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ऐसे ई कोलाई या शिगेला flexneri के रूप में Enterobacterial उपभेदों में बैक्टीरियल विकार का उपयोग कर एक घने Transposon प्रविष्टि पुस्तकालय का निर्माण

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां प्रस्तुत ई कोलाई या शिगेला flexneri बैक्टीरियल विकार का उपयोग कर में एक उच्च घनत्व transposon प्रविष्टि पुस्तकालय बनाने के लिए एक सरल तरीका है । इस प्रोटोकॉल एक transposon के यादृच्छिक जीनोमिक प्रविष्टि द्वारा बैक्टीरिया में अद्वितीय म्यूटेंट के हजारों की सैकड़ों की एक संग्रह के निर्माण की अनुमति देता है ।

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Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

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Abstract

Transposon mutagenesis एक विधि है कि डीएनए के एक टुकड़े के यादृच्छिक जीनोमिक प्रविष्टि के माध्यम से जीन व्यवधान की अनुमति देता है एक Transposon कहा जाता है । प्रोटोकॉल के नीचे एक कनमीसिन प्रतिरोध मार्कर युक्त एक transposon बंदरगाह एक प्लाज्मिड के जीवाणु उपभेदों के बीच उच्च दक्षता हस्तांतरण के लिए एक विधि रूपरेखा । प्लाज्मिड-बोर्न transposase एक संस्करण tnp जीन है कि बहुत कम प्रविष्टि पूर्वाग्रह के साथ प्राप्तकर्ता तनाव के जीनोम में transposon आवेषण द्वारा इनकोडिंग है । इस प्रकार इस विधि बड़े उत्परिवर्ती पुस्तकालयों जिसमें transposons या तो ई कोलाई या शिगेला flexneri बैक्टीरिया की एक प्राप्तकर्ता तनाव में अद्वितीय जीनोमिक पदों में डाला गया है के निर्माण की अनुमति देता है । बैक्टीरियल विकार का उपयोग करके, के रूप में अंय तरीकों का विरोध किया जैसे electroporation या रासायनिक परिवर्तन, अद्वितीय क्लोन के हजारों की सैकड़ों के साथ बड़े पुस्तकालयों बनाया जा सकता है । इस पैदावार उच्च घनत्व सम्मिलन पुस्तकालयों, सम्मिलन के साथ के रूप में अक्सर के रूप में गैर-आवश्यक जीन में हर 4-6 आधार जोड़े. इस विधि के रूप में यह एक सस्ती, प्रयोग करने में आसान है, और एक घने transposon प्रविष्टि पुस्तकालय के निर्माण के लिए उच्च दक्षता विधि के लिए अनुमति देता है अंय तरीकों से बेहतर है । transposon पुस्तकालय ऐसे transposon अनुक्रमण (तमिलनाडु-Seq) के रूप में बहाव अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, आनुवंशिक संपर्क नेटवर्क, या अधिक बस, उत्परिवर्तन (आगे आनुवंशिक) स्क्रीन में अनुमान है ।

Introduction

बैक्टीरिया में transposon mutagenesis पुस्तकालयों के निर्माण अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए उपयोगी है, बैक्टीरियल रोगजनकों में डाह जीन की खोजों से लेकर1,2, आवश्यक जीन3के अध्ययन के लिए, 4 , 5 , 6, आनुवंशिक संपर्क नेटवर्क की पहचान करने के लिए7,8,9। इन अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण म्यूटेंट की एक बड़ी पुस्तकालय बनाने की क्षमता है । transposons का उपयोग (डीएनए के छोटे टुकड़े है कि बेतरतीब ढंग से एक जीनोम में डालने) जीन समारोह में खलल डालने का एक सरल साधन है, के रूप में खुले पढ़ने के फ्रेम या एक जीन के विनियामक क्षेत्र के भीतर एक transposon की प्रविष्टि अक्सर समारोह या अभिव्यक्ति को बाधित करेगा जीन की ।

यहां उल्लिखित एक transposon पुस्तकालय के निर्माण के लिए एक विधि है या तो ई. कोलाई या एस flexneri बैक्टीरियल विकार द्वारा प्लाज्मिड pJA110का उपयोग करके । इस प्लाज्मिड का उपयोग करने के दो मुख्य लाभ हैं । पहला लाभ यह है कि Tn10 transposase के संस्करण pJA1 प्लाज्मिड से व्यक्त inducible है और कम प्रविष्टि पूर्वाग्रह11,12है, जिसका अर्थ है कि transposon बेतरतीब ढंग से जीनोम में एकीकृत होगा जब Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) मीडिया में जोड़ा जाता है । transposon एक कनमीसिन प्रतिरोध मार्कर शामिल, प्राप्तकर्ता तनाव के गुणसूत्र में transposon आवेषण के साथ म्यूटेंट के चयन के लिए अनुमति देता है । pJA1 प्लाज्मिड का दूसरा लाभ यह है कि यह प्रतिकृति के एक R6K उत्परिवर्ती मूल शामिल हैं । R6K उत्परिवर्ती प्रतिकृति की उत्पत्ति के क्रम में प्लाज्मिड13के रखरखाव के लिए लैंब्डा पीर जीन की आवश्यकता है । के रूप में प्लाज्मिड पीर- उपभेदों में नकल नहीं कर सकते, यह प्राप्तकर्ता तनाव (चित्रा 1) में खो जाएगा । यह सुनिश्चित करता है कि Tn10 transposase सेल से हटा दिया जाता है और अब सक्रिय नहीं है, प्रारंभिक स्थानांतरण घटना के बाद आगे उत्परिवर्तनों को कम करने ।

