Author Produced

Skapandet av en tät Transposon införande bibliotek med bakteriell konjugation i Enterobacterial stammar som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Immunology and Infection
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Presenteras här är en enkel metod för att skapa en hög densitet transposon införande bibliotek i Escherichia coli eller Shigella flexneri med bakteriell konjugation. Detta protokoll möjliggör skapandet av en samling av hundratusentals unika mutanter i bakterier av slumpmässiga genomisk införandet av en transposon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transposon mutagenes är en metod som gör genen störningar via slumpmässiga genomisk införandet av en bit av DNA kallas en transposon. Protokollet nedan beskriver en metod för högeffektiv överföring mellan bakteriestammar av en plasmid härbärgerat en transposon innehållande en kanamycin motstånd markör. Den plasmid-burna transposase kodas av en variant tnp -gen som infogar transposon i genomet hos den mottagande stammen med mycket låga insertional bias. Denna metod möjliggör således skapandet av stora mutant bibliotek där transposoner har infogats i unik genomisk positioner i en mottagare stam av antingen Escherichia coli eller Shigella flexneri bakterier. Med hjälp av bakteriell konjugation, i motsats till andra metoder såsom elektroporation eller kemisk omvandling, kan stora bibliotek med hundratusentals unika kloner skapas. Detta ger hög densitet införande bibliotek, med infogningar som förekommer så ofta som varje 4-6 baspar i icke väsentliga gener. Denna metod är överlägsen andra metoder som gör det möjligt för en billig, lätt att använda och hög effektivitet metod för att skapa en tät transposon införande bibliotek. Transposon biblioteket kan användas i efterföljande led applikationer såsom transposon sekvensering (Tn-Seq), för att härleda genetisk interaktion nätverk, eller enklare, i mutationsanalys (framåt genetiska) skärmar.

Introduction

Skapandet av transposon mutagenes bibliotek i bakterier är användbar för en mängd olika tillämpningar, alltifrån upptäckter av virulensgener i bakteriella patogener1,2, till studier av viktiga gener3, 4 , 5 , 6, för identifiering av genetisk interaktion nätverk7,8,9. Avgörande för dessa studier är förmågan att skapa ett stort bibliotek av mutanter. Användning av transposoner (korta fragment av DNA som infogar slumpmässigt i en arvsmassa) är ett enkelt sätt att störa geners funktion, som införandet av en transposon inom öppen läsning ram eller reglerande regionen av en gen kommer ofta störa funktionen eller uttryck av genen.

Beskrivs här är en metod för att skapa en transposon-bibliotek i E. coli eller S. flexneri genom bakteriell konjugation med plasmiden pJA110. Det finns två huvudsakliga fördelar med att använda denna plasmid. Den första fördelen är att varianten av den Tn10 transposase uttryckt från pJA1 plasmiden är inducerbara och har låg insättning bias11,12, vilket innebär att transposon kommer slumpmässigt att integrera i genomet när Isopropyl Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) läggs till media. Transposon innehåller en kanamycin motstånd markör, vilket möjliggör val av mutanter med transposon skären i kromosomen mottagarens stam. Den andra fördelen av pJA1 plasmiden är att det innehåller en R6K mutant ursprung replikering. R6K mutant ursprung replikering kräver lambda pir genen för underhåll av Plasmiden13. Som plasmiden inte kan replikera i pir - stammar, det kommer att gå förlorade i mottagarens stam (figur 1). Detta säkerställer att Tn10 transposase tas bort från cellen och är inte längre aktiv, minska ytterligare mutationer efter händelsen inledande införlivande.

Användning av bakteriell konjugation att flytta pJA1 plasmiden från givare stammen till mottagarens stam är fördelaktig av flera skäl. Konjugering är enkel och billig att utföra och behöver inte särskild utrustning såsom en electroporator. Dessutom kan den höga verkningsgraden av bakteriell konjugation möjliggör ett mycket stort bibliotek (> 2 x 105 unika infogningar) uppnås med bara några milliliter (mL) över natten bakterieodling6. Processen tar cirka två timmar hands-on tid tillsammans med tid för inkubation och tillväxten av bakterier. Langridge o.a. 14 rapporterade utför 130 electroporations att skapa en transposon mutagenes bibliotek av storlek liknar som beskrivs här8, som uppnås med en enda konjugering. Användning av 130 electroporations kräver labor intensiv och tidsödande förberedelser av electrocompetent celler och användningen av många dyra material (t.ex., elektroporation kyvetter), till en kostnad av mer än $1,000 USD i förbrukningsvaror ensam. Andra studier10 har använt liknande metoder, men med olika bakteriestammar och uppnådda långt mindre bibliotek storlekar (5 x 104 kolonin bildar enheter) än redovisas här.

