्फ पर सीरिंज ठंडा और जब तक वहां की तैयारी की चिपचिपापन में एक स्पष्ट परिवर्तन है मिश्रण दोहराएं , एक बहुत कड़ा, सफेद पायस में जिसके परिणामस्वरूप । 4 & #176 पर इमल्शन युक्त सिरिंजों को फ्रिज में रखें, C या बर्फ पर बनाए रखना.
  4. एक गिलास luer के लिए पायस के सभी स्थानांतरण-लॉक सिरिंज, खाली गिलास सिरिंज को हटाने और इंजेक्शन के लिए एक 1 मिलीलीटर luer-लॉक सिरिंज के साथ इसे बदलने. पायस के साथ नई सिरिंज भरें, इसे टोंटी से निकालें और एक सुई (25G x 5/8) को अटैच करें ।
  5. & #34; जल-परीक्षण & #34; विसंगतिन के लिए इमल्शन । पायस की एक बूंद पानी की एक छोटी सी डिश में निष्कासित । इमल्शन नहीं फैलाना चाहिए, यह दर्शाता है कि यह इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है ।
    1. अगर इमल्शन फैलाता है तो यह इंजेक्शन के लिए तैयार नहीं है; लिक्विड को वापस ग्लास सीरिंज में ट्रांसफर करें और मिक्स करके जारी रखें और फिर जब तक इमल्शन कड़ा न हो जाए तब तक ठंडा कर लें ।
    2. उचित स्थिरता प्राप्त किया गया है जब तक कि फिर से पायस का परीक्षण.
  6. इंजेक्षन दाता AQP4 -/ चूहों एस॰सी॰ पेप्टाइड युक्त पायस के साथ चमड़े के नीचे (AQP4) । प्रत्येक माउस प्राप्त करता है 4 x ५० & #181; l एस॰सी॰ इंजेक्शन (२०० & #181; l कुल (१०० & #181; g पेप्टाइड)). 4 साइटों को पेट के निचले, जो वंक्षण लिम्फ नोड्स (ln) में नाली, और छाती की दीवार के दोनों पक्षों के प्रत्येक बगल, जो कांख LN में नाली के लिए औसत दर्जे के दोनों पक्षों में शामिल हैं । दत्तक हस्तांतरण प्राप्तकर्ता माउस प्रति 1-2 प्रतिरक्षित दाता चूहों की आवश्यकता होगी ।
< p class = "jove_title" > 2. टी सेल संस्कृति और भड़काऊ टी सेल ध्रुवीकरण

  1. 10-12 दिनों के बाद प्रतिरक्षण, चूहों से LN इकट्ठा ।
    1. एक आइस ट्रे में, तैयार ६० mm पेट्री व्यंजन एक सेल छलनी के साथ लगे (मेष आकार ७० & #181; एम) और 10% गर्मी के साथ ठंडा RPMI मीडिया युक्त-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और १०० U/एमएल पेनिसिलिन-१०० & #181; g/ml streptomycin (कलम-strep) (RFPS).
    2. सह 2 , ग्रीवा विस्थापन के बाद के लिए जोखिम द्वारा चूहों Euthanize । ७०% इथेनॉल में चूहों विसर्जित कर दिया और फिर एक विच्छेदन बोर्ड के लिए प्रत्येक footpad पिन.
    3. एक midline त्वचा गर्दन को कमर से चीरा और प्रत्येक पैर नीचे कट । त्वचा को दूर से खींच कर उस पर tautly और पिन करें । टुकड़े वंक्षण और कांख LN और RFPS युक्त पेट्री पकवान, बर्फ पर में जगह है । < सुप वर्ग = "xref" > १९
    4. दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों के लिए, एक ही प्रतिरक्षण समूह के भीतर सभी जानवरों से LN गठबंधन. त्यात प्रवाह cytometric िरा के वि & #946; उपयोग, अलग अलग जानवरों से LN पृथक ।
  2. एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब युक्त RFPS पर LN युक्त सेल छलनी जगह है । एक बाँझ 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के सपाट अंत का उपयोग करने के लिए छलनी के माध्यम से LN कोशिकाओं प्रेस, RFPS के 20-30 मिलीलीटर के साथ धोने के लिए कोशिकाओं की वसूली की सुविधा । संस्कृति के लिए समय तक प्रसंस्करण भर में बर्फ पर LN कोशिकाओं को बनाए रखने.
  3. धो दो बार, 5 मिनट के लिए ३९३ x जी में केंद्रापसारक । दूसरा धोने के बाद, टी सेल मीडिया (TCM) में LN कोशिकाओं reसस्पेंड । TCM 10% गर्मी के साथ RPMI शामिल है-निष्क्रिय FBS, २९२ & #181; जी/एमएल एल-glutamine, ११० & #181; जी/एमएल सोडियम पाइरूवेट, और ५५ & #181; एम 2-mercaptoethanol और पेन-strep. आमतौर पर, प्रति दाता माउस 5 मिलीलीटर TCM का एक खंड का उपयोग किया जाता है ।
  4. LN कक्षों की गणना
  5. । अपेक्षित उपज लगभग 3-6 x 10 7 LN कोशिकाओं प्रति प्रतिरक्षित माउस दाता है । अलग सेट 3-4 x 10 एक प्रसार परख के लिए 6 (नीचे धारा 3 देखें) ।
  6. ने दत्तक अंतरण (धारा 6) के लिए संस्कृतियों का ध्रुवीकरण किया ।
    1. 5 x 10 6 LN कोशिकाओं के प्रति एमएल 10 & #181 के साथ एक Th17 ध्रुवीकरण संस्कृति तैयार करें; g/एमएल एजी, 20 एनजी/एमएल संयोजक माउस interleukin (IL)-23 और 10 एनजी/एमएल संयोजक माउस IL-6 में TCM.
    2. वैकल्पिक रूप से, Th1 ध्रुवीकरण के लिए, 10 के साथ 5 x 10 6 LN कोशिकाओं की एक संस्कृति तैयार & #181; जी/एमएल एजी और 10 एनजी/एमएल संयोजक माउस IL-12 TCM.
    3. में
    4. एक 12-अच्छी तरह से थाली में ध्रुवीकरण संस्कृति मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर (1 x 10 7 कोशिकाओं) जोड़ें । 2-4 दाता चूहों से LN कोशिकाओं १ १२-अच्छी तरह से थाली भरना होगा । ३७ & #176 में एक humidified मशीन में संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, 5% सह 2 के साथ ७२ h.
    5. के लिए ग
    6. नेत्रहीन ४८ h पर सक्रियण के लिए संस्कृति में LN कोशिकाओं की जांच करें और ७२ h. सक्रिय कोशिकाओं व्यापक समूहों के रूप में और टी कोशिकाओं आकार में वृद्धि होगी, अधिक pleomorphic बनने । चयापचय में वृद्धि मीडिया में पीएच का एक कम करने का कारण होगा, आड़ू से नारंगी के लिए बदल रहा है । यदि पीएच काफी कम करने के लिए मीडिया पीला बारी है, ताजा TCM के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए शेष 24 घंटे में कोशिकाओं को विषाक्तता को रोकने के
    7. स्थानांतरण के लिए धारा 6 के आगे बढ़ें । ध्रुवीकरण दक्षता intracellular cytokine धुंधला (आईसीएस) द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, descr के रूप मेंibed में धारा 5.
  7. सतह V & #946 के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत चूहों से LN का उपयोग संस्कृतियों की स्थापना की, अभिव्यक्ति (धारा 4).
    1. तैयार 5 x 10 6 LN कोशिकाओं के साथ प्रति एमएल 10 & #181; g/एमएल एजी TCM.
    2. में
    3. 2 मिलीलीटर (1 x 10 7 कोशिकाओं) की संस्कृति के प्रति अच्छी तरह से एक 12-अच्छी तरह से थाली में जोड़ें । संस्कृतियों ३७ & #176 में एक humidified मशीन में बनाए रखा जाना चाहिए, 5% सह के साथ सी 2 10 दिनों के लिए । धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।
< p class = "jove_title" > 3. प्रसार परख

< p class = "jove_content" > नोट: यह धारा २.४ से जारी है.

  1. एक ट्यूब में LN कोशिकाओं की 3-4 मिलीलीटर तैयार, 2 x 10 6 TCM में एमएल प्रति कोशिकाओं पर ।
  2. धीरे ट्यूब कई बार पलटने से कोशिकाओं को मिलाएं, और फिर एक बाँझ गर्त में स्थानांतरण ।
  3. एक मल्टीचैनल pipettor को प्लेट १०० & #181 का उपयोग करें; प्रति अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे ऊतक संस्कृति प्लेट में कोशिकाओं के एल । आमतौर पर, 4 एजी सांद्रता और एक नहीं एजी संदर्भ के तपसिल परीक्षण के लिए 15 कुओं प्लेट ।
  4. TCM में विभिंन सांद्रता पर एजी पतला, आमतौर पर ८०, 20, 5, 1 और 0 & #181; g/एमएल (2x स्टॉक के लिए) । Add १०० & #181; तपसिल में प्रत्येक एकाग्रता के ४०, 10, २.५ के अंतिम एकाग्रता के लिए एल । ०.५ व 0 & #181; g/एमएल. ३७ & #176 पर लगभग ७२ ज के लिए मशीन; C.
    नोट: कदम ३.७ के माध्यम से ३.५ रेडियोधर्मी सामग्री शामिल है । उचित उपयोग, निगरानी और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान का आयोजन किया जाना चाहिए, संस्थागत और सरकारी नियमों के अनुसार.
  5. 3 H-thymidine (४० & #181 के एक काम स्टॉक समाधान तैयार; Ci/एमएल) जोड़कर 1 एमसीआई 3 H-thymidine को 25 एमएल RPMI, और इस पर दुकान 4 & #176; सी. प्लास्टिक ०.५ मिलीलीटर एक बाँझ गर्त में काम समाधान की.
  6. Add 25 & #181; L के 3 H-thymidine (1 & #181; Ci) प्रति अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर । ३७ & #176 पर एक अतिरिक्त 18 एच के लिए मशीन; C.
  7. एक ग्लास फ़िल्टर चटाई पर फसल कोशिकाओं को एक ९६-अच्छी तरह से सेल हार्वेस्टर का उपयोग कर और ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला । सूखने के बाद, 5 मिलीलीटर द्रव्य द्रव के साथ एक प्लास्टिक नमूना बैग में फिल्टर चटाई सील । एक अच्छी तरह से एक जुटाना काउंटर का उपयोग करने में रेडियोधर्मिता उपाय ।
< p class = "jove_title" > 4. सेल सरफेस के लिए फ्लो Cytometry एनालिसिस TCR V & #946; एक्सप्रेशन

< p class = "jove_content" > नोट: यह धारा २.६ से जारी है. माउस के लिए एंटीबॉडी TCR v & #946; 2, 3, 4, ५.१ और ५.२, 6, 7, ८.१ और ८.२, ८.३, 9, 10b, 11, 12, 13, 14, और 17a के परीक्षण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है TCR v & #946; अभिव्यक्ति.

TCR V & #946 का पता लगाने के लिए
  1. ;, कई बार pipetting करके कल्चर प्लेट से टी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकें और एक ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित.
  2. FACS बफर (अमेरिकन प्लान) के साथ धो 2% FBS, ०.१% सोडियम azide और पंजाब में 2 मिमी EDTA युक्त ।
  3. 1 x 10 5 के घनत्व पर एक V-नीचे ९६-well थाली में स्थानांतरण कोशिकाओं के लिए 3 x 10 6 कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से । यदि संपूर्ण वि & #946; पेनल का परीक्षण किया जा रहा है, तो कक्षों को एकाधिक कुओं में वितरित किया जाना चाहिए (एक ठीक प्रति v & #946; परीक्षण किया जा रहा है).
  4. एक जीवित/मृत व्यवहार्यता डाई के साथ दाग द्वारा प्रवाह cytometric विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को बाहर निकालता है, जो नि: शुल्क अमीन द्वारा उजागर कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया करता है । का पालन करें निर्माता & #39; s व्यवहार्यता डाई में केंद्रापसारक और resuspension के लिए निर्देश । बर्फ पर 10-20 min. the सेल धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान, प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा और बर्फ पर रखने के लिए गर्मी ।
  5. के बाद, FB में एक बार प्लेट धो लें । का पता लगाने के लिए TCR v & #946;, कोशिकाओं को सस्पेंड १०० & #181; सीडी के लिए एंटीबॉडी के 1:100 कमजोर पड़ने वाले FB के एल (क्लोन RM4-5) और TCR V & #946;. बर्फ पर 15-60 मिनट के लिए मशीन
  6. को FB में एक बार प्लेट वॉश करें और २०० & जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें #181; 4% paraformaldehyde के एल पंजाबियों में पतला । बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन । अमेरिकन प्लान में प्लेट धोने और प्रवाह cytometry.
  7. द्वारा विश्लेषण
< p class = "jove_title" > 5. प्रवाह Cytometric विश्लेषण के लिए Intracellular Cytokine उत्पादन

  1. के लिए Intracellular Cytokine धुंधला (आईसीएस), टी सेल संस्कृतियों का इलाज के साथ एक 1:1000 कमजोर पड़ने के साथ प्रोटीन परिवहन अवरोध करनेवाला एजेंट (जैसे, GolgiPlug) TCM, 4 ज में आईसीएस से पहले को रोकने के लिए cytokine स्राव. उस समय, ५० एनजी के साथ टी कोशिकाओं को सक्रिय करें/एमएल phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) और ५०० एनजी/एमएल ionomycin आदेश में प्रोटीन उत्पादन प्रेरित करने के लिए ।
  2. बाद संस्कृति के 4 ज पर ३७ & #176; ग, pipetting ऊपर और नीचे द्वारा संस्कृति प्लेट से कोशिकाओं को हटाना, और एक केंद्रापसारक ट्यूब (15 या ५० एमएल) को हस्तांतरण ।
  3. FB के साथ
  4. धो लें । अमेरिकन प्लान में कोशिकाओं reसस्पेंड और 5 एक्स 10 5 के घनत्व पर एक V-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण के प्रति अच्छी तरह से 3 x 10 6 कोशिकाओं ।
  5. ऊपर वर्णित के रूप में व्यवहार्यता डाई के साथ दाग कोशिकाओं (धारा ४.२) । इस मशीन के बाद, FB में एक बार प्लेट धो लें ।
  6. सतह मार्करों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी जोड़ने के रूप में इस प्रकार है:
    1. सतह मार्करों का पता लगाने के लिए, १०० & #181 में कोशिकाओं को निलंबित; एंटीबॉडी के लिए सीडी के 1:100 कमजोर पड़ने वाले FB के एल (क्लोन RM4-5).
    2. वैकल्पिक रूप से, B220 के लिए एंटीबॉडी शामिल (क्लोन 30-F11) और CD11b (क्लोन M1/70) एक 1:100 कमजोर पड़ने पर बी कोशिकाओं और monocytes/मैक्रोफेज, क्रमशः के गेटिंग में सुधार होगा । सामान्यत: पीई-Cy7 एंटी-सीडी, FITC एंटी-B220 और PerCP-cy 5.5 एंटी-CD11b काम बखूबी करते हैं । एंटीबॉडी/fluorochrome conjugates का चुनाव विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रवाह cytometer के विन्यास के द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए, और एंटीबॉडी के इष्टतम सांद्रता empirically.
    3. निर्धारित किया जाना चाहिए
    4. बर्फ पर 15-60 मिनट के लिए मशीन ।
  7. को FB के साथ प्लेट वॉश कर लें और कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड कर २०० & #181; निर्धारण के एल/बर्फ पर 20 मिनट के लिए Permeabilization समाधान/ इससे कोशिकाएं ठीक होंगी और झिल्ली permeabilize ।
  8. के दौरान कोशिका झिल्ली के permeabilization को बनाए रखने के लिए intracellular का प्रयोग करें, पर्म/वॉश बफर (पीडब्लू) (10x स्टॉक से पतला 1:10) के बजाय अमेरिकन प्लान के उपयोग । कुएँ को धोकर २०० में & #181; पीडब्लू के एल.
  9. आईसीएस के लिए
  10. , इंटरफेरॉन (IFN) के लिए एंटीबॉडी के एक 1:100 कमजोर पड़ने तैयार-& #947; और IL-17A 1x पीडब्लू का उपयोग कर । एक विकल्प है APC विरोधी IFN-& #947; (क्लोन xmg 1.2) और पीई एंटी-आईएल-17A (क्लोन eBio17B7) जो अच्छी तरह से काम करता है । १०० में कोशिकाओं reसस्पेंड & #181; intracellular एंटीबॉडी कॉकटेल के एल और फिर कम से 15 मिनट के लिए मशीन । यह भी संभव है पर रात भर दाग जारी रखने के लिए 4 & #176; C.
  11. धो द कुएं में २०० & #181; पीडब्लू के एल और cytometry के लिए FB में सस्पेंशन.
  12. समानांतर में
  13. , एक दाग नमूना तैयार (अमेरिकन प्लान में एंटीबॉडी के बिना सेल) डिटेक्टर वोल्टेज का अनुकूलन करने के लिए, और प्रत्येक व्यक्ति fluorochrome के लिए एक दाग नमूने (यानी, कोशिकाओं या मुआवजा मोती केवल एक ही एंटीबॉडी/fluorochrome के साथ सना हुआ) निर्धारित मुआवजा spillover मान.
  14. का उपयोग एक प्रवाह cytometer, मोल & #8805; १०,००० कक्ष (ईवेंट्स), गेटिंग पर व्यवहार्य (LIVE/मृत-ऋणात्मक) सीडी + कक्ष । टी कोशिकाओं के सटीक गेटिंग सुनिश्चित करने के लिए, B220 + और CD11b + कोशिकाओं (बी कोशिकाओं और monocytes/मैक्रोफेज, क्रमशः) को शामिल न करें । सीडी + टी सेल उपजनसंख्या के भीतर, IFN-& #947; (Th1 वंश) या इल-17A (Th17 वंश) के व्यक्त कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें ।
< p class = "jove_title" > 6. रोगजनक AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के दत्तक स्थानांतरण

< p class = "jove_content" > नोट: यह चरण २.५ अनुभाग से इस प्रकार है: टी सेल संस्कृति और भड़काऊ टी सेल ध्रुवीकरण.

  1. 12-अच्छी तरह से प्लेटों से pipetting ऊपर और नीचे के लिए विस्थापित करने के लिए, और उंहें एक ५० मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरित करने के लिए ठीक हो । माइंजेक्शन तक बर्फ पर intain.
  2. कोशिकाओं गिनती, ठंडे पंजाब में दो बार धोने, और 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी/ आम तौर पर, घंटे के भीतर कोशिकाओं इंजेक्षन ।
  3. धीरे से घूमता है और इंजेक्शन के समय में एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए स्थानांतरण द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं । प्रशासन २०० & #181; कोशिकाओं के एल (2 x 10 7 ) नसों में (i.v.) प्रत्येक माउस के लिए, पूंछ नस के माध्यम से.
  4. प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस इंजेक्षन आईएफसआई के साथ २०० एनजी के B. कुक्कुर विष पतला में २०० & #181; पंजाब के एल उस दिन और 2 दिन बाद । नैदानिक रोग के लक्षण के लिए दैनिक चूहों की निगरानी.
< p class = "jove_title" > 7. ATCA

    के नैदानिक आकलन
  1. सीएनएस प्रतिरोधक क्षमता के नैदानिक लक्षण के लिए दैनिक प्राप्तकर्ता चूहों की जांच । सामान्य तौर पर, चूहों AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के दत्तक स्थानांतरण के बाद 5-8 दिनों में प्रतिरक्षा सीएनएस के लक्षण दिखाएगा. चूहों मस्तिष्क संबंधी रोग के नैदानिक लक्षण दिखाई देगा. यह एक भोली माउस पर मूल्यांकन प्रदर्शन करने के लिए एक माउस की सामांय क्षमता को परिभाषित करने के लिए उपयोगी है ।
  2. पूंछ टोन के नुकसान के लिए चूहों का मूल्यांकन । पकड़ो चूहों धीरे पूंछ के आधार पर और ईमानदार लिफ्ट । एक पूंछ कि droops लगातार पूंछ टोन के नुकसान के रूप में वर्णित है (1 का स्कोर) । पूंछ टोन के नुकसान अक्सर नैदानिक रोग का पहला संकेत है ।
  3. एक सपाट सतह पर अपनी पीठ पर माउस रखकर लेकन पलटा के लिए
  4. परीक्षण. धीमा लेकन truncal समन्वय का संकेत है (२ का स्कोर). क न & #239; जें माउस पूरी तरह से किसी भी इसे अपनी पीठ पर जगह की कोशिश का विरोध करेंगे, तो सही करने की क्षमता में किसी भी मंदी एक शिथिलता के रूप में बनाए है । यह इस पलटा के लिए 3-4 बार माउस का परीक्षण करने के लिए विशिष्ट है ।
  5. मूल्याकंन आसन तथा ambulation । चूहों को कम करने या ambulation के दौरान कूल्हों की घसीट में जिसके परिणामस्वरूप मुद्रा में परिवर्तन दिखाने के लिए शुरू (२.५ का स्कोर) । monoplegia में इसके अलावा रोग परिणाम, एक हिंद अंग (३.० का स्कोर) और paraplegia, दोनों हिंद अंगों (३.५ के स्कोर) के पूर्ण पक्षाघात के पूरा पक्षाघात । उदारवादी quadraparesis, सभी चार अंगों की कमजोरी, बहुत धीमी गति से आगे आंदोलन में परिणाम (4 का स्कोर). गंभीर quadraparesis लगभग कोई आगे आंदोलन की अनुमति देता है (४.५ का स्कोर) । अंत में, गंभीर बीमारी के साथ वे मरणासन्न या मरो बन सकते हैं (5 का स्कोर).
  6. प्रशासन कि तरल पदार्थ या ठोस खाद्य प्राप्त करने की क्षमता खो चूहों को खारा आईएफसआई & #160 में 5% ग्लूकोज की 1 मिलीलीटर; वैकल्पिक रूप से, द्रव जेल कप, उच्च गरमी जेल और बेकन बुद्धू के साथ पूरकता का उपयोग करने के लिए निर्जलीकरण और भोजन के अभाव प्रतिक्रिया । Euthanize मरणासन्न चूहों.
< p class = "jove_title" > 8. ऊतक तैयार करने और प्रोटोकॉल

  1. Anesthetize चूहों के साथ १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 10 मिलीग्राम/xylazine, और फिर एक विच्छेदन बोर्ड के लिए प्रत्येक footpad पिन ।
  2. छाती खोल
  3. , दिल को उजागर । रक्त बहिर्वाह की अनुमति के लिए जिगर काटकर । एक miniflow चर गति पंजाबियों और 10% formalin के लिए एक अलग जलाशय का उपयोग कर पंप के टयूबिंग के लिए एक तितली सुई देते हैं । दिल की बाईं निलय में सुई डालें और पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ perfuse, 10% formalin के 25 मिलीलीटर के बाद.
  4. को सिर से हटा कर फिर आँखें फेर लें । प्रक्रिया आंखें और रेटिना पहले वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > २० . आंख कुर्सियां भर में कटौती, नाक पर कैंची डालने और खोपड़ी पूर्वकाल में कटौती करने के लिए प्रत्येक पक्ष पर पीछे ।
    1. खोपड़ी को हटा दें, ऑप्टिक नसों का पर्दाफाश, 2 फोम पैड के बीच एक कैसेट में ऑप्टिक chiasm और जगह काट ।
    2. में विसर्जित कर दिया 10% formalin (24 एच), और फिर ५०% इथेनॉल (24 एच) और फिर ७०% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण.
  5. ब्रेन और स्पाइनल कॉलम और प्लेस को 10% formalin में हटा दें । कोरोनरी विमान में क्रमिक धारा दिमाग; sagittal में धारा रीढ़ की हड्डी (लगभग आधा) और धारावाहिक कोरोनरी विमानों (लगभग 20 पार-माउस प्रति वर्गों) ।
  6. प्रक्रिया सीएनएस नमूने नियमित रूप से आयल embedding के लिए । सना 8 & #181; hematoxylin और eosin (ऑप्टिक नसों) या Luxol फास्ट ब्लू-hematoxylin और eosin (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) के साथ मीटर मोटी वर्गों.
  7. तंत्रिका और आसपास के मेनिन्जेस (ऑप्टिक न्युरैटिस) के भीतर सूजन की उपस्थिति के लिए ऑप्टिक नसों का मूल्यांकन या मुख्य रूप से आसपास के मेनिन्जेस (ऑप्टिक perineuritis) में ।
  8. गणना मस्तिष्कावरणीय और parenchymal भड़काऊ घावों (& #62; 10 संकुल mononuclear कोशिकाओं) मस्तिष्क में और प्रत्येक माउस के लिए रीढ़ की हड्डी के नमूने.
< p class = "jove_title" > 9. में Vivo ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी द्वारा रेटिना इमेजिंग (OCT)

< p class = "jove_content" > नोट: वर्णक्रमीय डोमेन OCT रेटिना इमेजिंग चूहों के वाणिज्यिक उपकरण का उपयोग किया जाता है ( जैसे , TruTrack नेत्र ट्रैकर के साथ Spectralis) सुसंगत नेत्र प्राप्त करने के लिए अभिविन्यास और गति कलाकृतियों को कम.

  1. पांच मिनट इमेजिंग से पहले, 1% tropicamide & के साथ विद्यार्थियों को फैली हुई है #160 आंख प्रति एक बूंद;() और जगह माउस संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में imaged करने के लिए, प्रति मिनट 2 लीटर (१.५% isoflurane) के एक सतत प्रवाह प्रदान करते हैं । गर्मी चटाई पर बारी और बाद संज्ञाहरण वसूली पिंजरे तैयार करते हैं ।
  2. इमेजिंग सिलेंडर पर माउस जगह और संज्ञाहरण के अनुसार प्रवाह अनुप्रेषित । आंख नम रखने के लिए और अपवर्तन निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए ०.३% hydroxypropyl methylcellulose के साथ आंखों की रक्षा करना । आंखों पर कस्टम कॉन्टेक्ट लेंस लगाएं ताकि जांच की जा सके ।
  3. बुनियादी लाल fundus छवि द्वारा निर्देशित, आंख को लेजर प्रत्यक्ष, बीम सुनिश्चित करने के ऑप्टिक तंत्रिका सिर पर केंद्रित है । ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज अक्टूबर स्कैन की पुष्टि करनी चाहिए कि रेटिना लेजर के लिए सीधा देता है ।
  4. प्रदर्शन 25 B-स्कैन उच्च-रिज़ॉल्यूशन मोड और rasterize से 30 औसत A-स्कैन करता है ।
  5. इमेजिंग दोनों आंखों के बाद, संपर्क लेंस को हटाने और नेत्र जेल लागू होते हैं । गर्म वसूली पिंजरे में माउस छोड़ दें ।
< p class = "jove_title" > 10. प्रसंस्करण और विश्लेषण OCT

  1. स्वचालित विभाजन के लिए मॉड्यूलर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
    1. इनर सीमित झिल्ली (ILM) और भीतरी plexiform लेयर (आईपीएल) से संबंधित सेगमेंट को मैन्युअल रूप से सही करता है, भीतरी रेटिना परतों की सीमाओं का प्रतिनिधित्व (IRL) < सुप क्लास = "xref" > 21 .
    2. सत्यापित करें कि रेटिना नर्व फाइबर लेयर (RNFL) और नाड़ीग्रंथि सेल लेयर (GCL) IRL की सीमाओं के भीतर रहते हैं और ओवरलैप नहीं करते.
  2. जल्दी उपचार मधुमेह रेटिनोपैथी अध्ययन का उपयोग IRL मोटाई की गणना (ETDRS) < सुप वर्ग = "xref" > 2 ग्रिड के व्यास के साथ 1, 2, और 3 मिमी ऑप्टिक डिस्क पर केंद्रित है, और एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में निर्यात. सॉफ्टवेयर प्रत्येक ग्रिड क्षेत्र औसत द्वारा प्रत्येक रेटिना परत की मोटाई की गणना करता है. इसलिए, केंद्रीय खंड, ऑप्टिक तंत्रिका सिर के अनुरूप है, बाहर रखा गया है ।
  3. प्रत्येक समय बिंदु पर समूहों के बीच सांख्यिकीय मतभेदों का विश्लेषण । प्रत्येक माउस के लिए दोनों आंखों का विश्लेषण, एक विनिमय करने वाला सहसंबंध मैट्रिक्स और अंतर-विषय अंतर-नेत्र सहसंबंध के लिए समायोजन के साथ सामान्यीकृत आकलन समीकरण का उपयोग < सुप वर्ग = "xref" > २१ .

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम C57BL/6 AQP4-/ चूहों से दाता टी कोशिकाओं का इस्तेमाल किया । AQP4 p135 के साथ इन चूहों के चमड़े के नीचे प्रतिरक्षण-153 या p201-220, जो रोगजनक टी सेल epitopes होते हैं, लिम्फ नोड्स draining में मजबूत प्रफलन टी सेल प्रतिक्रियाओं (चित्रा 1), जबकि इन दो पेप्टाइड्स बहुत कमजोर टी सेल प्रेरित WT चूहों में जखीरे. तुलना में, AQP4 p91-110 के साथ प्रतिरक्षण, एक गैर रोगजनक AQP4 टी सेल निर्धारक13, या मोग p35-55, एक myelin पेप्टाइड कि प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) के कारण टी कोशिकाओं को सक्रिय करता है22,23 ,24, AQP4 में टी सेल प्रसार के समान परिमाण प्रेरित-/ और WT चूहों । व्यक्तिगत Vβ या Vβ परिवारों के लिए प्रवाह cytometry धुंधला द्वारा TCR उपयोग के विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि p135-153-और p201-220-विशिष्ट टी कोशिकाओं से AQP4-/ चूहों अद्वितीय TCR प्रदर्शनों का उपयोग कर. चयनात्मक हाइपर-प्रसार के AQP4 p135-153 और p201-220 AQP4 में-/ चूहों, साथ ही अद्वितीय TCR उपयोग (चित्रा 2), संकेत दिया कि इन निर्धारकों के लिए रोगजनक टी सेल प्रतिक्रियाओं आम तौर पर thymic नकारात्मक द्वारा विनियमित है चयन, इस प्रोटोकॉल में AQP4-/- दाता टी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्व रेखांकित ।

ATCA के प्रेरण के लिए दत्तक स्थानांतरण से पहले, AQP4 पेप्टाइड से लिम्फ नोड कोशिकाओं-प्रधानमंत्री चूहों Th17 में इन विट्रो में कल्चरित थे-या Th1-तीन दिनों के लिए ध्रुवीकरण शर्तों. दाता सीडी+ टी कोशिकाओं के ध्रुवीकरण की हद तक intracellular cytokine धुंधला (आईसीएस) द्वारा पुष्टि की और प्रवाह cytometry (चित्रा 3) द्वारा मापा गया । भोली प्राप्तकर्ता चूहों नसों के साथ 2 एक्स 107 दाता AQP4 पेप्टाइड-विशिष्ट टी कोशिकाओं इंजेक्शन थे । लगभग छह दिनों के बाद, प्राप्तकर्ता चूहों के लगभग १००% सीएनएस प्रतिरक्षित रोग के नैदानिक लक्षण विकसित, लंगड़ा पूंछ और हिंद अंग पक्षाघात सहित (चित्रा 4) । Th17-ध्रुवीकरण AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं Th1 से अधिक गंभीर नैदानिक बीमारी प्रेरित AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं । Th17 AQP4-पेप्टाइड-विशिष्ट और विकसित पूर्ण हिंद अंग पक्षाघात (paraplegia) प्राप्त एक प्रतिनिधि माउस वीडियो 1में दिखाया गया है । चूहों के साथ इसके विपरीत है कि विकसित EAE मोग-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं के प्रशासन के बाद, प्राप्तकर्ता चूहों AQP4-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं द्वारा प्रेरित नैदानिक रोग से बरामद किया. मोग p35-55-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं द्वारा प्रेरित EAE के लिए के रूप में, नैदानिक रोग AQP4 p135 द्वारा प्रेरित-153-विशिष्ट या p201-220-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं सीएनएस mononuclear और पैरेन्काइमा में मेनिन्जेस कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ जुड़ा हुआ था (चित्रा 5) । घावों AQP4-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं द्वारा प्रेरित सीएनएस के लिए पैरेन्काइमा की तुलना में मेनिन्जेस में अधिक प्रचुर मात्रा में थे ।

ऑप्टिक तंत्रिका भागीदारी ऊतकीय मूल्यांकन द्वारा और धारावाहिक अक्टूबर AQP4-विशिष्ट और मोग-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं दोनों प्रेरित ऑप्टिक तंत्रिका सूजन है, जो mononuclear कोशिकाओं की उपस्थिति की विशेषता थी द्वारा प्रदर्शन किया गया । जबकि AQP4-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं ऑप्टिक perineuritis कारण, मोग-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं गंभीर ऑप्टिक न्युरैटिस प्रेरित (चित्रा 5) । धारावाहिक अक्टूबर का प्रयोग, ऑप्टिक तंत्रिका सूजन सूजन द्वारा स्पष्ट और नैदानिक AQP4-विशिष्ट या मोग विशिष्ट Th17 कोशिकाओं (चित्रा 6) द्वारा प्रेरित रोग के लिए भीतरी रेटिना परत (IRL) मोटाई वृद्धि हुई थी । AQP4 Th17-प्रेरित सीएनएस प्रतिरोधक क्षमता के लिए, IRL मोटाई चूहों नैदानिक रोग से बरामद के रूप में आधार रेखा को लौट आए । इसके विपरीत, मोग द्वारा प्रेरित EAE के हठ-विशिष्ट Th17 thinning IRL के साथ संगत है और, जैसा कि हम पहले का प्रदर्शन किया17, रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं के नुकसान के साथ जुड़ा हुआ था ।

Figure 1
चित्र 1 : AQP4 p135-153 और p201-220 AQP4 में मजबूत टी सेल प्रसार-/ चूहों, लेकिन चूहों WT नहीं. चूहों प्रतिरक्षित एस॰सी॰ में संकेत पेप्टाइड्स के साथ किया गया । ग्यारह दिन बाद, लिम्फ नोड्स हटा दिया गया है, और फिर या तो कोई प्रतिजन के साथ, या प्रतिरक्षण के लिए इस्तेमाल किया पेप्टाइड के साथ कल्चरित । प्रसार 3एच-thymidine निगमन (मतलब ± SEM, 5 प्रयोगों के प्रतिनिधि) द्वारा मापा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं AQP4 से-/ चूहों अद्वितीय TCR की प्रदर्शनियों का उपयोग । AQP4-/- और WT चूहों के संकेत पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षित किया गया । ग्यारह दिनों बाद, लिम्फ नोड्स हटा दिया गया था और प्रतिरक्षण के लिए इस्तेमाल किया पेप्टाइड के साथ संस्कृति । कक्षों को काटा गया । TCR Vβ उपयोगिता प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था (मतलब ± SEM, n = 5) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : दाता AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के भड़काऊ ध्रुवीकरण । AQP4 p135 के साथ प्रतिरक्षण के बाद ग्यारह दिन-153 या p201-220, लिम्फ नोड कोशिकाओं को काटा गया और गैर-ध्रुवीकरण शर्तों, Th1-या Th17-ध्रुवीकरण की स्थिति में प्रतिरक्षण के लिए इस्तेमाल किया पेप्टाइड के साथ प्रसंस्कृत थे. Th17 या Th1 ध्रुवीकरण क्रमशः IL-17 या IFN-γ के लिए आईसीएस और फ्लो cytometry द्वारा जांच की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Th17-ध्रुवीय AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं WT प्राप्तकर्ता चूहों में पक्षाघात पैदा. WT प्राप्तकर्ता चूहों 2 एक्स 107 दाता Th17-ध्रुवीय AQP4 p135-153 या p201-220-विशिष्ट टी कोशिकाओं AQP4-/ चूहों से प्राप्त किया । Th17-ध्रुवीकरण मोग-विशिष्ट टी कोशिकाओं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया । परिणाम 8 प्रयोगों के प्रतिनिधि है (n = 5/ * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : AQP4-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं WT चूहों में opticospinal सूजन पैदा. प्राप्तकर्ता चूहों 2 एक्स 107 दाता Th17 AQP4 p135-153-या p201-220-प्रधानमंत्री Th17 कोशिकाओं से AQP4-/ चूहों या Th17 मोग p35-55-विशिष्ट कोशिकाओं को प्राप्त किया और 10 दिन बाद बलिदान दिया गया । रीढ़ की हड्डी और ऑप्टिक तंत्रिका ऊतकों को तैयार किया गया और एच के साथ दाग & #38; LFB सूजन और ग्रासलेल्या के सबूत के लिए मूल्यांकन करने के लिए E/क्रमश. परिणाम 5 चूहों के प्रतिनिधि समूह/ स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : ऑप्टिक तंत्रिका सूजन AQP4 द्वारा प्रेरित-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं अनुदैर्ध्य रेटिना OCT द्वारा निगरानी की जा सकती है । WT प्राप्तकर्ता चूहों 2 x 107 दाता Th17-ध्रुवीय AQP4 p201-220-विशिष्ट या मोग p35-55-0 दिन पर विशिष्ट टी कोशिकाओं प्राप्त किया । वे दिन पर अक्टूबर द्वारा जांच की गई 0 (टी कोशिकाओं के प्रशासन से पहले) और फिर दिन पर 4, 7, 8, ९ १०, ११ १४ और 21 । IRL मोटाई मापा गया था (± SEM मतलब) । आंकड़े भोले नियंत्रण के साथ एक तुलना से संकेत मिलता है । परिणाम 3 प्रयोगों के प्रतिनिधि है (5 चूहों/ * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

AQP4 को २००५3में NMO आईजीजी में प्राथमिक लक्ष्य के रूप में पहचाना गया । फिर, यह एक AQP4-सीएनएस प्रतिरक्षा के पशु मॉडल को लक्षित स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा कि मांयता प्राप्त था । इस तरह के एक मॉडल कैसे AQP4-विशिष्ट टी और बी कोशिकाओं सीएनएस प्रतिरक्षण के विकास में भाग लेने के लिए और NMO के लिए उंमीदवार चिकित्सीय परीक्षण के लिए जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है । हालांकि AQP4-विशिष्ट टी कोशिका epitopes की पहचान जंगली-प्रकार चूहों में पहले २०१०13में रिपोर्ट किया गया था, उन epitopes का जवाब दे टी कोशिकाओं नैदानिक या histologic रोग14,17कारण नहीं था. AQP4 के लिए प्रतिरक्षा जेट पर आधारित सीएनएस-प्रतिरक्षण का एक मॉडल उत्पन्न करने में असमर्थता २०१५ जब तक एक अबूझ बनी रही जब जोंस, एट अल. 25 पता चला कि दाता AQP4 p135-153-AQP4 से प्राइम टी कोशिकाओं-/ चूहों WT चूहों में सीएनएस-प्रतिरक्षण के नैदानिक और histologic लक्षण पैदा करने में सक्षम थे. ब्याज की, AQP4 p135-153 उच्च अपनत्व के साथ MHC द्वितीय (I-Ab) को बाइंड करने की भविष्यवाणी की है17. केवल एक अंय AQP4 एमिनो एसिड अनुक्रम, 201-220, मैं एक समान उच्च समानता के साथबी बांध की भविष्यवाणी की है । दरअसल, हमने देखा है कि AQP4 p135-153 और p201-220 दोनों AQP4 में मजबूत प्रसार में लाना-/, लेकिन नहीं WT, चूहों । यहां, हमने दिखाया है कि कैसे एक को अलग कर सकते है और विस्तार encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153-और p201-220-प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं से AQP4-/ चूहों । जब WT प्राप्तकर्ता चूहों में हस्तांतरित, दाता AQP4-प्रतिक्रियाशील Th17 कोशिकाओं पक्षाघात प्रेरित किया, जो mononuclear सेल के साथ था रीढ़ की हड्डी और ऑप्टिक तंत्रिका में घुसपैठ । Afferent दृश्य प्रणाली चोट अच्छी तरह से AQP4-seropositive NMOSD26के साथ रोगियों में जाना जाता है । यहां, हमने देखा है कि ऑप्टिक तंत्रिका सूजन AQP4 द्वारा प्रेरित-प्रतिक्रियाशील और मोग-प्रतिक्रियाशील Th17 कोशिकाओं अलग था । जबकि AQP4-विशिष्ट Th17 कोशिकाओं ऑप्टिक perineuritis प्रेरित, मोग विशिष्ट Th17 कोशिकाओं गंभीर ऑप्टिक न्युरैटिस प्रेरित । हम भी ऑप्टिक तंत्रिका AQP4 द्वारा प्रेरित सूजन की निगरानी के लिए इस्तेमाल तकनीक का वर्णन किया है-विशिष्ट और मोग-धारावाहिक अक्टूबर तक विशिष्ट टी कोशिकाओं । अंय जांचकर्ताओं अब यहां वर्णित प्रोटोकॉल लागू करने में सक्षम होना चाहिए अपने ही ATCA के रोगजनक तंत्र पर केंद्रित अध्ययन अग्रिम ।

एक आसानी से हमारे प्रोटोकॉल में तीन संभावित नुकसान से बचने कर सकते हैं । सबसे पहले, ATCA के दत्तक हस्तांतरण AQP4 से AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता है-/ दाता चूहों । विशेष रूप से, दाता WT AQP4 p135-153-विशिष्ट टी कोशिकाओं प्राप्तकर्ता WT चूहों में ATCA कारण नहीं था । दूसरी बात यह है कि AQP4-/- चूहों (प्रोटोकॉल चरण १.५) के प्रतिरक्षण से पहले एक "जल-परीक्षण" की एक बूंद के साथ पेप्टाइड/ एस॰सी॰ इंजेक्शन के लिए उपयुक्त होने पर इमल्शन को पानी में नहीं फैलाना चाहिए । यदि इमल्शन फैलाता है, तो एक बार अधिक इमल्शन को मिलाएं, फिर से ठंडा करें और जल-परीक्षण को दोहराएं । अंत में, सक्रिय दाता सीएनएस प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं सीएनएस प्रतिरक्षा और अधिक कुशलता से टी कोशिकाओं को आराम से प्रेरित । एक नेत्रहीन प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उन संस्कृतियों का निरीक्षण करना चाहिए दत्तक स्थानांतरण के लिए दाता टी कोशिकाओं संचयन से पहले । तेजी से विभाजित कोशिकाओं समूहों, जो आसानी से पहचान कर रहे है फार्म कर सकते हैं । इसके अलावा, जब संस्कृतियों कई सक्रिय टी कोशिकाओं होते हैं, मीडिया से नारंगी या पीले रंग के लिए गुलाबी से संक्रमण, पीएच में कमी के कारण हो सकता है । एक भी दाता AQP4 के सक्रियकरण का आकलन कर सकते है प्रधान लिम्फ नोड टी कोशिकाओं के प्रसार के लिए 3एच-thymidine निगमन, के रूप में प्रोटोकॉल चरण 3 में वर्णित है ।

हमारी खोज है कि दो रोगजनक AQP4 टी सेल epitopes (1) के लिए उच्च समानता के साथ MHC द्वितीय बांध और (2) AQP4 में शक्तिशाली प्रफलन प्रतिक्रिया बटोरने की भविष्यवाणी की है-/, लेकिन नहीं WT, चूहों सुझाव है कि टी उन निर्धारकों को लक्षित कोशिकाओं सामांय रूप से कर रहे है द्वारा नियंत्रित thymic नकारात्मक चयन17. AQP4 में AQP4 p135-153 और p201-220 की मान्यता के लिए उपयोग की गई TCR की प्रदर्शनियां (चित्रा 2), जो भी thymic दिमाग़ी उपकला कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता क्लोनिंग हटाने के साथ संगत है, अद्वितीय हैं । अंय tolerogenic तंत्र आम तौर पर AQP4 को प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित कर सकते हैं । हमारे प्रारंभिक रिपोर्ट17के बाद, एक और समूह भी प्रदर्शन किया है कि AQP4 p201-220 एक encephalitogenic टी सेल निर्धारक27शामिल हैं । जब α/β (TCRα-/) टी कोशिका की कमी वाले चूहों को AQP4-/- सीडी+ टी कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन किया गया था, यह एक encephalitogenic AQP4-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रिया, लेकिन एक AQP4 विशिष्ट विनोदी प्रतिक्रिया नहीं, जिसका अर्थ है कि में लाना संभव था WT चूहों AQP4-विशिष्ट बी सेल प्रतिक्रियाओं, AQP4-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के समान, नकारात्मक चयन के अधीन हैं । दरअसल, रीढ़ की हड्डी axons और RGCs, जो AQP4-विशिष्ट टी अकेले कोशिकाओं द्वारा प्रेरित ATCA के साथ WT चूहों में नहीं देखा गया था की हानि, रोगजनक AQP4-विशिष्ट एंटीबॉडी की भागीदारी की आवश्यकता हो सकती है । यह स्पष्ट है कि माउस AQP4 के मॉडल-सीएनएस प्रतिरक्षा लक्षित के रूप में हम और अधिक tolerogenic सामांय AQP4-विशिष्ट टी सेल और बी सेल प्रतिरक्षा नियंत्रण तंत्र के बारे में जानने के विकास के लिए जारी रहेगा ।

AQP4-लक्षित सीएनएस उन्मुक्ति के अन्य मॉडलों को भी6,16,28,29,30से विकसित किया जा रहा है । हर एक विशेष पहलुओं है कि NMO रोगजनन के लिए प्रासंगिक है अध्ययन के लिए लाभ प्रदान कर सकते हैं । AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं WT चूहों में पहचान की गई है6,16,29. उन AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं सीएनएस के histologic परिवर्तन की वजह से प्रतिरक्षा, लेकिन, चूहों में टिप्पणियों के समान, WT चूहा AQP4-विशिष्ट टी कोशिकाओं नैदानिक रोग के महत्वपूर्ण लक्षण पैदा नहीं करते. इसलिए, सहिष्णुता के तंत्र को सीमित टी सेल और बी सेल AQP4-WT चूहों में विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का भी चूहों में परिचालन कर रहे हैं. बावजूद, एक रोग के रोगजनन में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल का उपयोग करने में शक्ति को नजरअंदाज नहीं करना चाहिए । नॉक आउट, ट्रांसजेनिक और रिपोर्टर चूहों का धन लाभप्रद हो सकता है. यह भी मांयता प्राप्त होना चाहिए कि कई मौलिक प्रतिरक्षा में खोजों माउस EAE मॉडल का उपयोग किया गया । उदाहरण के लिए, प्रदर्शन है कि एक स्व-प्रतिजन के लिए विशिष्ट टी सेल क्लोनों स्वतः प्रतिरक्षा रोग31,३२, प्रतिरक्षा३३ में टी सेल costimulation की भूमिका की पहचान और की खोज मध्यस्थता कर सकते हैं Th17 भेदभाव के लिए विकास मार्ग३४ पहले माउस EAE मॉडल का उपयोग कर वर्णित किया गया । ATCA के माउस मॉडल है कि हम विकसित किया है का उपयोग करना, एक अब विकास और vivo में रोगजनक AQP4-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विनियमन का अध्ययन करने का मतलब है, जो NMO रोगजनन से संबंधित महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए ।

Disclosures

S.A. सगळ्यांनाच, अ. क्रूज़-Herranz, C.M. स्पेंसर, असवाल हो, एल. Steinman, जे ग्रीन, आणि आर. Sobel रिपोर्ट नहीं खुलासे । एस Zamvil न्यूरोलॉजी, Neuroimmunology और Neuroinflammation के उप संपादक है और Neuroimmunology के अंतरराष्ट्रीय समाज के लिए सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य है । वह नैदानिक जांच के जर्नलके संपादकीय बोर्ड पर सेवा की है, इम्यूनोलॉजी के जर्नल और स्नायविक विज्ञान के जर्नल, और राष्ट्रीय संस्थानों के लिए अनुदान की समीक्षा समिति के एक चार्टर सदस्य किया गया है ऑफ हेल्थ (NIH) नैदानिक Neuroimmunology और ब्रेन ट्यूमर (CNBT) अध्ययन अनुभाग और नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (NMSS). वह एक सलाहकार के रूप में सेवा की है और Biogen से मानदेय प्राप्त-Idec, ईएमडी-सेरोनो, Genzyme, नोवार्टिस, Roche/Genentech, और टेवा फार्मास्यूटिकल्स, Inc, और सेवा की है या लिली, BioMS, टेवा और Opexa चिकित्सकीय के लिए डेटा सुरक्षा निगरानी बोर्डों पर कार्य करता है । वर्तमान में, डॉ Zamvil NIH, NMSS, Maisin फाउंडेशन, Biogen और ट्विटर से अनुसंधान अनुदान सहायता प्राप्त करता है ।

Acknowledgements

नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (RO1 AI073737 और RO1 NS092835-01), नेशनल मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी (आरजी ४७६८, आरजी ५१७९ और आरजी ५१८०), Maisin फाउंडेशन और Guthy जैक्सन चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा S.S.Z. को सहायता प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M. tuberculosis H37Ra BD Difco 231141 Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's Adjuvant BD Difco 263910
AQP4 peptide p135-153 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 peptide p201-220 Genemed Custom Synthesis Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55 Genemed / Auspep Custom Synthesis Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
3-way Stopcock Kimble 420163-4503
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) GE Healthcare Life Sciences SH30071
Recombinant Mouse IL-23 R&D Systems (BioTechne) 1887-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D Systems (BioTechne) 406-ML
Recombinant Mouse IL-12 R&D Systems (BioTechne) 419-ML
Thymidine [Methyl-3H] PerkinElmer NET027
Glass Fiber Filtermats PerkinElmer 1450-421
Anti-mouse antibodies eBioscience (Affymetrix) [various]
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel BD Biosciences 557004
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain ThermoFisher Scientific [various]
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug BD Biosciences 555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Iomomycin (calcium salt) Sigma-Aldrich I0634
Pertussis Toxin from B. pertussis List Biological Laboratories 181
10% Formalin VWR 89370-094
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2
Foam Biopsy Pads, Rectangular Fisher Scientific 22-038-221
Isothesia (isoflurane, USP) Henry Schein Animal Health 050033 NDC : 11695-0500-2
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Akorn NDC: 17478-102-12
Spectralis Diagnostic Imaging Platform Heidelberg Engineering

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References

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