बैक्टीरियल विकार के उपयोग के लिए दाता तनाव से pJA1 प्लाज्मिड ले जाने के लिए प्राप्तकर्ता तनाव कई कारणों के लिए लाभप्रद है । विकार सरल और सस्ती करने के लिए प्रदर्शन और एक electroporator के रूप में विशेष उपकरणों की जरूरत नहीं है । इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल विकार की उच्च दक्षता एक बहुत बड़ी पुस्तकालय के लिए अनुमति देता है (& #62; 2 एक्स 105 अद्वितीय सम्मिलन) रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति6के बस कुछ मिलीलीटर (एमएल) के साथ प्राप्त किया जा करने के लिए. प्रक्रिया हाथ के दो घंटे के आसपास लेता है समय पर साथ मशीन और बैक्टीरिया के विकास के लिए समय के साथ । Langridge एट अल. 14 की रिपोर्ट प्रदर्शन १३० electroporations एक आकार के एक transposon mutagenesis पुस्तकालय बनाने के लिए यहां वर्णित एक8है, जो एक ही विकार के साथ हासिल की है । १३० electroporations का उपयोग श्रम गहन और समय लेने वाली electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी और कई महंगी सामग्री के उपयोग की आवश्यकता है (उदा., electroporation cuvettes), अकेले उपभोग्य सामग्रियों में $१,००० USD से अधिक की लागत से । अंय अध्ययनों से10 इसी तरह के तरीकों का इस्तेमाल किया है, लेकिन विभिंन जीवाणु उपभेदों के साथ, और अब तक छोटे पुस्तकालय आकार (5 x 104 कॉलोनी इकाइयों के गठन) हासिल की तुलना में यहां की सूचना दी ।

दाता तनाव पर नोट्स: दाता यहां इस्तेमाल किया तनाव ई. कोलाई तनाव BW2076715 pJA1 transposon प्लाज्मिड16युक्त है । तनाव BW20767 अंय उपभेदों के लिए संयुग्म कर सकते हैं, pJA1 प्लाज्मिड के हस्तांतरण अत्यधिक कुशल बना । इसके अलावा, महत्वपूर्ण बात, BW20767 है लैंब्डा पीर + । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, प्लाज्मिड pJA1 केवल लैंब्डा पीर जीन युक्त उपभेदों में बनाए रखा जा करने में सक्षम है । यह तनाव कनमीसिन और एम्पीसिलीन प्रतिरोधी है । pJA1 प्लाज्मिड एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर शामिल है, और एक कनमीसिन प्रतिरोध मार्कर transposon के भीतर निहित है । इस तनाव १०० µ g/एमएल पर एम्पीसिलीन का उपयोग कर प्लाज्मिड पर चयन के साथ उगाया जाता है । यह भी ध्यान देने योग्य है कि अन्य उपभेदों constitutively व्यक्त transposase जीन के अस्थिर होने के लिए जाना जाता है के लायक है, और जबकि यहाँ इस्तेमाल किया transposase inducible नियंत्रण के तहत है, वहाँ टपका हुआ अभिव्यक्ति के एक कम जोखिम रहता है. इस कारण से, यह सुझाव दिया है कि इस तनाव के पारित होने के लिए और अधिक से कम किया जाना चाहिए एक नई लकीर एक नया पुस्तकालय तैयार करने के लिए एक जमे हुए संस्कृति से लिया जाना चाहिए । दाता यहां इस्तेमाल किया तनाव अनुरोध पर हमारी प्रयोगशाला से उपलब्ध है ।

प्राप्तकर्ता तनाव पर नोट्स: प्राप्तकर्ता तनाव ऐसी K12 के रूप में पसंद का एक तनाव हो सकता है, एस flexneri के ई. कोलाई या उपभेदों के प्रयोगशाला उपभेदों व्युत्पंन (भी, चर्चा देखें) प्राप्तकर्ता तनाव एक अतिरिक्त एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर कि कनमीसिन प्रतिरोध नहीं है, ताकि दाता तनाव के खिलाफ चुना जा सकता है होना चाहिए । प्राप्तकर्ता तनाव के लिए, एक ई. कोलाई MG1655 तनाव यहां एक शुरू सहज nalidixic एसिड उत्परिवर्तन के साथ प्रयोग किया जाता है । सहज nalidixic एसिड उत्परिवर्ती बाहर चढ़ाना द्वारा चयनित किया गया था 2 २०० µ एल में रात संस्कृति के एमएल aliquots nalidixic एसिड युक्त प्लेटों पर 30 µ जी/ MG1655 का एक क्लोन चुना गया था कि nalidixic एसिड के लिए प्रतिरोधी को प्राप्तकर्ता तनाव बन गया था । इसके अतिरिक्त, प्राप्तकर्ता तनाव होना चाहिए लैंब्डा पीर नकारात्मक, के रूप में ऊपर वर्णित है ।

अवलोकन: एक बार बैक्टीरियल विकार जगह ले ली है और pJA1 प्लाज्मिड प्राप्तकर्ता तनाव में दाता तनाव से स्थानांतरित कर दिया गया है, मीडिया के लिए IPTG के अलावा tnp जीन है, जो IPTG के नियंत्रण में है की अभिव्यक्ति प्रेरित करेंगे inducible lacIq/Ptac प्रवर्तक (चित्र 1) । pJA1 पर tnp जीन एक उत्परिवर्ती transposase जो हॉट स्पॉट6,10,11में प्रविष्टि के एक कम आवृत्ति है । इसके अलावा और IPTG के साथ प्रेरण, transposon सक्रिय है और बेतरतीब ढंग से जीनोम में डाला । प्लाज्मिड लैंब्डा पीर-प्राप्तकर्ता तनाव में नहीं रखा जा सकता है और खो दिया है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > सावधानी: यदि एक प्राप्तकर्ता तनाव के रूप में एस flexneri का उपयोग कर, कृपया ध्यान दें कि एस flexneri एक मानव रोगज़नक़ कि जठरांत्र रोग पैदा कर सकता है । एस flexneri शामिल प्रयोगों उचित सुरक्षा सावधानियों के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए (बीएसएल में नामित-2 यूरोप और संयुक्त राज्य अमेरिका या ंयूजीलैंड में PC2 में) । इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े वीडियो में प्रदर्शन किया सभी प्रयोगों में एक PC1 सेटिंग में गैर रोगजनक ई. कोलाई MG1655 की अच्छी तरह से विशेषता प्राप्तकर्ता तनाव का उपयोग किया गया । के साथ काम करें शिगेला flexneri पहले एक बीएसएल में Biozentrum-2 लैब में किया गया था, के रूप में वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > 6 .

< p class = "jove_content" > नोट: निम्नलिखित प्रयोग प्रभावी ढंग से दो बार किया जाता है । पहले भाग (चरण १.१-४.५ कदम) को बाहर पुस्तकालय है, जहां लक्ष्य विकार जो प्लेट प्रति कई व्यक्ति कालोनियों देता है की एक कमजोर पड़ने मिल रहा है के लिए सबसे अच्छा कमजोर पड़ने मिल प्रदर्शन किया है, लेकिन कई नहीं है कि एक लॉन रूपों । यह काफी कम फिटनेस और अधिक मजबूत फिटनेस के साथ उन के साथ म्यूटेंट के बीच प्रतिस्पर्धा को कम करने के लिए है । दूसरा भाग (स्टेप्स ५.१-७.४) अंतिम पुस्तकालय का निर्माण है, जहां कई प्लेटें पुस्तकालय के उपयुक्त कमजोर पड़ने का फैलाव है ।

< p class = "jove_title" > 1. एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए तैयार करने के लिए

  1. लगाना, एक जमे हुए शेयर से, £ शोरबा के 2 मिलीलीटर में दाता तनाव, मिलर्स नुस्खा (10 जी पर NaCl/१०० & #181; g/एमएल । दाता यहां इस्तेमाल किया तनाव ई. कोलाई तनाव BW20767 < सुप वर्ग = "xref" > १५ हार्बर pJA1 प्लाज्मिड < सुप क्लास = "xref" > ११ . एम्पीसिलीन का उपयोग pJA1 प्लाज्मिड.
  2. के लिए चयन जारी रखता है
  3. लगाना, एक ही कॉलोनी या जमे हुए शेयर से, एम्पीसिलीन या कनमीसिन के अलावा एक प्रतिरोध मार्कर के साथ पौंड मीडिया के 2 मिलीलीटर में प्राप्तकर्ता तनाव । प्राप्तकर्ता यहां इस्तेमाल किया तनाव ई. कोलाई & #34; वाइल्ड टाइप & #34; तनाव MG1655 < सुप वर्ग = "xref" > 17 , < सुप क्लास = "xref" > 18 एक सहज प्रतिरोध उत्परिवर्ती के साथ nalidixic एसिड । यह 30 & #181; जी/एमएल nalidixic एसिड में उगाया जाता है ।
  4. १.५% आगर प्लेट युक्त 20 Luria शोरबा तैयार (९० मिमी पेट्री व्यंजन में, लगभग १२.५ मिलीलीटर) । आगार प्लेटें एंटीबायोटिक कमी 4 में संग्रहित किया जा सकता है & #176; C उपयोग तक कई महीनों के लिए ।
  5. १.५% आगर प्लेट युक्त 20 Luria शोरबा तैयार करते हैं (९० मिमी पेट्री व्यंजन में, लगभग १२.५ एमएल) दोनों nalidixic एसिड युक्त 30 & #181; g/ml और कनमीसिन पर ५० & #181; g/ml (LBA Nal30 Kan50) । जब तक उपयोग करने के लिए कई महीनों के लिए 4 & #176; सी में एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटें अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. बाँझ पौंड मीडिया के २०० मिलीलीटर तैयार करते हैं. पौंड मीडिया कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  7. IPTG के १०० mM बाँझ स्टॉक की 1 मिलीलीटर तैयार, निर्माता के अनुसार & #39; s निर्देश.
< p class = "jove_title" > 2. बैक्टीरियल संभोग या विकार

  1. 1 मिनट के लिए दाता तनाव के 1 मिलीलीटर की एमएल १४,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर । विकास मीडिया छोड़ें । यह कदम सभी विकास एंटीबायोटिक दवाओं युक्त मीडिया को दूर करने के लिए किया जाता है ।
  2. सेल गोली ११० में reसस्पैंड & #181; £ के एल (एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त नहीं), इस प्रकार संस्कृति ध्यान केंद्रित ।
  3. बाँझ संदंश का उपयोग कर, स्थिति एक बाँझ nitrocellulose फिल्टर (वैकल्पिक रूप से सोख्ता कागज का एक बाँझ टुकड़ा इस्तेमाल किया जा सकता, एक LBA प्लेट के बीच पर सामग्री सूची देखें) (एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त नहीं). लेबल प्लेट & #34; नकारात्मक नियंत्रण: दाता & #34;.
  4. एक पिपेट का उपयोग कर, ड्रॉप ५० & #181; फ़िल्टर पर केंद्रित दाता संस्कृति के एल.
  5. दोहराएँ चरण 2.1-4 प्राप्तकर्ता तनाव के लिए, प्लेट लेबलिंग & #34; ऋणात्मक नियंत्रण: प्राप्तकर्ता. & #34;
  6. पुस्तकालय के लिए
  7. , ड्रॉप ५० & #181; क l द दाता (चरण २.२ से) और ५० & #181; l के प्राप्तकर्ता तनाव (२.५ कदम से) एक LBA प्लेट पर एक बाँझ फिल्टर पर (इन प्लेटों एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल नहीं करना चाहिए). लेबल इस प्लेट & #34; लाइब्रेरी. & #34; सहवास इसलिए होता है क्योंकि दाता और प्राप्तकर्ता फ़िल्टर पर करीबी शारीरिक संपर्क में होते हैं.
  8. जगह पर फिल्टर युक्त प्लेटें आगर ३७ & #176; ग के लिए 6 ज.
< p class = "jove_title" > 3. Transposase के IPTG प्रेरण द्वारा pJA1 Transposon के सक्रियण

  1. 1 मिमी (IPTG के १०० mm स्टॉक के एल के एक अंतिम एकाग्रता पर के साथ पौंड के 2 मिलीलीटर से युक्त ३ १५ मिलीलीटर शंकु शीशियों तैयार करते हैं.) । प्रत्येक लेबल: दाता नियंत्रण, प्राप्तकर्ता नियंत्रण, और पुस्तकालय ।
  2. ३७ पर विकास के 6 ज के बाद मशीन से प्लेटें हटा & #176; C (चरण २.४ से) । फिल्टर पर कुछ बैक्टीरियल ग्रोथ दिखाई देनी चाहिए ।
  3. बाँझ संदंश का उपयोग कर, दाता नियंत्रण से फिल्टर कागज निकालें और इसे 15 मिलीलीटर शंकु शीशी लेबल दाता नियंत्रण (३.१ कदम से) में जगह है । प्राप्तकर्ता नियंत्रण और लायब्रेरी के लिए समान करें ।
  4. नल ट्यूबों 15 एमएल शंकु शीशी के नीचे करने के लिए फिल्टर कागज पाने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से पौंड में जलमग्न है ।
  5. nitrocellulose फ़िल्टर से बैक्टीरिया असंबद्ध करने के लिए अधिक से कम एक पूर्ण मिनट के लिए
  6. भंवर ट्यूबों. पौंड जीवाणु कोशिकाओं के साथ बादल बन जाना चाहिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
  7. बाँझ काँच का मोती या बाँझ का प्रसारकर्ता, प्लेट २०० & #181 का उपयोग; l भंवरी बैक्टीरिया के निलंबन से LBA पर दाता के नियंत्रण Nal30 Kan50 प्लेट्स लेबल & #34;D onor control, २०० & #181; l & #34;.
  8. ऊपर दिए गए चरण को दोहराएँ (३.६) प्राप्तकर्ता नियंत्रण के लिए, प्लेटों को लेबल करना & #34; प्राप्तकर्ता नियंत्रण, २०० & #181; L & #34;.
  9. (३.७) के ऊपर दिए गए चरण को दोहराएं, लायब्रेरी के लिए लेबलिंग करें & #34; लाइब्रेरी, २०० & #181; L & #34;.
  10. अतिरिक्त कमजोर पड़ने ( अर्थात् , 1:5, 1:10 और 1:100 कमजोर पड़ने, का उपयोग पौंड एक मंदक के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त नहीं) पुस्तकालय के । प्लेट २०० & #181; अनपतला पुस्तकालय और अतिरिक्त कमजोर पड़ने पर उचित लेबल LBA Nal30 Kan50 प्लेटों के एल.
  11. में जगह प्लेटें ३७ & #176; सी मशीन के लिए 18 एच transposons के साथ क्लोन एक जीन है कि फिटनेस का एक बड़ा नुकसान का कारण बनता है में डाला अधिक समय लग सकता है बढ़ने और थाली पर दिखाई देते हैं । कई तरह की कॉलोनी साइज की होनी चाहिए (< मजबूत क्लास = "xfig" > फिगर 3 ) । दाता और प्राप्तकर्ता तनाव प्लेटें उन पर कोई कालोनियों होना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 4. पुस्तकालय के उपयुक्त कमजोर पड़ने का चयन करने के लिए अंतिम उत्परिवर्ती पुस्तकालय के लिए इस्तेमाल किया जा

  1. कदम ३.९ से पुस्तकालय के एक कमजोर पड़ने का निर्धारण है कि अलग आकार है कि पर्याप्त स्थान है की कई कालोनियों पैदावार । उद्देश्य एक थाली पर संभव के रूप में कई कालोनियों के रूप में मिल रहा है, लेकिन कई कि कालोनियों एक दूसरे में विलय और संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा नहीं है । यह नंबर प्लेट प्रति लगभग 500-2000 कालोनियों का होना चाहिए । एक प्लेट पर उपयुक्त कॉलोनी घनत्व का एक उदाहरण < मजबूत वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 3 .
  2. ने प्लेटों पर कालोनियों की संख्या रिकॉर्ड की ।
  3. की आवृत्ति की गणना विकार (प्राप्तकर्ता प्रति conjugants की संख्या कक्ष) । यह 1 x 10 -4 की श्रेणी में होना चाहिए 1 x 10 -6 < सुप class = "xref" > 19 .
  4. बहाव अनुप्रयोगों के आधार पर अंतिम पुस्तकालय में वांछित म्यूटेंट की संख्या निर्धारित करते हैं । कई उपयोगकर्ताओं को बस के रूप में संभव के रूप में कई म्यूटेंट के साथ एक पुस्तकालय की आवश्यकता । सैद्धांतिक रूप से संभव के रूप में कई transposon सम्मिलन के रूप में उत्पन्न करने के लिए (एक प्रविष्टि हर आधार जोड़ी), अनुमानित के लिए लक्ष्यजीनोम में आधार जोड़े के रूप में कालोनियों की ही संख्या ( यानी , ~ ४.५ x 10 6 ई. कोलाई के लिए) पूरी तरह से सभी संभव transposon सम्मिलन के साथ जीनोम संतृप्त करने के लिए । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, कई म्यूटेंट आवश्यक या कार्यात्मक महत्वपूर्ण जीन में सम्मिलन बंदरगाह को बरामद नहीं किया जा करने में सक्षम हो जाएगा, के रूप में इन उत्परिवर्तनों प्राप्तकर्ता के लिए घातक हो जाएगा.
  5. परिकलित करें कि इच्छित आकार की लायब्रेरी बनाने के लिए प्रारंभिक लायब्रेरी की कितनी मात्रा की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, इच्छित लायब्रेरी का आकार 5 x 10 4 म्यूटेंट है । कदम ३.९ से कालोनियों की सबसे अच्छी रिक्ति के साथ कमजोर पड़ने २०० & #181 था; एक 1:10 कमजोर पड़ने के एल. इस प्लेट पर कालोनियों की संख्या लगभग २,००० कालोनियों होने का अनुमान है । यदि 5 x 10 4 म्यूटेंट की जरूरत है और प्रत्येक प्लेट २,००० कालोनियों है, तो इस कमजोर पड़ने पर 25 प्लेट की जरूरत होगी ।
< p class = "jove_title" > 5. अंतिम उत्परिवर्ती पुस्तकालय की रचना

  1. चरण 1 ३.८ करने के लिए दोहराएँ, की आवश्यकता के रूप में कदम १.४ पर प्लेटों की संख्या को समायोजित (चरण ४.४ देखें).
  2. पर कदम ३.९, प्लेट कमजोर पड़ने के रूप में कई प्लेटों पर इच्छित आकार के पुस्तकालय बनाने के लिए आवश्यक के रूप में चरण ४.१ में चुना (चरण ४.४ देखें).
< p class = "jove_title" > 6. अनुमान पुस्तकालय घनत्व

  1. गिनती कितनी कालोनियों वहां प्रति थाली रहे हैं, और इस तरह कैसे घने पुस्तकालय का एक मोटा अनुमान मिलता है । उदाहरण के लिए: कुल 2x10 5 कालोनियों को चढ़ाया जाता है । ई. कोलाई MG1655 जीनोम के बारे में ४.५ x 10 6 आधार जोड़े है । इसलिए, के बारे में 2 x 10 5 आवेषण के साथ एक पुस्तकालय का मतलब है कि वहां औसतन हर 22 आधार जोड़े पर एक डालने है और है कि प्रत्येक जीन के बारे में ४५ बार रूप में बदलना चाहिए, यह देखते हुए कि एक जीन लगभग 1 x 10 3 आधार जोड़े । आवश्यक जीन में सम्मिलन इस पुस्तकालय में बहुत अधिक प्रतिनिधित्व होने की संभावना है, और इस प्रकार गैर-आवश्यक जीनों में घनत्व इस से अधिक होने की संभावना है. गणना के इस तरह के transposon घनत्व का एक व्यापक अनुमान के साथ एक प्रदान करता है ।
< p class = "jove_title" > 7. पूलिंग Transposon लाइब्रेरी और स्टोरेज

  1. कालोनियों की गिनती के बाद, पौंड की 1 मिलीलीटर (या अधिक, के रूप में आवश्यक) पुस्तकालय की थाली में जोड़ें और एक बाँझ प्रसारकर्ता का उपयोग करने के लिए थाली से बंद बैक्टीरिया परिमार्जन । बैक्टीरियल सस्पेंशन और एक ५० मिलीलीटर या 15 मिलीलीटर शंकु शीशी में जगह निकालें । सभी प्लेटों के लिए दोहराएँ.
  2. भंवर homogenize निलंबन करने के लिए एक पूर्ण मिनट के लिए परित बैक्टीरिया सस्पेंशन.
  3. 20% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ ग्लिसरॉल जोड़ें.
    1. तैयार १०० x 20 & #181; L aliquots में ०.२५ मिलीलीटर ट्यूबों आसान पुनः वृद्धि के लिए.
    2. को cryovials में कम से दो या अधिक 1 मिलीलीटर aliquot तैयार करें ।
  4. स्टोर सब aliquots पर-८० & #176; ग

Representative Results

विकास के 18 घंटे के बाद, प्लेटों कॉलोनी आकार की एक किस्म के साथ कई कालोनियों में शामिल होना चाहिए ( चित्रा 3) । विभिंन कॉलोनी आकार बदलती फिटनेस के क्लोनों का संकेत है, और एक अच्छा संकेत है कि प्रोटोकॉल काम किया है । दाता और प्राप्तकर्ता के नियंत्रण में प्लेटों पर कोई वृद्धि नहीं होनी चाहिए । ऊपर प्रोटोकॉल का प्रयोग अच्छी तरह से अधिक उपज चाहिए 2 x 105 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) । ऊपर प्रोटोकॉल स्केलिंग पांच दोहराने conjugations में एक बार लगभग 1 x 106 CFU उपज चाहिए । पिछले काम में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग कर विश्लेषण संकेत दिया है कि इस तरह के एक स्केल अप पुस्तकालय होना चाहिए & #62; 2 एक्स 105 अद्वितीय सम्मिलन6. बहुत उच्च CFU पर (यानी, 1 x 106 CFU) अद्वितीय निवेशन की दर पठार की उंमीद है, के रूप में सभी उपलब्ध (गैर घातक) सम्मिलन का प्रतिनिधित्व हो जाता है ।

Figure 1
चित्र 1 : बैक्टीरिया विकार और गुणसूत्र में transposon की प्रविष्टि के योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : पहले और भंवर के बाद पौंड मीडिया में submersed फिल्टर की छवि । इससे पहले कि भंवरा, कोशिकाओं को फिल्टर करने के लिए अटक गया है और मीडिया स्पष्ट है । भंवरे के बाद मीडिया में बादल छा जाते हैं जैसे कोशिकाएं फिल्टर से उतर आई हैं और मीडिया में हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : () विकास के १८ ज के बाद transposon पुस्तकालय की प्रतिनिधि प्लेट. () कॉलोनी के आकारों के करीब । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक घने सम्मिलन पुस्तकालय के निर्माण के लिए अनुमति देता है । इस विधि के साथ एक transposon पुस्तकालय के निर्माण के लिए अनुमति देता है 2 x 105 अद्वितीय transposon म्यूटेंट संस्कृति volume6के तहत 5 मिलीलीटर का उपयोग कर । यह अपेक्षाकृत करने के लिए आसान है, सबसे बुनियादी माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध एजेंट का उपयोग करता है, स्केलेबल है, और महंगा उपकरण या ऐसे electroporation cuvettes के रूप में उपभोग्य सामग्रियों के रास्ते में कम की आवश्यकता है ।

इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि, सिद्धांत रूप में, उपयोगकर्ता enterobacterial प्राप्तकर्ता उपभेदों के चयन में व्यापक अक्षांश है । इस पत्र के रूप में अच्छी तरह से दूसरों के रूप में11, एक प्राप्तकर्ता तनाव के रूप में ई. कोलाई का उपयोग करें, लेकिन pJA1 प्लाज्मिड ऐसे शिगेला flexneri6 और साल्मोनेला enterica के रूप में अंय enterobacterial प्राप्तकर्ता प्रजातियों के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है serovar Typhimurium तनाव SL134410. सैद्धांतिक रूप से, pJA1 में प्रतिकृति (ओरिR6Kγ) के γ मूल इस प्लाज्मिड एक व्यापक मेजबान रेंज19में बनाए रखा जा करने की अनुमति देता है, कि प्राप्तकर्ता तनाव पीर + है । हाल ही में, नए तरीकों का वर्णन किया गया है कि पीर + के निर्माण के लिए अनुमति enterobacterial उपभेदों20की एक श्रेणी में, अतिरिक्त लचीलापन दे रही है । इसके अतिरिक्त, pJA1 में RP4 प्लाज्मिड से३०० आधार जोड़ी भीड़ क्षेत्र के लिए इस प्लाज्मिड के conjugative हस्तांतरण की अनुमति देता है ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल उपभेदों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए19। सीधे शब्दों में कहें, इस विधि सैद्धांतिक रूप से प्राप्तकर्ता उपभेदों की एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जब तक कई शर्तों से मुलाकात कर रहे हैं: तनाव पीर+ है, और एक एंटीबायोटिक कनमीसिन के अलावा अंय प्रतिरोध और दाता तनाव से अंय के साथ चिह्नित है ।

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ४.१ चरण में बाहर प्लेट करने के लिए कोशिकाओं की उचित संख्या का आकलन करने में निहित है । अगर कालोनियों को भी बारीकी से जगह है, वे थाली और कम फिट म्यूटेंट पर पोषक तत्वों के लिए प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं । इससे म्यूटेंट की कुल संख्या में कमी आ सकती है । वैकल्पिक रूप से, अगर कालोनियों बहुत दूर दूरी पर हैं, वहां भी थाली पर कुछ कालोनियों होगा, और एक बड़े पुस्तकालय को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्लेटों आगार की कुल संख्या भारी हो जाता है । इसलिए, थाली प्रति कॉलोनी संख्या के मामले में सही संतुलन को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है ।

यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध नियंत्रणों को निष्पादित करना महत्वपूर्ण है जो चरणों को वर्णित करते हुए कार्य कर रहे हैं । विशेष रूप से, जब दाता तनाव के खिलाफ एक काउंटर चयन के रूप में nalidixic एसिड का उपयोग कर, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है नकारात्मक दाता नियंत्रण प्लेटें कालोनियों से मुक्त हैं । यह है क्योंकि वहां एक कम दर (लगभग 1 x 10-10) nalidixic एसिड के लिए सहज प्रतिरोध के21 , झूठी सकारात्मक उपज हो सकता है । आमतौर पर, विकार और स्थानांतरण की दर लगभग 2 x 10-4 19है । इसलिए, विकार और स्थानांतरण की दर nalidixic एसिड के लिए सहज प्रतिरोध की दर से अधिक परिमाण के कई आदेश है । इसलिए, सच स्थानांतरण घटनाओं की तुलना में झूठी सकारात्मक की दर बहुत कम है और समझा जब प्रोटोकॉल काम कर रहा है नगण्य है । हालांकि, अगर विकार या स्थानांतरण की दरों में काफी कम कर रहे हैं, (कम संभोग दक्षता और/या IPTG के साथ transposase जीन की प्रेरण की कमी से) और प्रोटोकॉल को इस के लिए क्षतिपूर्ति, तो झूठी सकारात्मक की संख्या (क्लोन है कि transposon डाला नहीं है) भी बढ़ सकता है ।

कुछ संशोधनों के कदम ३.२ और ३.१० में मशीन समय के लिए किया जा सकता है । चरण ३.२ में कहा गया है कि विकार 6 एच के लिए होना चाहिए, लेकिन हमारे अनुभव में, इस समय कदम अलग किया जा सकता है (यानी, 4-7 एच) परिणामों को बदलने के बिना काफी । इसके अतिरिक्त, चरण ३.१० में, समय की लंबाई कॉलोनियों पर लगाई गई हैं, वे भी समायोजित किया जा सकता है । यह औसत दोहरीकरण समय या प्राप्तकर्ता तनाव की वृद्धि दर के आधार पर विविध किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हमारे अनुभव में, 18 एच कॉलोनी आकार की एक किस्म उपज, विविध फिटनेस के एक पुस्तकालय का संकेत है । हालांकि, बहुत कम फिटनेस के साथ कालोनियों बढ़ने में अधिक समय लग सकता है और इस प्रकार 18 एच के बाद दिखाई नहीं हो सकता है । यदि इस विधि के लिए अत्यंत कम फिटनेस के क्लोन खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, अब मशीन समय और प्लेट पर कम कालोनियों भीड़ को कम करने के लिए (, ४८ एच, 50-300 कालोनियों) इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस विधि के अतिरिक्त नुकसान शामिल है कि यह संभव है कि पहले से ही कनमीसिन प्रतिरोधी है एक प्राप्तकर्ता तनाव का उपयोग नहीं है । यह इस बाधा को दूर करने के लिए क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध के रूप में एक वैकल्पिक चयन मार्कर, के लिए pJA1 प्लाज्मिड में कनमीसिन प्रतिरोध मार्कर बाहर स्वैप करने के लिए संभव हो सकता है. यह भी ध्यान देने योग्य है कि, सिद्धांत रूप में, यह एक प्राप्तकर्ता तनाव है कि एम्पीसिलीन प्रतिरोधी है, का उपयोग संभव है लायक हो सकता है एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर युक्त प्लाज्मिड pJA1 के रूप में शीघ्र ही स्थानांतरण के बाद खो दिया है ।

चुनाव के आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एक घने transposon पुस्तकालय के निर्माण संभावित कई बहाव अनुप्रयोगों के लिए लाभप्रद है । उदाहरण के लिए, एक घने transposon पुस्तकालय प्रतिकृति चढ़ाना22 का उपयोग कर auxotrophic म्यूटेंट की पहचान करने के लिए या एक संक्रमण1,2की स्थापना में दोषपूर्ण है कि म्यूटेंट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हाल ही में, डीएनए अनुक्रमण लागत गिरा दिया है और ऐसी अगली पीढ़ी अनुक्रमण के रूप में नई प्रौद्योगिकियों आम हो गए हैं, transposon पुस्तकालयों गहरे डीएनए अनुक्रमण के साथ जीन आवश्यकता, जीन समारोह में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और आनुवंशिक बातचीत. इन विधियों में से कुछ की समीक्षा की है 23 और शामिल विधियों जैसे transposon-निर्देशित प्रविष्टि साइट sequencing (TraDIS), transposon अनुक्रमण (तमिलनाडु-seq), उच्च-प्रवाह प्रविष्टि गहरी अनुक्रमण द्वारा ट्रैकिंग (हिट्स), और प्रविष्टि sequencing ( INSeq) । इन सभी बहाव तरीकों घने transposon प्रविष्टि पुस्तकालयों के निर्माण पर भरोसा करते हैं । जबकि अंय वैक्टर विशेष बहाव तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है, प्रोटोकॉल यहां वर्णित मुख्य प्रक्रियात्मक बिंदुओं का अवलोकन देता है का पालन करें ।

Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मैं pJA1 प्लाज्मिड की तरह उपहार के लिए जॉर्ज चर्च लैब धंयवाद । मैं फैबीनी हैमबर्गर और एलेक्स Boehm के उर्स Jenal लैब से Biozentrum में बेसल में बैक्टीरियल विकार के साथ मदद के लिए और BW20767 तनाव प्रदान करने के लिए धंयवाद । मैं भी सहायक संपादन के लिए Olin Silander धंयवाद । इस अनुसंधान के लिए धन ंयूजीलैंड में Massey विश्वविद्यालय से धन और सिस्टम जीवविज्ञान में स्विस पहल (परियोजना "युद्ध एक्स" बेसल, स्विट्जरलैंड के विश्वविद्यालय में कटार Bumann को संमानित किया गया) द्वारा प्रदान किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

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References

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  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
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to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
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  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

3 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM

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