Notes på donatorn stammen: givare stammen används här är E. coli stam BW2076715 som innehåller de pJA1 transposon plasmid16. Stam BW20767 kan konjugat till andra stammar, vilket gör överföringen av pJA1 plasmiden högeffektiva. Dessutom viktigt, BW20767 är lambda pir +. Som tidigare nämnts är de plasmiden pJA1 bara kunna upprätthållas i stammar innehållande lambda pir -genen. Denna stam är kanamycin och ampicillin resistenta. PJA1 plasmiden innehåller ampicillin motstånd markören och kanamycin motstånd markör finns inom transposon. Denna stam odlas med urval på plasmiden med ampicillin på 100 µg/mL. Det är också värt att notera att andra stammar som härbärgerat konstitutivt uttryckta transposase gener är kända för att vara instabila, och medan den transposase som används här är inducerbara kontroll, finns det fortfarande en låg risk för läckande uttryck. Därför föreslås det att passagen av denna stam ska minimeras och en färsk strimma bör tas från en fryst kultur för varje nytt bibliotek-preparat. Givare stammen används här är tillgängliga från våra lab på begäran.

Anteckningar om mottagaren stammen: mottagarens stammen kan vara en stam av val, såsom K12-derived lab stammar av E. coli eller stammar av S.flexneri (se även, diskussion). Mottagarens stammen måste ha en ytterligare antibiotikaresistens markör som inte är kanamycin motstånd, så att givaren stammen kan väljas mot. För mottagarens stam används en E. coli MG1655 stam här med en introducerade spontana nalidixic syra-mutation. Den spontana nalidixic syra muterat valdes av bordläggningen ut 2 mL övernattning kultur i 200 µL portioner på plåtar som innehåller nalidixic syra på 30 mikrog/mL. En enda klon av MG1655 valdes som var resistent mot nalidixic syra att bli mottagarens stammen. Mottagarens stammen måste dessutom vara lambda pir negativa, som beskrivs ovan.

Översikt: När bakteriell konjugation har ägt rum och pJA1 plasmiden har flyttat från givare stammen in mottagarens stammen, tillägg av IPTG till media kommer att framkalla uttrycket av genen tnp , som är under kontroll av den IPTG-inducerbara lacIq/Ptac arrangören (figur 1). Tnp genen på pJA1 är en mutant transposase som har en lägre frekvens av införande oroshärdar6,10,11. Vid addition och induktion med IPTG, transposon aktiveras och slumpmässigt infogas i genomet. Plasmiden kan inte upprätthållas i lambda pir-mottagaren stam och förloras.

Protocol

försiktighet: om du använder S. flexneri som ett mottagande stam, Observera att S. flexneri mänskliga patogener som kan orsaka gastrointestinal sjukdom. Experiment med S. flexneri måste utföras med lämpliga biosäkerhet försiktighetsåtgärder (utsedda BSL-2 i Europa och USA eller PC2 i Nya Zeeland). Alla experiment som utförs i videon är associerad med detta protokoll var gjort med välkarakteriserad mottagarens stam av icke-patogena E. coli MG1655 i en PC1 inställning. Arbete med Shigella flexneri utfördes tidigare i en BSL-2 lab vid Basels i Basel, som beskrivs i 6.

Obs: följande experimentet görs effektivt två gånger. Den första delen (steg 1.1 - steg 4,5) utförs för att hitta den bästa utspädningen för plätering ut biblioteket, där målet är att hitta en utspädning av konjugationen vilket ger många enskilda kolonier per platta, men inte så många som bildar en gräsmatta. Detta är att minska konkurrensen mellan mutanter med betydligt reducerad fitness och de med mer robust fitness. Den andra delen (steg 5.1-7,4) är skapandet av den slutliga bibliotek, där många tallrikar sprids av den tillämpliga utspädningen av biblioteket.

1. att förbereda en dag innan experimentet

  1. Inoculate, från en fryst lager, givare stammen i 2 mL LB buljong, Millers recept (NaCl på 10 g/L) media som innehåller ampicillin på 100 µg/mL. Givare stammen används här är E. coli stam BW20767 15 härbärgerat pJA1 plasmid 11. Användning av ampicillin upprätthåller urval för pJA1 Plasmiden.
  2. Inoculate, från en enda koloni eller fryst lager, mottagarens stammen i 2 mL LB medier med en motstånd markör än ampicillin eller kanamycin. Mottagarens stammen används här är den E. coli " vildtyp " stam MG1655 17 , 18 med en spontan resistens mutant nalidixic syra. Den odlas i 30 µg/mL nalidixic syra.
  3. Förbereda 20 Luria buljong innehållande 1,5% agarplattor (i 90 mM petriskålar, cirka 12,5 mL). Agarplattor saknar antibiotikum kan lagras vid 4 ° C i flera månader fram till användning.
  4. Förbereda 20 Luria buljong innehållande 1,5% agarplattor (i 90 mM petriskålar, cirka 12,5 mL) som innehåller både kanamycin på 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50) och nalidixic av 30 µg/ml. Agarplattor som innehåller antibiotika kan förvaras i mörker vid 4 ° C i flera månader fram till användning.
  5. Bereda 200 mL steril LB media. LB media kan förvaras vid rumstemperatur i flera månader.
  6. Bereda 1 mL 100 mM steril lager av IPTG, enligt tillverkaren ' anvisningar.

2. Bakteriella para ihop eller konjugering

  1. centrifug 1 mL övernattning kultur givare stam i 1 minut vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Kassera tillväxt medier. Detta steg görs för att ta bort alla tillväxt medier som innehåller antibiotika.
  2. Omsuspendera cellpelleten i 110 µL av LB (inte innehåller antibiotika), således koncentrera kulturen.
  3. Med steril pincett, placera ett sterilt nitrocellulosa filter (alternativt en steril bit blotting papper kan användas, se material lista) på mitten av en LBA platta (inte innehåller antibiotika). Etikett på plattan " negativkontroll: givare ".
  4. Med pipett, släppa 50 µL av den koncentrera givare kulturen på filtret.
  5. Upprepa steg 2.1-4 för mottagarens stam, märkning plattan " negativkontroll: mottagaren. "
  6. För biblioteket, släppa 50 µL av den givaren (från steg 2.2) och 50 µL av mottagarens belastningen (från steg 2.5) på ett enda sterilt filter på en LBA plattan (dessa plåtar inte bör innehålla antibiotika). Etikett denna platta " biblioteket. " para ihop beror på att givaren och mottagaren är nära fysisk kontakt på filtret.
  7. Placera de agarplattor som innehåller filter vid 37 ° C i 6 h.

3. Aktivering av pJA1 Transposon genom IPTG induktion av Transposase

  1. förbereda tre 15 mL koniska injektionsflaskor innehållande 2 mL LB med IPTG med en slutlig koncentration på 1 mM (dvs, 20 µL av 100 mM lager av IPTG). Märk varje: givare kontroll, mottagaren kontroll och bibliotek.
  2. Ta bort plattorna från inkubatorn efter 6 h tillväxt vid 37 ° C (från steg 2,4). Vissa bakterietillväxt ska vara synliga på filtret.
  3. Med steril pincett, ta bort pappersfiltret från kontrollen givare och placera den i 15 mL koniska injektionsflaskan märkt givare kontroll (från steg 3.1). Gör samma sak för mottagaren kontroll och bibliotek.
  4. Tryck på rören för att få pappersfiltret till botten av injektionsflaskan 15 mL koniska och säkerställa att det är helt nedsänkt i LB.
  5. Cyklontuber för minst en hel minut på hög att avassociera bakterierna från filtret nitrocellulosa. LB bör bli Molnigt med bakterieceller ( figur 2).
  6. Med steril glaspärlor eller en steril spridare, tallrik 200 µL av vortexed bakteriesuspensionen från givare kontroll på LBA Nal30 Kan50 plattor märkta " givare kontroll, 200 µL ".
  7. Upprepa steget ovan (3.6) för mottagarens kontroll, märkning plattorna " mottagaren kontroll, 200 µL ".
  8. Upprepa steg ovanför (3,7) för biblioteket, märkning plattorna " bibliotek, 200 µL ".
  9. Göra ytterligare utspädningar (dvs., 1:5, 1:10 och 1: 100 utspädningar, med LB som inte innehåller antibiotika som ett spädningsmedel) av biblioteket. Plattan 200 µl av outspädd bibliotek och ytterligare utspädningar på lämpligt märkt LBA Nal30 Kan50 tallrikar.
  10. Plats plattor till 37 ° C inkubator för 18 h. kloner med transposoner införas i en gen som orsakar en stor förlust av fitness kan ta längre tid att växa och visas på plattan. Det bör finnas en mängd kolonin storlekar ( figur 3). Givaren och mottagaren silplåtar bör ha inga kolonier på dem.

4. Välj den tillämpliga utspädningen av biblioteket som ska användas för den slutliga Mutant bibliotek

  1. bestämma en utspädning av biblioteket från steg 3,9 som ger många kolonier av varierande storlek som är tillräckligt fördelade. Syftet är att få så många kolonier som möjligt på en tallrik, men inte så många att kolonierna slå samman i varandra och konkurrerar om resurser. Talet ska vara cirka 500-2,000 kolonier per platta. Ett exempel på lämpliga koloni tätheter på en tallrik är visas i figur 3.
  2. Registrera antalet kolonier på plattorna.
  3. Beräkna frekvensen av konjugation (antalet conjugants per mottagande cell). Detta bör vara i intervallet 1 x 10 -4 till 1 x 10 -6 19.
  4. Bestämma antalet mutanter som önskas i den slutliga bibliotek baserat på nedströms tillämpningar. Många användare helt enkelt kräva ett bibliotek med så många mutanter som möjligt. Att generera så många transposon infogningar som teoretiskt möjligt (en insättning varje baspar), sikta på ungefärligaly samma antal kolonier som baspar i genomet (dvs., ~4.5 x 10 6 för E. coli) att helt mätta genomet med alla möjliga transposon infogningar. Det är viktigt att Observera att många mutanter härbärgerat infogningar i eteriska eller funktionellt viktiga gener kommer inte att kunna återvinnas, eftersom dessa mutationer blir ödesdigert för mottagaren.
  5. Beräkna hur mycket volym av det ursprungliga biblioteket behövs för att skapa ett bibliotek av önskad storlek. Till exempel är önskat bibliotek storlek 5 x 10 4 mutanter. Utspädning med bästa avståndet av kolonier från steg 3,9 var 200 µL av en 1:10 utspädning. Antalet kolonier på denna platta uppskattas vara cirka 2 000 kolonier. Om 5 x 10 4 mutanter behövs och varje platta har 2.000 kolonier, då 25 plattor kommer att behövas vid denna spädning.

5. Skapandet av den slutliga Mutant bibliotek

  1. Upprepa steg 1 till 3.8, justera antalet plattor i steg 1.4 som behövs (se steg 4,4).
  2. Vid steg 3,9, pläterar den utspädning som valdes i steg 4.1 på så många plattor som behövs för att skapa biblioteket i önskad storlek (se punkt 4.4).

6. Uppskatta bibliotek densitet

  1. räkna hur många kolonier där är per platta, och därmed få en grov uppskattning av hur tät biblioteket är. Till exempel: totalt 2 x 10 5 kolonier är klädd. E. coli MG1655 genomet är ca 4,5 x 10 6 baspar. Därför ett bibliotek med 2 x 10 5 infogar innebär att det finns en insats i genomsnitt varje 22 baspar och att varje gen bör vara muterade om 45 gånger, med tanke på att en gen är ca 1 x 10 3 baspar. Infogningar i viktiga gener sannolikt är mycket underrepresenterade i det här biblioteket och densiteten i icke väsentliga gener är därför sannolikt att vara större än detta. Denna typ av beräkning ger en med en bred uppskattning av transposon densitet.

7. Sammanföra Transposon bibliotek och lagring

  1. efter räkning av kolonier, tillsätt 1 mL LB (eller mer, vid behov) på biblioteket plattan och Använd en steril limspridare för att skrapa bort bakterier från plattan. Ta bort bakteriesuspensionen och placera i en 50 mL eller 15 mL koniska injektionsflaska. Upprepa för alla plattor.
  2. Vortex poolade bakteriesuspensionen för en hel minut att homogenisera suspensionen.
  3. Lägg steril glycerol till en slutlig koncentration av 20%.
    1. Förbereda 100 x 20 µL portioner i 0,25 mL rör lätt återväxt.
    2. Förbereda minst två eller fler 1 mL alikvotens i cryovials.
  4. Lagra alla alikvoter vid -80 ° C

Representative Results

Efter 18 timmars tillväxt, plattor bör innehålla många kolonier med en mängd kolonin storlekar (figur 3). Olika kolonin storlekar indikerar kloner av varierande kondition, och är ett bra tecken på att protokollet har arbetat. Givare och mottagare kontrollerna bör ha någon tillväxt på plattorna. Använda protokollet ovan bör ge drygt 2 x 105 kolonin bildar enheter (CFU). Skala upp protokollet till fem replikera konjugationer samtidigt bör ge ca 1 x 106 CFU. I tidigare arbete, analys med nästa generations sekvensering anges att sådana trappade upp bibliotek bör ge > 2 x 105 unika infogningar6. Vid mycket hög CFU (dvs, 1 x 106 CFU) förväntas andelen unika infogningar platå, som alla tillgängliga (icke-fatal) infogningar bli representerade.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av bakteriell konjugation och införandet av transposon i kromosomen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Bilden av filter dränka i LB media före och efter vortexa. Innan vortexa, celler har fastnat i filtret och media är klart. Efter vortexa blir media grumligt som celler har kommit bort filtret och i media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : (A) representativa platta av transposon bibliotek efter 18 h av tillväxt. (B) Närbild av kolonin storlekar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet beskrivs här möjliggör byggandet av en tät införande bibliotek. Denna metod möjliggör skapandet av en transposon-bibliotek med över 2 x 105 unika transposon mutanter med under 5 mL kultur volym6. Det är relativt lätt att utföra, använder reagenser tillgängliga i mest grundläggande mikrobiologi labs, är skalbar och kräver lite i vägen för dyr utrustning eller förbrukningsmaterial såsom elektroporation kyvetter.

En betydande fördelen med denna metod är att användaren i teorin, har brett latitud i valet av enterobacterial mottagarens stammar. Detta papper, liksom andra11, använda E. coli som en mottagare stam, men pJA1 plasmiden har använts framgångsrikt med andra enterobacterial mottagarens arter som Shigella flexneri6 och Salmonella enterica serovar Typhimurium stam SL134410. Teoretiskt, γ ursprung replikering (oriR6Kγ) i pJA1 tillåter denna plasmid bibehållas i en bred värd utbud19, så att att mottagaren stammen är pir +. Nyligen har har nya metoder beskrivits som möjliggör byggandet av den pir + i en rad enterobacterial stammar20, vilket ger ytterligare flexibilitet. Dessutom ger regionen300 baspar mob från RP4 plasmiden i pJA1 konjugering överföring av denna plasmid till ett brett utbud av gram negativ bakteriestammar19. Enkelt uttryckt, denna metod skulle teoretiskt kunna användas med en mängd mottagare stammar, så länge som flera villkor är uppfyllda: stammen är pir+, och är märkt med en antibiotikaresistens än kanamycin och givare stammen.

Ett kritiskt steg i protokollet ligger i att uppskatta rätt antal celler att platta ut i steg 4.1. Om kolonier är fördelade för nära, de konkurrera om näringsämnen på plattan och mindre fit mutanter är outcompeted. Detta kan leda till en minskning av det totala antalet mutanter. Alternativt om kolonier är fördelade alltför långt isär, det blir för få kolonier på plattan, och det totala antalet agarplattor som behövs för att uppnå ett stort bibliotek blir betungande. Det är därför viktigt att uppnå rätt balans när det gäller kolonin nummer per platta.

Det är viktigt att utföra de kontroller som anges i protokollet att säkerställa stegen arbetar som beskrivs. Särskilt, när du använder nalidixic syra som en Counter markering mot givaren stam, är det viktigt att se till de negativa givare kontrollplattor är kolonier. Detta beror på att det kan finnas en låg (ca 1 x 10-10)21 av spontan resistens mot nalidixic syra, vilket ger falska positiva. Graden av konjugation och införlivande är vanligtvis ca 2 x 10-4 19. Graden av konjugation och införlivande är därför flera storleksordningar större än andelen spontana motstånd till nalidixic syra. Därför andelen falskt positiva jämfört med sann införlivande händelser är mycket låg och anses försumbar när protokollet fungerar. Men om andelen konjugation eller införlivande minskas avsevärt, (från låga parning effektivitet och/eller brist på induktion av genen transposase med IPTG) och protokollet är skalas upp att kompensera för detta, då antalet falsklarm (kloner som har inte den transposon infogas) kan också öka.

Vissa ändringar kan göras till inkubationstider i steg 3,2 och 3.10. Steg 3,2 stater som konjugation skulle inträffa för 6 h, men vår erfarenhet, denna tidssteg kan vara omväxlande (dvs, 4-7 h) utan att ändra resultaten avsevärt. I steg 3.10, kan dessutom tidsperiod som kolonierna inkuberas på agarplattor också justeras. Detta kan varieras beroende på den genomsnittliga fördubbling tid eller tillväxt klassar av mottagarens stammen. Dessutom i vår erfarenhet gav 18 h en mängd kolonin storlekar, som anger ett bibliotek med olika fitness. Men kolonier med kraftigt nedsatt kondition kan ta längre tid att växa och därmed kanske inte syns efter 18 h. Om denna metod används för att hitta kloner av extremt nedsatt kondition, får längre inkubationstider och färre kolonier på plattan att minska trängsel (dvs, 48 h, 50-300 kolonier) användas.

Ytterligare fallgropar av denna metod är att det inte är möjligt att använda en mottagare stam som redan kanamycin resistenta. Det kan vara möjligt att byta ut kanamycin motstånd markören i pJA1 plasmiden för en alternativ valbara markör, såsom kloramfenikol motstånd att övervinna detta hinder. Det kan också vara värt att notera att i teorin, är det möjligt att använda en mottagare stam som är resistent ampicillin, som pJA1 plasmid som innehåller ampicillin motstånd markören förlorade kort efter införlivandet.

Skapandet av en tät transposon bibliotek i den genetiska bakgrunden av val är potentiellt fördelaktiga för många nedströms tillämpningar. En tät transposon biblioteket kunde till exempel användas att identifiera auxotrophic mutanter med replica plating22 eller att identifiera mutanter som är defekta i upprättandet av en infektion1,2. Mer nyligen, som DNA sekvensering kostnaderna har sjunkit och ny teknik såsom nästa generations sekvensering har blivit vardagsmat, transposon bibliotek har använts med djupa DNA-sekvensering för att få insikt i gen essentialitet, geners funktion, och genetiska interaktioner. Några av dessa metoder granskas i 23 och inkluderar metoder såsom transposon-regisserad införande webbplats sekvensering (TraDIS), transposon sekvensering (Tn-seq), hög genomströmning införande tracking genom djupsekvensering (HITS), och insättningspunkten sekvensering ( INSeq). Alla dessa nedströms metoder är beroende av byggandet av tät transposon införande bibliotek. Medan andra vektorer kan behöva användas för särskilda nedströms metoder, ger protokollet beskrivs här en översikt över de processuella punkterna att följa.

Disclosures

Författaren har något att avslöja.

Acknowledgments

Jag tackar George kyrkan labbet för slag gåvan av pJA1 Plasmiden. Jag tackar Fabienne hamburgare och Alex Boehm från Urs Jenal labbet på Basels i Basel för hjälp med bakteriell konjugation och ge den BW20767 stammen. Jag tackar också Olin Silander för bra redigeringar. Finansiering för denna forskning lämnades av medel från Massey University i Nya Zeeland och det schweiziska initiativet i systembiologi (projektet ”Battle X” tilldelas Dirk Bumann) vid universitetet i Basel, Schweiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34, (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269, (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103, (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186, (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95, (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16, (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6, (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106, (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73, (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11, (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258, (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19, (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35, (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19, (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277, (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160, (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5, (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461, (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100, (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11, (7), 435-442 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

Comments

5 Comments

  1. Great video! Very helpful. Thanks so much for it.

    Reply
    Posted by: Nathaniel J.
    February 1, 2018 - 1:12 PM
  2. Thank you so much for sharing your protocol. I am wondering how I can get the E. coli BW2767 including pJA1. Could you let me know from where you got them?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Mona A.
    March 14, 2019 - 3:48 PM
  3. Hi Mona,
    You are welcome to email me at n.freed@massey.ac.nz to request the strain (this is stated in the paper as well).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 18, 2019 - 6:13 PM
  4. Hello, I have a question, when you transform the donor strain with the transposon library, how can you know if there is a sufficient abundance of donor cells to perform the mating with the acceptor strain (organism of interest). Or there is no efficient way to determine this amount until after the conjugation event

    Reply
    Posted by: Miguel Angel m.
    March 12, 2020 - 3:03 PM
  5. Hi Miguel, thank you for your interest. I'm not sure I fully understand the question or I think you do not fully understand the method. The donor strain is provided by my lab. It contains the plasmid pJA1 with the transposon. The mating takes place using overnight cultures of both the donor (harboring the pJA1 plasmid/transposon) and the acceptor strain. Typically both strains are at a high density after overnight growth. If you are concerned, you can plate out a dilution of the overnight cultures to count how many cells per mL there are and to ensure you have enough donor. If you have further questions, simply email me at n.freed@massey.ac.nz.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 16, 2020 - 9:08 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics