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Création d’un Dense Transposon Insertion bibliothèque à l’aide de la conjugaison bactérienne dans les entérobactéries souches telles que Escherichia Coli et Shigella flexneri

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Présenté ici est une méthode simple pour créer une bibliothèque d’insertion haute densité transposon dans Escherichia coli ou Shigella flexneri utilisant la conjugaison bactérienne. Ce protocole permet la création d’une collection de centaines de milliers de mutants uniques chez les bactéries par l’insertion de génomique au hasard d’un transposon.

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Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

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Abstract

Mutagénèse du transposon est une méthode qui permet de perturbation génétique par l’insertion de génomique au hasard d’un fragment d’ADN appelé transposon. Le protocole ci-dessous décrit un procédé de transfert de haut rendement entre souches bactériennes d’un plasmide hébergeant un transposon contenant un marqueur de résistance kanamycine. La transposase plasmide est codée par un gène variant PNT qui insère les transposons dans le génome de la souche réceptrice avec partialité insertion très faible. Cette méthode permet ainsi la création de grandes bibliothèques mutants dans lequel les transposons ont été insérés dans des positions de génomiques uniques dans une souche de bactéries Escherichia coli ou de Shigella flexneri . Grâce à la conjugaison bactérienne, par opposition à d’autres méthodes telles que l’électroporation ou transformation chimique, les grandes bibliothèques avec des centaines de milliers de clones uniques peuvent être créés. Cela donne des bibliothèques d’insertion haute densité, avec insertions se produisant aussi souvent que chaque 4-6 paires de bases dans les gènes non essentiels. Cette méthode est supérieure aux autres méthodes, car il permet d’utiliser une méthode peu coûteux, facile à utiliser et une efficacité élevées pour la création d’une bibliothèque d’insertion de transposon dense. La bibliothèque de transposon peut être utilisée dans des applications en aval comme le transposon séquençage (Tn-Seq), de déduire des réseaux d’interactions génétiques, ou plus simplement, en mutation (avant génétique) écrans.

Introduction

La création de bibliothèques de mutagénèse transposon chez les bactéries est utile pour une grande variété d’applications, allant de découvertes de gènes de virulence des bactéries pathogènes1,2, à l’étude des gènes essentiels3, 4 , 5 , 6, à l’identification des interactions génétiques réseaux7,8,9. Critique de ces études est la possibilité de créer une grande bibliothèque de mutants. L’utilisation de transposons (courts fragments d’ADN qui insèrent aléatoirement dans un génome) est un moyen simple de perturber la fonction du gène, car l’insertion d’un transposon dans le cadre de lecture ouvert ou de la région de régulation d’un gène va souvent perturber la fonction ou l’expression du gène.

Présentée ici est une méthode pour la création d’une bibliothèque de transposon dans e. coli ou S. flexneri de conjugaison bactérienne, utilisez le plasmide pJA110. Il y a deux principaux avantages à l’utilisation de ce plasmide. Le premier avantage est que la variante de la transposase Tn10 exprimée à partir du plasmide pJA1 est inductible et insertion faible biais11,12, ce qui signifie que le transposon intégrera au hasard dans le génome lorsque isopropylique Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) est ajouté à la presse. Le transposon contient un marqueur de résistance kanamycine, permettant la sélection de mutants avec les inserts de transposons dans le chromosome de la souche réceptrice. Le deuxième avantage du plasmide pJA1 est qu’elle contient une origine mutant R6K de réplication. L’origine de mutant R6K de réplication nécessite le gène de pir lambda dans l’ordre pour le maintien du plasmide13. Comme le plasmide ne peut pas répliquer en variétés de pir , il se perdra dans la souche réceptrice (Figure 1). Cela garantit que Tn10 transposase est retiré de la cellule et qu’il n’est plus actif, de réduire davantage les mutations après l’événement initial de transposition.

L’utilisation de la conjugaison bactérienne pour déplacer le plasmide pJA1 de la souche de donateur à la souche réceptrice est avantageuse pour plusieurs raisons. Conjugaison est simple et peu coûteux à réaliser et n’a pas besoin des équipements spéciaux comme un électroporateur. De plus, l’efficacité élevée de la conjugaison bactérienne permet une très grande bibliothèque (> 2 x 105 insertions unique) à atteindre avec seulement quelques millilitres (mL) d’une nuit de culture bactérienne6. Le processus prend environ deux heures de temps pratique avec temps d’incubation et la croissance des bactéries. Langridge et al. 14 a fait état de 130 électroporations pour créer une bibliothèque de mutagénèse transposon d’une taille similaire à celle décrite ici8, qui est obtenue grâce à une conjugaison unique. L’utilisation de 130 électroporations nécessite du travail intensif et fastidieuse préparation de cellules electrocompetent et l’utilisation de nombreux matériaux coûteux (p. ex., des cuvettes d’électroporation), pour un coût de plus de 1 000 $ US en consommables seuls. Autres études10 ont utilisé des méthodes similaires, mais avec différentes souches bactériennes et réalisé beaucoup de plus petites tailles de bibliothèque (5 x 104 unités formant des colonies) que rapportés ici.

Notes sur la souche de donateurs : la souche de donneur utilisée ici est la souche e. coli BW2076715 contenant le pJA1 transposon plasmide16. BW20767 de souche peut conjuguer à d’autres souches, qui procède au transfert du plasmide pJA1 très efficace. En outre, ce qui est important, BW20767 est lambda pir +. Tel que mentionné précédemment, le plasmide pJA1 ne peut être maintenue dans les souches contenant le gène de pir lambda. Cette souche est kanamycine et ampicilline résistante. Le plasmide pJA1 contient le marqueur de résistance ampicilline, et un marqueur de résistance kanamycine est contenu dans le transposon. Cette souche est cultivée avec sélection sur le plasmide utilisant ampicilline à 100 µg/mL. Il est également intéressant de noter que les autres souches hébergeant constitutivement exprimé transposase gènes sont connus pour être instable et alors que la transposase utilisé ici est sous inductible de contrôle, il reste un risque faible d’expression qui fuit. Pour cette raison, il est suggéré que le passage de cette souche doit être minimisé et une strie fraîche doit provenir d’une culture congelée pour chaque nouvelle préparation de bibliothèque. La souche de donneur utilisée ici est disponible dans notre laboratoire sur demande.

Notes sur la souche du destinataire : la souche réceptrice peut être une souche de choix, tels que les souches de laboratoire K12-dérivé d’e. coli ou souches de S.flexneri (voir aussi, la Discussion). La souche réceptrice doit avoir un marqueur de résistance aux antibiotiques supplémentaires qui n’est pas la résistance à la kanamycine, afin que la souche de donateurs peut être sélectionnée contre. Pour la souche réceptrice, une souche MG1655 d’e. coli est utilisée ici avec une mutation spontanée introduit l’acide nalidixique. Le mutant de l’acide nalidixique spontanée a été sélectionné par électrodéposition 2 ml de culture nuitée dans 200 µL d’extraits sur des plaques contenant de l’acide nalidixique à 30 µg/mL. Un seul clone de MG1655 a été sélectionné qui était résistant à l’acide nalidixique pour devenir la souche réceptrice. En outre, la souche réceptrice doit être lambda pir négatif, tel que décrit ci-dessus.

Vue d’ensemble : Une fois que la conjugaison bactérienne a eu lieu et le plasmide pJA1 a déménagé de la souche de donneur dans la souche réceptrice, l’ajout d’IPTG aux médias va entraîner l’expression du gène PNT , qui est sous le contrôle de l’IPTG inductible lacIq/Ptac promoteur (Figure 1). Le gène de la PNT sur pJA1 est une transposase mutante qui a une faible fréquence d’insertion aux points chauds6,10,11. Ajout et induction avec IPTG, le transposon est activé et inséré au hasard dans le génome. Le plasmide ne peut être maintenu dans la souche de pir-recipient lambda et se perd.

Protocol

attention : Si vous utilisez S. flexneri comme une souche réceptrice, veuillez noter que S. flexneri est un pathogène humain qui peut causer des maladies gastro-intestinales. Dans les expériences impliquant S. flexneri doivent être effectués avec précautions de sécurité biologique appropriées (désignées BSL-2 en Europe et aux USA ou PC2 en Nouvelle-Zélande). Toutes les expériences réalisées dans la vidéo associée à ce protocole ont été effectuées à l’aide de la souche réceptrice bien caractérisée non pathogène e. coli MG1655 dans un cadre de PC1. Travail avec Shigella flexneri était précédemment effectué dans un laboratoire BSL-2 à la Biozentrum à Bâle, décrit dans 6.

Remarque : l’expérience suivante est en effet fait deux fois. La première partie (étape 1.1 - étape 4.5) est effectuée pour trouver la meilleure dilution pour le placage sur la bibliothèque, dont le but est de trouver une dilution de la conjugaison qui donne de nombreuses colonies individuelles par plaque, mais pas autant qu’une forme de pelouse. Il s’agit de réduire la concurrence entre les mutants avec aptitude significativement réduite et celles avec remise en forme plus robuste. La seconde partie (mesures 5.1-7,4) est la création de la bibliothèque finale, où plusieurs plaques sont répartis de la dilution appropriée de la bibliothèque.

1. pour préparer un jour avant l’expérience

milieux de recette (NaCl à 10 g/L)
  1. ensemencer, provenant d’un stock congelé, la souche de donneur dans 2 mL de bouillon LB, meuniers contenant de l’ampicilline à 100 µg/mL. La souche de donneur utilisée ici est la souche e. coli BW20767 15 hébergeant le plasmide de pJA1 11. L’utilisation de l’ampicilline maintient la sélection pour le plasmide pJA1.
  2. Ensemencer, à partir d’une seule colonie ou stock congelé, la souche réceptrice dans 2 mL de médias LB avec un marqueur de résistance aux autres que l’ampicilline ou kanamycine. La souche réceptrice utilisée ici est le e. coli " sauvage " MG1655 17 , 18 la souche avec un mutant spontané de résistance à l’acide nalidixique. Elle est cultivé à 30 µg/mL d’acide nalidixique.
  3. Plaques de préparer 20 Luria bouillon contenant 1,5 % d’agar (en plats de Pétri de 90 mM, environ 12,5 mL). Les boîtes de gélose sans antibiotique peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs mois jusqu'à l’utilisation.
  4. Préparer 20 Luria bouillon contenant 1,5 % d’agar plaques (plats de Pétri de 90 mM, environ 12,5 mL) contenant les deux acide nalidixique à 30 µg/mL et la kanamycine à 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50). Les boîtes de gélose contenant des antibiotiques peuvent être stockés dans l’obscurité à 4 ° C pendant plusieurs mois jusqu'à utilisation.
  5. Préparer 200 mL de milieu LB stérile. LB médiatique peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois.
  6. Préparer 1 mL de 100 mM stock stérile d’IPTG, selon fabricant ' instructions de s.

2. L’accouplement ou la conjugaison bactérienne

  1. centrifugeuse 1 mL d’une culture de la souche de donneur pendant 1 minute à 14 000 x g à la température ambiante. Jeter des milieux de culture. Cette étape est faite pour supprimer tous les milieux de culture contenant des antibiotiques.
  2. Resuspendre le culot dans 110 µL de LB (ne contenant ne pas d’antibiotiques), concentrant ainsi la culture.
  3. En utilisant une pince stérile, placer un filtre de nitrocellulose stérile (alternativement une pièce stérile de papier buvard peut être utilisé, voir matériaux liste) au milieu d’une plaque LBA (ne contenant ne pas d’antibiotiques). Étiquette de la " contrôle négatif : donneur ".
  4. à l’aide d’une pipette, déposer 50 µL de la culture de donateurs concentré sur le filtre à.
  5. Répétez les étapes 4-2.1 pour la souche réceptrice, marquage de la plaque " contrôle négatif : destinataire. "
  6. Pour la bibliothèque, déposez 50 µL du donneur (de l’étape 2.2) et 50 µL de la souche réceptrice (de l’étape 2.5) sur un seul filtre stérile sur une plaque LBA (ces plaques ne doivent pas contenir des antibiotiques). Étiquette de cette " bibliothèque. " l’accouplement se produit parce que le donneur et le receveur sont en contact physique direct sur le filtre à.
  7. Placer les plaques de gélose contenant des filtres à 37 ° C pendant 6 h.

3. Activation du Transposon pJA1 par IPTG Induction de la Transposase

  1. Prepare trois 15 mL coniques flacons contenant 2 mL de LB avec IPTG à une concentration finale de 1 mM (c'est-à-dire, 20 µL du stock de 100 mM d’IPTG). Étiquette pour chaque : contrôle du donateur, bénéficiaire contrôle et bibliothèque de.
  2. Enlever les plaques de l’incubateur après 6 h de croissance à 37 ° C (de l’étape 2.4). Certains la croissance bactérienne doit être visible sur le filtre à.
  3. En utilisant une pince stérile, supprimez le filtre en papier du contrôle donateur et placez-le dans la fiole conique de 15 mL intitulée contrôle de donateurs (à l’étape 3.1). Faites de même pour le contrôle du destinataire et la bibliothèque.
  4. Appuyez sur les tubes pour obtenir le papier filtre au fond de la fiole conique de 15 mL et faire en sorte qu’il est entièrement submergé lb
  5. Vortex tubes pendant au moins une minute en haut afin de dissocier les bactéries du filtre de nitrocellulose. Le LB doit devenir nuageux avec des cellules bactériennes ( Figure 2).
  6. à l’aide de billes de verre stérile ou un répartiteur stérile, plaque 200 µL de la suspension de bactéries agité du contrôle donateur sur des plaques de LBA Nal30 Kan50 étiqueté " donneur contrôle, 200 µL ".
  7. Répéter l’étape ci-dessus (3,6) pour le contrôle de bénéficiaires, les plaques d’étiquetage " destinataire contrôle, 200 µL ".
  8. Répéter l’étape ci-dessus (3,7) pour la bibliothèque, les plaques d’étiquetage " bibliothèque, 200 µL ".
  9. Faire des dilutions supplémentaires (p. ex., 1:5, dilutions 01:10 et 1/100, à l’aide de LB ne contenant ne pas d’antibiotiques comme diluant) de la bibliothèque. Plaque 200 µl de bibliothèque non dilué et dilutions supplémentaires sur correctement légendés plaques LBA Nal30 Kan50.
  10. Incubateur
  11. plaques de Place dans les 37 ° C pendant 18 h Clones avec les transposons inséré dans un gène qui cause une grande perte d’aptitude peut prendre plus de temps pour croître et figurer sur la plaque. Il devrait y avoir une variété de tailles de colonie ( Figure 3). Donateurs et plaques de souche réceptrice ne devraient avoir aucune colonie sur eux.

4. Choisir la Dilution appropriée de la bibliothèque à utiliser pour la bibliothèque de Mutant Final

  1. Determine une dilution de la bibliothèque de 3,9 étape qui génère de nombreuses colonies de différentes tailles qui sont convenablement espacés. L’objectif est d’obtenir autant de colonies que possible sur une plaque, mais pas autant que les colonies fusionnent dans un de l’autre et se disputent les ressources. Ce nombre devrait être d’environ 500-2 000 colonies par boîte. Un exemple de densités appropriées colonie sur une plaque est illustré à la Figure 3.
  2. Enregistre le nombre de colonies sur les géloses.
  3. Calculer la fréquence de la conjugaison (le nombre de conjugants par cellule receveuse). Cela devrait être de l’ordre de 1 x 10 -4 à 1 x 10 -6 19.
  4. Déterminer le nombre de mutants désiré dans la bibliothèque finale basée sur les applications en aval. Beaucoup d’utilisateurs nécessite simplement une bibliothèque avec des mutants autant que possible. Pour générer autant insertions de transposon comme théoriquement possibles (une insertion chaque paires de bases), viser approximatively le même nombre de colonies comme les paires de bases dans le génome (c.-à-d., ~4.5 x 10 6 pour e. coli) pour saturer complètement le génome avec toutes les insertions du transposon possible. Il est important de noter que de nombreux mutants hébergeant des insertions dans essentielles ou gènes fonctionnellement importantes ne sera pas en mesure à récupérer, car ces mutations sera fatales au destinataire.
  5. Calculer combien de volume de la bibliothèque initiale est nécessaire pour créer une bibliothèque de la taille désirée. Par exemple, la taille de la bibliothèque souhaitée est 5 x 10 4 mutants. La dilution avec le meilleur espacement des colonies de 3,9 étape a été de 200 µL d’une 01:10 dilution. Le nombre de colonies sur cette assiette est estimé à environ 2 000 colonies. Si 5 x 10 4 mutants sont nécessaires chaque plaque a 2 000 colonies, puis 25 plaques seront nécessaires à cette dilution.

5. Création de la bibliothèque de Mutant Final

  1. Répétez les étapes 1 à 3,8, ajuster le nombre de plaques à l’étape 1.4 si nécessaire (voir étape 4.4).
  2. à l’étape 3.9, plaque la dilution choisie à l’étape 4.1 sur plaques autant que nécessaires pour créer la bibliothèque de la taille désirée (voir étape 4.4).

6. Estimer la densité de la bibliothèque

  1. compter combien de colonies il est par plaque et ainsi obtenir une estimation approximative de la bibliothèque Comment dense est. Par exemple : un total de 2 x 10 5 colonies sont plaqués. Le génome de MG1655 d’e. coli est d’environ 4,5 x 10 6 paires de bases. Par conséquent, une bibliothèque avec environ 2 x 10 5 insère signifie qu’il y a un insert en moyenne chaque 22 paires de bases et que chaque gène devrait être muté environ 45 fois, étant donné qu’un gène est environ 1 x 10 3 paires de bases. Insertions dans les gènes essentiels risquent d’être très sous-représentées dans cette bibliothèque, et donc la densité dans les gènes non essentiels est probablement plus grand que cela. Ce genre de calcul fournit une avec une large estimation de densité de transposon.

7. Mise en commun de la bibliothèque de transposons et stockage

  1. après comptage de colonies, ajouter 1 mL de LB (ou plus, selon les besoins) sur la plaque de la bibliothèque et utiliser un épandeur stérile pour racler les bactéries de la plaque. Retirer la suspension bactérienne et placer dans une fiole conique de 50 mL ou 15 mL. Répéter pour toutes les plaques.
  2. Vortex la suspension de la mise en commun des bactéries pendant une minute à homogénéiser la suspension.
  3. Ajouter glycérol stérile à une concentration finale de 20 %.
    1. Repousse facilement préparer 100 x 20 µL d’extraits en tubes de 0,25 mL.
    2. Préparer au moins deux ouplusieurs aliquote dans cryovials 1 mL.
  4. Stocker tous les aliquotes à -80 ° C

Representative Results

Après 18 heures de croissance, plaques doivent contenir de nombreuses colonies avec une variété de tailles de colonie (Figure 3). Colonie différentes tailles indiquent des clones d’aptitude variable et sont un bon signe que le protocole a travaillé. Les contrôles du donneur et du receveur ne devraient avoir aucune croissance sur les plaques. En utilisant le protocole ci-dessus devrait donner bien plus de 2 x 105 unités formant colonies (UFC). Intensification du protocole à cinq conjugaisons répétées à la fois devrait produire environ 1 x 106 UFC. Dans un travail antérieur, analyse à l’aide de prochaine génération séquençage a indiqué qu’une telle bibliothèque plus grande échelle devrait produire une > 2 x 105 insertions unique6. À très haute UFC (c.-à-d.1 x 106 UFC) le taux d’insertions uniques devrait plateau, toutes les insertions (non mortelles) disponibles deviennent représentée.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la conjugaison bactérienne et insertion de transposon dans le chromosome. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Image de filtres immergés dans LB médias avant et après utilisation du vortex. Avant l’utilisation du vortex, les cellules sont coincés dans le filtre et les médias sont clair. Après agitation, les médias se trouble, comme les cellules sont venus hors du filtre et sont dans les médias. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : (A) plaque représentant de bibliothèque transposon après 18 h de croissance. (B) Close up de tailles de la colonie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici permet la construction d’une bibliothèque d’insertion dense. Cette méthode permet la création d’une bibliothèque de transposon avec plus de 2 x 105 mutants de transposon unique à l’aide de moins de 5 mL de culture volume6. Il est relativement facile à exécuter, utilise des réactifs disponibles dans les laboratoires de microbiologie plus élémentaires, est évolutif et nécessite peu de matériel coûteux ou consommables tels que les cuves d’électroporation.

Un avantage important de cette méthode est que, en théorie, l’utilisateur a toute latitude dans le choix des souches réceptrices entérobactéries. Ce papier, ainsi que d’autres11, utiliser des e. coli comme une souche réceptrice, toutefois le plasmide pJA1 a été utilisé avec succès avec d’autres espèces de destinataire entérobactéries comme Shigella flexneri6 et Salmonella enterica souche de sérotype Typhimurium SL134410. L’origine γ de réplication (oriR6Kγ) en pJA1 permet en théorie, ce plasmide à être maintenu dans un large spectre d’hôtes rang19, ce qui permet que la souche réceptrice est pir +. Récemment, nouvelles méthodes ont été décrites qui permettent pour la construction de la pir + dans une variété de souches entérobactéries20, donnant plus de souplesse. En outre, la région de300 paires de bases mob du plasmide RP4 dans pJA1 permet le transfert conjugatif de ce plasmide à un large éventail de gram négatif de souches bactériennes19. Autrement dit, cette méthode pourrait théoriquement être utilisée avec une variété de souches réceptrices, aussi longtemps que plusieurs conditions soient remplies : la souche est pir+ et est munie d’une résistance aux antibiotique autres que kanamycine et autres que la souche du donneur.

Une étape cruciale dans le protocole se trouve à estimer le nombre adéquat de cellules à plaque dehors au point 4.1. Si les colonies sont espacés de trop près, ils se disputent les nutriments sur la plaque et moins fit des mutants sont surpassés. Cela peut conduire à une réduction du nombre total de mutants. Sinon, si les colonies sont espacées trop éloignés, il y aura trop peu de colonies sur la plaque, et le nombre total de boîtes de gélose nécessaires pour atteindre une grande bibliothèque devient lourd. Par conséquent, il est important d’atteindre le juste équilibre en termes de nombre de colonies par boîte.

Il est important d’effectuer les contrôles énumérés dans le protocole pour s’assurer que les étapes fonctionnent comme décrit. Notamment, lorsque vous utilisez l’acide nalidixique comme une sélection de lutte contre la souche du donneur, il est important de s’assurer que les plaques de contrôle négatif donneur sont libres des colonies. C’est parce qu’il peut y avoir un taux faible (environ 1 x 10-10)21 de résistance spontanée à l’acide nalidixique, ce qui donne de faux positifs. En général, le taux de conjugaison et de transposition est environ 2 x 10-4 19. Par conséquent, le taux de conjugaison et de transposition est plusieurs ordres de grandeur plus grand que le taux de résistance spontanée à l’acide nalidixique. Par conséquent, le taux de faux positifs par rapport aux événements de transposition vrai est très faible et jugé négligeable lorsque le protocole est en marche. Toutefois, si le taux de conjugaison ou de transposition sont considérablement réduits, (à partir de faible efficacité accouplement et/ou au manque d’induction de la gène de la transposase avec IPTG) et le protocole est entartré pour compenser cela, alors que le nombre de faux positifs (clones qui n’ont pas le transposon inséré) peut également augmenter.

Certaines modifications peuvent être effectuées à l’époque d’incubation en étapes 3.2 et 3.10. Étape de 3,2 États conjugaison devrait survenir pendant 6 h, mais d’après notre expérience, cette étape de temps peut être varié (c.-à-d., 4-7 h) sans changer les résultats significativement. En outre, à l’étape 3.10, la longueur du temps, que les colonies sont incubés sur les géloses peut également être ajustée. Cela peut varier selon la moyenne doubler le taux de temps ou de la croissance de la souche réceptrice. En outre, dans notre expérience, 18 h a produit une variété de tailles de colonie, indiquant une bibliothèque d’aptitude diverse. Cependant, colonies avec remise en forme très réduite peuvent prendre plus de temps pour se développer et donc peut-être pas visibles après 18 h. Si cette méthode est utilisée pour trouver des clones d’aptitude extrêmement réduite, des temps d’incubation plus longues et moins de colonies sur la plaque afin de réduire le surpeuplement (p. ex., 48 h, 50-300 colonies) peuvent être utilisés.

Des pièges supplémentaires de cette méthode sont qu’il n’est pas possible d’utiliser une souche réceptrice qui est déjà résistant à la kanamycine. Il peut être possible de permuter le marqueur de résistance kanamycine dans le plasmide pJA1 pour un autre marqueur de sélection, telles que la résistance de chloramphénicol à surmonter cet obstacle. Il peut également être intéressant de noter que, en théorie, il est possible d’utiliser une souche réceptrice ampicilline résistante, comme le pJA1 plasmide contenant le marqueur de résistance ampicilline est perdue peu de temps après la transposition.

La création d’une bibliothèque de transposon dense dans le bagage génétique de choix est potentiellement avantageuse pour de nombreuses applications en aval. Par exemple, une bibliothèque de transposon dense pourrait être utilisée pour identifier les mutants auxotrophes utilisant réplique placage22 ou pour identifier des mutants qui sont défectueux à établir une infection1,2. Plus récemment, comme les coûts de séquençage de l’ADN ont diminué et les nouvelles technologies comme le séquençage de la génération suivant sont devenus monnaie courante, bibliothèques de transposon ont été utilisés avec profond séquençage de l’ADN pour avoir un aperçu essentiel de gène, la fonction du gène et génétiques interactions. Certaines de ces méthodes sont passées en revue dans 23 et comprennent des méthodes telles que le séquençage de site dirigée transposon insertion (TraDIS), séquençage des transposons (Tn-seq), haut-débit insertion suivi par séquençage en profondeur (HITS) et insertion séquençage ( INSeq). Toutes ces méthodes en aval reposent sur la construction des bibliothèques d’insertion transposon dense. Alors que les autres vecteurs peuvent doivent être utilisées pour des méthodes particulières en aval, le protocole décrit ici donne un aperçu des points saillants procédures à suivre.

Disclosures

L’auteur n’a rien à divulguer.

Acknowledgments

Je remercie le laboratoire d’église de George pour le gentil cadeau du plasmide pJA1. Je remercie Fabienne Hamburger et Alex Boehm du labo Jenal Urs au Biozentrum à Bâle pour aide à la conjugaison bactérienne et pour fournir la souche BW20767. Je remercie également Olin Silander pour modifications utiles. Cette recherche a été financé par des fonds de l’Université Massey en Nouvelle-Zélande et de l’Initiative Suisse en biologie des systèmes (projet « Bataille X » décerné à Dirk Bumann) à l’Université de Bâle, Suisse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
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  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

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