Author Produced

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

قدم هنا طريقة بسيطة لإنشاء مكتبة إدراج ينقول عالي الكثافة في الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري استخدام اقتران جرثومية. هذا البروتوكول يسمح بإنشاء مجموعة من مئات آلاف طفرات فريدة من نوعها في البكتيريا بإدراج الجينوم عشوائي ينقول.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ينقول الطفرات هو أسلوب يسمح تعطيل الجينات عن طريق الإدراج الجينوم عشوائية من قطعة من الحمض النووي يسمى ينقول. ويحدد البروتوكول أدناه أسلوب لنقل عالية الكفاءة بين السلالات البكتيرية من بلازميد إيواء ينقول التي تحتوي على علامة مقاومة كاناميسين. يتم ترميز ترانسبوساسي بلازميد المنقولة بجين البديل tnp يدرج في ينقول في جينوم سلالة المتلقي مع التحيز إينسيرشونال منخفضة جداً. وهكذا يسمح هذا الأسلوب إنشاء مكتبات متحولة الكبيرة التي تم إدراجها ترانسبوزونات في المناصب الجينوم فريدة من نوعها في سلالة المستفيدة من بكتيريا الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري أما. باستخدام اقتران البكتيرية، بدلاً من الأساليب الأخرى مثل انهانسر أو تحويل المواد الكيميائية، يمكن إنشاء مكتبات كبيرة مع مئات الآلاف من الحيوانات المستنسخة فريدة من نوعها. هذا تؤدي المكتبات الإدراج عالي الكثافة، مع الملاحق التي تحدث بشكل متكرر ككل زوج قاعدي 4-6 في الجينات غير الضرورية. هذا الأسلوب متفوقة إلى أساليب أخرى كما أنها تسمح بطريقة غير مكلفة وسهلة الاستخدام وعالية كفاءة لإنشاء مكتبة الإدراج ينقول الكثيفة. مكتبة ينقول يمكن استخدامها في تطبيقات المصب مثل ينقول التسلسل (Tn-Seq)، إلى استنتاج شبكات التفاعل الوراثية، أو أكثر بساطة، حيث (إلى الأمام الوراثية) شاشات.

Introduction

إنشاء مكتبات الطفرات ينقول في البكتيريا مفيد لمجموعة واسعة من التطبيقات، بدءاً من الاكتشافات للجينات الفوعة في مسببات الأمراض البكتيرية1،2، لدراسات الجينات الأساسية3، 4 , 5 , 6، لتحديد التفاعل الوراثية شبكات7،،من89. حاسمة بالنسبة لهذه الدراسات القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة من طفرات. استخدام ترانسبوزونات (قصيرة شظايا من الحمض النووي أن إدراج جينوم شكل عشوائي) وسيلة بسيطة لتعطيل وظيفة الجينات، حيث غالباً ما سيتم تعطيل إدراج ينقول داخل إطار القراءة المفتوحة أو المنطقة التنظيمية للجينات الدالة أو التعبير من الجينات.

المبين هنا طريقة لإنشاء مكتبة ينقول كولاي أو س. فليكسنيري بالاقتران البكتيري باستخدام pJA1 بلازميد10. هناك اثنين من المزايا الرئيسية لاستخدام هذا بلازميد. الميزة الأولى هي أن البديل ترانسبوساسي Tn10 من بلازميد pJA1 إيندوسيبلي والإدراج منخفضة التحيز11،12، مما يعني أن ينقول سوف تدمج عشوائياً في الجينوم عند الأيزوبروبيل Β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) إضافة إلى وسائل الإعلام. ينقول يحتوي على علامة مقاومة كاناميسين، مما يسمح لاختيار طفرات مع إدراج ينقول في الكروموسوم سلالة المتلقية. والميزة الثانية من بلازميد pJA1 يحتوي مصدر متحولة R6K للنسخ المتماثل. أصل النسخ المتماثل متحولة R6K يتطلب الجينات لامدا شرطة التدخل السريع من أجل الحفاظ على بلازميد13. كما لا يمكن إجراء نسخ متماثل بلازميد في بير- سلالات، سوف تضيع في سلالة المتلقية (الشكل 1). وهذا ما يضمن أن ترانسبوساسي Tn10 هو إزالتها من الخلية ولم تعد نشطة، الحد كذلك من الطفرات بعد حدث تبديل الأولية.

استخدام الاقتران البكتيري لنقل بلازميد pJA1 من سلالة المانحين إلى سلالة المتلقي مفيد لعدة أسباب. بسيطة وغير مكلفة لإجراء اقتران ولا تحتاج إلى معدات خاصة مثل اليكتروبوراتور. بالإضافة إلى ذلك، يسمح كفاءة عالية لتصريف البكتيرية لمكتبة كبيرة جداً (> 2 × 105 عمليات الإدراج فريدة من نوعها) أن يتحقق مع عدد قليل ملليلتر (مل) من بين عشية وضحاها ثقافة البكتيرية6. تستغرق العملية حوالي ساعتين وقت العملي جنبا إلى جنب مع الوقت للحضانة ونمو البكتيريا. لانجريدجي et al. 14 الإبلاغ عن أداء 130 اليكتروبوريشنز لإنشاء مكتبة الطفرات ينقول ذات حجم مماثل لوصف هنا8، الذي يتحقق باقتران واحدة. يتطلب استخدام اليكتروبوريشنز 130 إعداد العمل المكثف وتستغرق وقتاً طويلاً من الخلايا اليكتروكومبيتينت واستخدام العديد من مواد باهظة الثمن (مثلاً، الترعة انهانسر)، بتكلفة لأكثر من 1000 دولار في المواد الاستهلاكية وحدها. دراسات أخرى10 استخدمت أساليب مماثلة، لكن مع السلالات البكتيرية مختلفة، وأحجام مكتبة حقق أصغر بكثير (وحدات تشكيل مستعمرة من 5 × 104 ) مما ذكرته هنا.

ملاحظات عن سلالة المانحة: سلالة المانحة المستخدمة هنا هي سلالة كولاي BW2076715 تتضمن بلازميد ينقول pJA116. يمكن متزاوجة سلالة BW20767 إلى السلالات الأخرى، مما يجعل نقل بلازميد pJA1 ذات كفاءة عالية. أيضا، والأهم من ذلك، BW20767 لامدا بير +- وكما ذكر سابقا، pJA1 بلازميد فقط قادرة على الاحتفاظ في السلالات التي تحتوي على الجين شرطة التدخل السريع لامدا. هذه السلالة هو كاناميسين والامبيسلين مقاومة. بلازميد pJA1 يحتوي على علامة المقاومة الأمبيسلّين، ويرد علامة مقاومة كاناميسين داخل ينقول. ونمت هذه السلالة بالتحديد على بلازميد استخدام الأمبيسلّين في 100 ميكروغرام/مل. أنها أيضا الجدير بالذكر أن سلالات أخرى تأوي مؤثرا وأعربت عن ترانسبوساسي الجينات معروفة لتكون غير مستقرة، وبينما ترانسبوساسي المستخدمة هنا هو تحت إيندوسيبلي التحكم، لا يزال هناك خطر منخفض للتعبير راشح. ولهذا السبب، اقترح أنه ينبغي التقليل من مرور هذه السلالة، وينبغي أن تؤخذ مسحه جديدة من ثقافة مجمدة لكل إعداد مكتبة جديدة. سلالة المانحة تستخدم هنا تتوفر لدينا مختبر عند الطلب.

ملاحظات عن سلالة المستلم: سلالة المستلم يمكن أن سلالة خيار، مثل سلالات مختبر K12-مشتقة من كولاي أو سلالات من S.flexneri (انظر المناقشة أيضا،). يجب أن يكون الضغط المستفيدة علامة إضافية مقاومة المضادات الحيوية ليست مقاومة كاناميسين، حتى يمكن تحديد سلالة المانحة ضد. لسلالة المتلقية، يستخدم عبئا MG1655 كولاي هنا مع طفرة حمض الناليديكسيك عفوية أدخلت. كان اختارها المسخ حمض الناليديكسيك عفوية الطلاء إلى 2 مل ثقافة بين عشية وضحاها في 200 ميليلتر مختبرين على لوحات تحتوي على حمض الناليديكسيك في 30 ميكروغرام/مل. واختير استنساخ واحد من MG1655 التي كان مقاوم لحمض الناليديكسيك لتصبح سلالة المتلقية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون سلالة المتلقية لامدا بير السلبية، كما هو موضح أعلاه.

نظرة عامة: بمجرد حدث الاقتران البكتيري وبلازميد pJA1 قد اقتحمت سلالة المستفيدة من إجهاد المانحين، ستؤدي إضافة إيبتج لوسائل الإعلام التعبير عن الجين tnp ، الذي يخضع للسيطرة على إيبتج-إيندوسيبلي المروج لاسك/Ptac (الشكل 1). هو الجين tnp على pJA1 ترانسبوساسي المسخ الذي تردد أقل للإدراج في البقع الساخنة6،،من1011. عند إضافة والاستقراء مع إيبتج، تنشيط ينقول وإدراج عشوائياً في الجينوم. لا يمكن الحفاظ على في سلالة بير-المستلم لامدا بلازميد ويضيع.

Protocol

تحذير: في حالة استخدام فليكسنيري س. كسلالة المتلقية، يرجى ملاحظة أن فليكسنيري س. مسببات الأمراض بشرية التي يمكن أن تتسبب في أمراض الجهاز الهضمي. يجب إجراء التجارب التي تنطوي على فليكسنيري س. مع احتياطات السلامة المناسبة (المسمى BSL-2 في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية أو PC2 في نيوزيلندا). أجريت جميع التجارب التي أجريت في الفيديو المرتبطة بهذا البروتوكول باستخدام سلالة المستفيدة تتسم جيدا من غير ممرضة كولاي MG1655 في إعداد PC1. العمل مع فليكسنيري دوسنتاريا أنجز سابقا في مختبر BSL-2 في بيوزينتروم في بازل، كما هو موضح في 6-

ملاحظة: التجربة التالية يتم فعلياً مرتين. الجزء الأول (الخطوة 1، 1-الخطوة 4.5) تتم لمعرفة تمييع أفضل للطلاء المكتبة، حيث كان الهدف هو العثور على إضعاف التصريف الذي يعطي العديد من المستعمرات الفردية للوحة الواحدة، ولكن ليس الكثير من أشكال حديقة. وهذا الحد من المنافسة بين الطفرات مع انخفاض ملحوظ في اللياقة البدنية وذوي اللياقة البدنية أكثر قوة. الجزء الثاني (خطوات 5.1-7.4) هو إنشاء مكتبة النهائية، حيث تنتشر العديد من لوحات لتمييع المكتبة المناسبة.

1-"لإعداد واحد يوم السابقة" للتجربة

  1. إينوكولاتي، من أسهم مجمدة، سلالة المانحين في 2 مل مرق رطل، المطاحن وصفه (كلوريد الصوديوم في 10 غرام/لتر) الوسائط التي تحتوي على الأمبيسلّين في 100 ميكروغرام/مل. سلالة المانحة المستخدمة هنا هي سلالة كولاي BW20767 15 إيواء بلازميد pJA1 11. استخدام الأمبيسلّين يحافظ على اختيار بلازميد pJA1.
  2. إينوكولاتي، من مستعمرة واحدة أو الأوراق المالية المجمدة, وسلالة المتلقية في 2 مل وسائط رطل مع علامة مقاومة عدا الأمبيسلّين أو كاناميسين. سلالة المستلم المستخدم هنا هو كولاي " نوع البرية " سلالة MG1655 17 ، 18 مع متحولة مقاومة عفوية لحمض الناليديكسيك. هي تزرع في حمض الناليديكسيك ميكروغرام/مل 30-
  3. إعداد مرق لوريا 20 تحتوي على لوحات أجار 1.5% (في أطباق بتري 90 ملم، حوالي 12.5 مل). ويمكن تخزين لوحات أجار تفتقر إلى المضادات الحيوية عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر حتى استخدام.
  4. إعداد مرق لوريا 20 تحتوي على لوحات أجار 1.5% (في أطباق بتري 90 ملم، حوالي 12.5 مل) الذي يحتوي على كلا من حمض الناليديكسيك في 30 ميكروغرام/مل وكاناميسين في 50 ميكروغرام/مل (LBA Nal30 Kan50). يمكن تخزين لوحات أجار المحتوية على المضادات الحيوية في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أشهر حتى استخدام.
  5. إعداد 200 مل العقيمة رطل وسائط. يمكن تخزين الوسائط رطل في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر-
  6. إعداد 1 مل من 100 ملم الأسهم العقيمة من إيبتج، وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-

2. البكتيرية من التزاوج أو الاقتران

ز
  1. مل 1 أجهزة الطرد المركزي للثقافة بين عشية وضحاها من سلالة المانحين لمدة 1 دقيقة في س 14,000 في درجة حرارة الغرفة. تجاهل وسائط النمو. تتم هذه الخطوة إزالة كافة وسائط النمو التي تحتوي على المضادات الحيوية-
  2. ريسوسبيند بيليه الخلية إلى 110 ميليلتر من رطل (لا تحتوي على المضادات الحيوية)، وبالتالي التركيز الثقافة-
  3. استخدام الملقط العقيمة، وضع عامل تصفية النيتروسليلوز عقيمة (بدلاً من ذلك يمكن استخدام قطعة ورق نشاف عقيمة، انظر المواد القائمة) إلى منتصف صفيحة LBA (لا تحتوي على المضادات الحيوية). قم بتسمية اللوحة " "المراقبة السلبية": المانحة ".
  4. استخدام ماصة، قطره 50 ميليلتر ثقافة المانحة تتركز على عامل التصفية.
  5. كرر الخطوات 2، 1-4 لسلالة المتلقية، وسم اللوحة " "الرقابة السلبية": المستلم. "
  6. للمكتبة، وقطره 50 ميليلتر من ميليلتر 50 والجهات المانحة (من الخطوة 2، 2) سلالة المتلقية (من الخطوة 2، 5) على عامل تصفية واحد عقيمة على صفيحة LBA (هذه اللوحات يجب أن لا تحتوي على المضادات الحيوية). قم بتسمية هذه اللوحة " مكتبة. " التزاوج يحدث لأن الجهات المانحة والمستفيدة في الاتصال الجسدي الوثيق في عامل التصفية.
  7. وضع لوحات أجار تحتوي على عوامل التصفية في 37 درجة مئوية ل 6 h.

3. تنشيط ينقول pJA1 "تحريض" ترانسبوساسي إيبتج

  1. تحضير ثلاثة 15 مل المخروطية قارورة تحتوي على 2 مل رطل مع إيبتج بتركيز نهائي 1 مم (أي، 20 ميليلتر من الأسهم 100 مم من إيبتج). قم بتسمية كل: مراقبة الجهات المانحة، تحكم المستلم، ومكتبة-
  2. إزالة اللوحات من الحاضنة بعد ح 6 النمو عند 37 درجة مئوية (من الخطوة 2، 4). بعض النمو الجرثومي يجب أن تكون مرئية في عامل التصفية.
  3. إزالة أوراق الترشيح من سيطرة الجهات المانحة
  4. استخدام الملقط العقيمة، ووضعها في القنينة المخروطية 15 مل المسمى "مراقبة الجهات المانحة" (من الخطوة 3.1). تفعل الشيء نفسه لمراقبة المستلم ومكتبة-
  5. الاستفادة من هذه الأنابيب للحصول على أوراق الترشيح إلى أسفل القنينة المخروطية 15 مل والتأكد من أن ذلك هو تماما غارقة في رطل
  6. دوامة أنابيب دقيقة كاملة على الأقل على ارتفاع أن تنأى بهذه البكتيريا من عامل تصفية النيتروسليلوز. وينبغي أن تصبح رطل غائم مع الخلايا البكتيرية ( الشكل 2).
  7. استخدام الخرز الزجاج معقمة أو الناشرة عقيمة، لوحة 200 ميليلتر من تعليق البكتيريا فورتيكسيد من سيطرة الجهات المانحة على لوحات LBA Nal30 Kan50 المسمى " "مراقبة الجهات المانحة"، 200 ميليلتر "-
  8. كرر الخطوة أعلاه (3.6) لعنصر التحكم المتلقية، وسم اللوحات " "تحكم المستلم"، 200 ميليلتر "-
  9. كرر الخطوة أعلاه (3.7) للمكتبة، ووضع العلامات اللوحات " مكتبة، 200 ميليلتر "-
  10. إجراء تخفيف إضافي (أي 1:5، تخفيف 01:10 و 1: 100، استخدام رطل لا تحتوي على المضادات الحيوية كمخفف) للمكتبة. ميليلتر لوحة 200 مكتبة غير مخفف وتخفيف إضافي على شكل مناسب المسمى لوحات LBA Nal30 Kan50.
  11. حاضنة
  12. لوحات المكان إلى 37 درجة مئوية ل h. 18 الحيوانات المستنسخة مع ترانسبوزونات إدراجها في جين الذي يسبب خسارة كبيرة للياقة البدنية قد يستغرق وقتاً أطول تنمو وتظهر في اللوحة. وينبغي أن يكون هناك مجموعة متنوعة من أحجام مستعمرة ( الشكل 3). ينبغي أن يكون للبلدان المانحة والمتلقية من سلالة لوحات لا مستعمرات عليها.

4. اختر "التخفيف المناسبة" للمكتبة لاستخدامها "مكتبة الطور النهائي"

  1. تحديد إضعاف المكتبة من 3.9 الخطوة التي تعطي العديد من المستعمرات ذات أحجام مختلفة أن متباعدة على نحو كاف. والهدف الحصول على العديد من المستعمرات قدر الإمكان على لوح واحد، ولكن ليس الكثير أن المستعمرات دمج بعضها البعض، والتنافس على الموارد. ينبغي أن يكون هذا العدد حوالي 500-2,000 في المستعمرات للوحة الواحدة. يظهر مثال للكثافة مستعمرة المناسبة على لوحة في الشكل 3-
  2. سجل عدد المستعمرات على الألواح.
  3. حساب تكرار الاقتران (عدد كونجوجانتس كل خلية المستفيدة). وهذا ينبغي أن تكون في النطاق من 1 × 10 -4 إلى 1 × 10 -6 19-
  4. تحديد عدد طفرات المطلوب في مكتبة النهائي استناداً إلى تطبيقات المتلقين للمعلومات. العديد من المستخدمين ببساطة تتطلب مكتبة مع طفرات كثيرة كما قدر الإمكان. لإنشاء العديد من ينقول الملاحق نظرياً ممكنة (الإدراج واحد كل زوج قاعدي)، تهدف للتقريبلي نفس العدد من المستعمرات كأزواج قاعدة في الجينوم (أي، ~4.5 x 10 6 كولاي) تشبع الجينوم الكامل مع جميع الملاحق ينقول الممكنة. من المهم ملاحظة أن العديد من طفرات إيواء الملاحق في الأساسية أو الجينات الوظيفية الهامة لن تكون قادرة على استردادها، كما ستكون هذه الطفرات المميتة للمستلم.
  5. حساب مقدار حجم المكتبة الأولى هو مطلوب لإنشاء مكتبة للحجم المطلوب. على سبيل المثال، حجم المكتبة المطلوب 5 × 10 4 طفرات. تم تمييع المستعمرات من 3.9 خطوة مع تباعد أفضل 200 ميليلتر من 01:10 إضعاف. ويقدر عدد المستعمرات في هذه اللوحة أن يكون حوالي 2,000 المستعمرات. إذا كان هناك حاجة إلى 5 × 10 4 طفرات وكل لوحة 2,000 المستعمرات, فستلزم لوحات 25 في تمييع هذا.

5. إنشاء مكتبة الطور النهائي

  1. كرر الخطوات 1 إلى 3-8، ضبط عدد اللوحات في الخطوة 1، 4 حسب الحاجة (راجع الخطوة 4، 4).
  2. في الخطوة 3، 9، لوحة تمييع اخترته في الخطوة رقم 4، 1 على العديد من لوحات حسب الحاجة لإنشاء مكتبة الحجم المطلوب (راجع الخطوة 4، 4).

6. تقدير "كثافة مكتبة"

  1. عد كم عدد المستعمرات هناك هي للوحة الواحدة، وثم الحصول على تقدير تقريبي للمكتبة كيف كثيفة من. فعلى سبيل المثال: يتم مطلي بما مجموعة 2 × 10 5 مستعمرات. أن الجينوم MG1655 كولاي حوالي 4.5 × 10 6 قاعدة أزواج. ولذلك، إدراج مكتبة بحوالي 2 × 10 5 يعني أن ثمة إدراج في المتوسط كل زوج قاعدي 22 وأن كل الجينات يجب أن تحور حوالي 45 مرة، نظراً لأن جين واحد حوالي 1 × 10 3 قاعدة أزواج. عمليات الإدراج في الجينات الأساسية من المحتمل أن تكون ممثلة تمثيلاً ناقصاً جداً في هذه المكتبة، وهكذا الكثافة في الجينات غير الضرورية من المرجح أن يكون أكبر من هذا. يوفر هذا النوع من حساب واحد مع تقدير واسع النطاق لكثافة ينقول.

7. تجميع مكتبة ينقول ومخزن

  1. بعد عد المستعمرات، إضافة 1 مل من رطل (أو أكثر، حسب الحاجة) إلى لوحة المكتبة واستخدام الناشرة عقيمة كشط قبالة البكتيريا من اللوحة. إزالة تعليق البكتيرية ووضعه في قنينة مخروطية 50 مل أو 15 مل. كرر لكل ألواح.
  2. دوامة تعليق البكتيريا المجمعة لمدة دقيقة كاملة مجانسة التعليق.
  3. إضافة والغليسيرول العقيمة إلى تركيز نهائي من 20%-
    1. إعداد 100 × 20 ميليلتر مختبرين في أنابيب 0.25 مل لسهولة إعادة نمو.
    2. إعداد على الأقل اثنين أو أكثر 1 مل اليكووت في كريوفيالس-
  4. بتخزين جميع مختبرين في-80 درجة مئوية

Representative Results

وبعد 18 ساعة نمو، ينبغي أن تتضمن لوحات العديد من المستعمرات مع مجموعة متنوعة من أحجام مستعمرة (الشكل 3). أحجام مختلفة مستعمرة تشير إلى استنساخ للياقة البدنية متفاوتة، وهي علامة جيدة وعملت على البروتوكول. ضوابط الجهات المانحة والمتلقية ينبغي أن يكون أي نمو على اللوحات. استخدام البروتوكول أعلاه ينبغي أن تسفر عن ما يزيد عن 2 × 105 وحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي). توسيع نطاق البروتوكول إلى خمس نسخ متماثل الاقتران مرة واحدة ينبغي أن تسفر عن حوالي 1 × 106 زيمبابوي. في الأعمال السابقة، أشار التحليل باستخدام تسلسل الجيل القادم إلى أنه ينبغي أن تسفر عن مكتبة المحجمة حتى > 2 × 105 عمليات الإدراج فريدة من نوعها6. في زيمبابوي عالية جداً (أي1 × 106 زيمبابوي) يتوقع معدل عمليات الإدراج فريدة من نوعها الهضبة، كما أصبحت تمثل جميع الملاحق (غير فادح) المتاحة.

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطي الاقتران البكتيري وإدخال ينقول في الكروموسوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صورة مرشحات سوبميرسيد في وسائل الإعلام ليبره قبل وبعد فورتيكسينج- قبل فورتيكسينج، عالقة خلايا للتصفية ووسائط الإعلام واضح. بعد فورتيكسينج، وسائط الإعلام يصبح غائم الخلايا وقد تأتي الخروج من عامل التصفية وفي وسائل الإعلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : (أ) لوحة الممثل من مكتبة ينقول بعد 18 ساعة نمو. (ب) قرب مستعمرة الأحجام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

يسمح البروتوكول هو موضح هنا لبناء مكتبة الإدراج كثيفة. يسمح هذا الأسلوب لإنشاء مكتبة ينقول مع ما يزيد على 2 × 105 ينقول فريد طفرات تحت باستخدام 5 مل من الثقافة المجلد6. أنه من السهل نسبيا لتنفيذ، يستخدم الكواشف المتوفرة في مختبرات الميكروبيولوجيا الأساسية، قابلة، وتتطلب القليل من المعدات باهظة الثمن أو المواد الاستهلاكية مثل الترعة انهانسر.

وهناك فائدة كبيرة من هذا الأسلوب، من الناحية النظرية، لدى المستخدم حرية واسعة في اختيار سلالات المتلقي انتيروباكتيريال. هذا الورق، فضلا عن آخرين11، استخدام كولاي سلالة المتلقية، لكن بلازميد pJA1 قد استخدمت بنجاح مع الأنواع الأخرى المستفيدة انتيروباكتيريال مثل انتيريكا فليكسنيري دوسنتارياالسالمونيلا6 و سرفار تيفيموريوم سلالة SL134410. نظرياً، يسمح أصل γ النسخ المتماثل (أوريR6Kγ) في pJA1 هذا بلازميد الإبقاء في مضيف واسعة نطاق19، مما يسمح أن سلالة المتلقي بير +- في الآونة الأخيرة، وقد وصف أساليب جديدة تسمح بالبناء شرطة التدخل السريع + في مجموعة من سلالات انتيروباكتيريال20، مما يتيح مرونة إضافية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح المنطقة300 زوج قاعدي الغوغاء من بلازميد RP4 في pJA1 كونجوجاتيفي نقل هذا بلازميد إلى طائفة واسعة من السلالات البكتيرية سالبة الغرام19. ببساطة، هذا الأسلوب يمكن نظرياً استخدامها مع مجموعة متنوعة من السلالات المتلقية، طالما يتم استيفاء عدة شروط: السلالة من شرطة التدخل السريع+، ويتميز بمقاومة المضادات الحيوية خلاف كاناميسين وخلاف سلالة المانحين.

خطوة حاسمة في البروتوكول يكمن في تقدير عدد مناسب من الخلايا لوحة بها في الخطوة 4، 1. إذا كانت مستعمرات متباعدة جداً عن كثب، يتنافسون للمواد الغذائية على اللوحة وهي تتغلب طفرات أقل ملاءمة. قد يؤدي هذا إلى انخفاض في العدد الكلي لطفرات. بدلاً من ذلك، إذا المستعمرات متباعدة جداً متباعدة، سيكون هناك عدد قليل جداً من المستعمرات على اللوحة، ويصبح العدد الإجمالي للوحات أجار اللازمة لتحقيق مكتبة كبيرة مرهقة. ولذلك، من المهم تحقيق التوازن الصحيح من حيث أرقام مستعمرة للوحة الواحدة.

من المهم تنفيذ الضوابط المدرجة في البروتوكول لضمان العمل بالخطوات كما هو موضح. جدير بالذكر أن عند استخدام حمض الناليديكسيك كتحديد مكافحة ضد سلالة الجهات المانحة، من المهم أن تضمن لوحات التحكم المانحة السلبية خالية من المستعمرات. وهذا لأنه قد يكون هناك انخفاض معدل (حوالي 1 × 10-10)21 من مقاومة عفوية لحمض الناليديكسيك، تسفر عن إيجابيات كاذبة. عادة ما يكون معدل التصريف والنقل هو حوالي 2 × 10-4 19. ولذلك، معدل التصريف وتبديل عدة أوامر من حجم أكبر من معدل مقاومة عفوية لحمض الناليديكسيك. ولذلك، معدل المغلوطة مقارنة بأحداث التحول الحقيقي منخفض جداً وتعتبر ضئيلة عندما تعمل البروتوكول. ومع ذلك، إذا كان خفض معدلات تصريف أو تبديل إلى حد كبير، (من انخفاض كفاءة التزاوج و/أو عدم وجود تحريض الجينات ترانسبوساسي مع إيبتج) وهو الارتقاء بالبروتوكول للتعويض عن هذا، ثم العدد من إيجابيات كاذبة (استنساخ التي لم يكن لديك ينقول إدراج) قد يزيد أيضا.

يمكن إجراء بعض التعديلات لأوقات الاحتضان في "الخطوات 3-2" و 3، 10. خطوة 3.2 الدول التي ينبغي أن يحدث الاقتران لح 6، ولكن في تجربتنا، يمكن أن تكون هذه الخطوة وقت متنوعة (أي، 4-7 ح) دون تغيير النتائج إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك، في الخطوة 3، 10، يمكن أيضا ضبط طول الفترة الزمنية هي المحتضنة المستعمرات على لوحات أجار. وهذا يمكن أن تختلف تبعاً لمتوسط مضاعفة معدل نمو أو الوقت سلالة المتلقية. بالإضافة إلى ذلك، حققت ح 18 في تجربتنا، مجموعة متنوعة من أحجام مستعمرة، مما يشير إلى مكتبة للياقة البدنية المتنوعة. ومع ذلك، المستعمرات مع إلى حد كبير انخفاض لياقة قد يستغرق وقتاً أطول للنمو وبالتالي قد لا تكون مرئية بعد 18 ساعة. إذا كان يستخدم هذا الأسلوب للبحث عن الحيوانات المستنسخة للغاية انخفاض لياقة، يمكن استخدام أوقات أطول في الحضانة والمستعمرات أقل على اللوحة للحد من الازدحام (أي، ح 48، 50-300 المستعمرات).

وتشمل المخاطر الإضافية لهذا الأسلوب أنه ليس من الممكن استخدام سلالة مستلم بالفعل مقاومة كاناميسين. قد يكون من الممكن لمبادلة خارج علامة المقاومة كاناميسين في بلازميد pJA1 لعلامة اختيار بديلة، مثل مقاومة الكلورامفينيكول للتغلب على هذه العقبة. أيضا قد يكون من الجدير بالذكر أنه، من الناحية النظرية، من الممكن استخدام سلالة المتلقي مقاومة الأمبيسلّين، كما pJA1 بلازميد يحتوي على علامة المقاومة الأمبيسلّين المفقودة بعد وقت قصير من تبديل.

إنشاء مكتبة ينقول الكثيفة في الخلفية الوراثية للاختيار يحتمل أن تكون مفيدة للعديد من التطبيقات المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، يمكن استخدام مكتبة ينقول كثيفة لتحديد طفرات أوكسوتروفيك باستخدام النسخة المتماثلة تصفيح22 أو لتحديد طفرات المعيبة في إقامة عدوى1،2. في الآونة الأخيرة، كما انخفضت تكاليف تسلسل الحمض النووي، وقد أصبحت التكنولوجيات الجديدة مثل تسلسل الجيل القادم أمرا مألوفاً، ينقول المكتبات قد استخدمت مع تسلسل الحمض النووي العميق إلى التبصر في الجينات أكفاء، وظيفة الجينات، والوراثية التفاعلات. بعض هذه الأساليب ويعاد النظر في 23 وتشمل أساليب مثل الإدراج توجه ينقول الموقع التسلسل (تراديس)، ينقول التسلسل (Tn-seq)، الإدراج الفائق تتبع حسب تسلسل العميق (يضرب)، و (تسلسل الإدراج إينسيق). جميع هذه الأساليب المصب تعتمد على تشييد المكتبات الإدراج ينقول الكثيفة. بينما ناقلات أخرى قد تحتاج إلى استخدامها لأساليب المصب خاصة، يعطي البروتوكول الموصوفة هنا لمحة عامة عن أبرز النقاط الإجرائية لمتابعة.

Disclosures

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

Acknowledgments

أشكر "مختبر كنيسة جورج" لهدية بلازميد pJA1 الرقيقة. أشكر همبرغر Fabienne وأليكس بويهم من "مختبر كويتي ينال" في بيوزينتروم في بازل للمساعدة في تصريف البكتيرية وتوفير سلالة BW20767. وأشكر أيضا سيملاندير أولين تحريرات مفيدة. تم توفير التمويل لهذه الأبحاث بأموال من جامعة ماسي في نيوزيلندا والمبادرة السويسرية في "بيولوجيا الأنظمة" (مشروع "X معركة" منح ديرك بومان) في جامعة بازل، سويسرا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34, (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269, (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103, (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186, (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95, (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16, (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6, (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106, (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73, (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11, (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258, (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35, (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5, (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461, (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics