근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

Biochemistry

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Summary

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

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Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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Abstract

어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.

Introduction

DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성1,2,3,,45;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA6,,78의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다.

M-DNA 합성 돌연변이 DNA polymerases의 능력을 평가 하기 위해 우리9,10, 등11,,1213 일반적으로 사용 하는 DNA의 생체 외에서 측정 중 합 효소 활동이이 원고에 설명 되어 있습니다. 이 실험에서 DNA polymerases는 공동 incubated 레이블이 뇌관/템플릿을 이중와 nucleoside 3 인산 염 기판; 제품 젤 전기 이동 법에 의해 평가 됩니다. 특정 실험적인 질문, 돌연변이 DNA polymerases, 수정된 뇌관, 수정 된 서식 파일 또는 수정 된 nucleoside 된 사용할 수 있습니다, 활성화 돌연변이 효소 활동의 체계적인 생 화 확 적인 평가.

역사적으로, 이러한 분석 추적 DNA 합성; 5' 방사성 라벨에 의존 가장 일반적으로, P 32 33P 사용 되었습니다; 일반적으로, 라벨 이루어집니다 T4 polynucleotide 키 니 아 제11를 사용 하 여. 그러나, 유한 수명 및 방사성 레이블 및 그들의 안전한 처리의 상대적으로 높은 비용, 우리의 그룹은 합성 5' 근처-적외선 fluorophore DNA를 표시 대신 사용 합니다. 상대적으로 저렴 한 비용 근처-적외선 젤 영상을 사용 하 여, 우리는 비슷한 검출 한계가 방사성 레이블 (게시 되지 않은 결과)를 사용 하 여 이전 연구 관찰. 우리는 성공적으로 관측9, 과거 복제 하 고 우리가 하지 이전 측정된 속도 상수 (게시 되지 않은 결과)와 어떤 큰 양적 차이 관찰 했다.

DNA의 크기 및 따라서, DNA 종합의 정도 분석 하려면 우리는 생어 시퀀싱14 모 세관 전기 이동 법15의 도래 하기 전에 원래 개발 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 방법에 의존. 분리 또는 거리; 분자량의 측정으로 사용할 수 있습니다. 대형, 수직 polyacrylamide 젤 단일 뉴클레오티드 해상도, 다양 한 길이의 DNA oligonucleotides의 양적 관찰 가능 얻을 수 있습니다.

샨 다, 이러한 실험은 중 합 효소 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 시간으로 인해 민감한 반응, 준비 및 관리의 재현성 결과 얻을 필요가 있다. 또한, 아크릴 아 미드 젤은 DNA 합성, 수많은 다른 DNA 수정 반응, 단일 뉴클레오티드 해상도 측정 하는 매우 효과적인 방법 그것은 기술적으로 도전 수 것 이다. 잘하면 여기 프로토콜 가장 일반적인 실수를 피하고 있는 동안이 실험을 수행 하려면 사용자가 하면 수 있습니다.

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Protocol

1. 활동 분석 결과

참고: 특성 DNA polymerases 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 자주 실행 되는 분석 실험의 두 가지 일반적인 유형이 있다. 그들은 여부 그들은 질적으로 전반적인 합성 (DNA 종합의 많은 단계를 포함 하는) 특징 또는 여부 그들은 양적 초점을 개별 단계에서 다르다. 아래 필요한 단계 각각에 대 한 설명.
참고: 재료의 조립 시간 민감한 실험에 대 한 상대적으로 복잡 한 있기 때문에 좋습니다 모든 자료 사전 조립. 분석 결과의 모든 중요 한 구성 요소의 조리법은 다음과 같습니다. 상업용 공급 업체 구성 요소에 대 한 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

  1. SF 버퍼 조리법 x 10 (10 x SFB)
    참고: 우리의 분석에서 우리가 일반적으로 사용 하 여 N 맨끝 잘림 DNA 중 합 효소의 Thermus aquaticus, Stoffel로 일반적으로 알려진의 조각 (SF) 16 , 17. 여기 레시피는 SF 3 , 13에 대 한 기본 버퍼. 다른 버퍼는 특정 DNA 중 합 효소에 따라 대체 될 수 있습니다.
    참고: SF 버퍼 구성 요소 x 10의 최종 농도 500 mM Tris pH 8.5, 65 m m MgCl 2, 0.5 mg/mL BSA, 500mm KCl (s), 그리고 초순. 측정은 규모에 따라 100-200 분석 실험에 대 한 충분 한 SF 버퍼의 1 ml. 버퍼는-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다
    1. 결합 0.5 mL 1 M의 트라이앵글, 1 M MgCl 2의 65 µ L, 10 mg/mL BSA의 50 µ L 그리고 1.5 ml에서 KCl (s)의 0.0373 g 튜브. 추가 1 mL의 최종 볼륨을 도달 초순의 385 µ L.
  2. 1 x 저장소 버퍼 조리법 (1 x SB)
    참고: 버퍼 구성 요소 x 1의 최종 농도 50 m m Tris pH 7.5, 1mm DTT, 0.6 m m EDTA, 그리고 50% 글리세롤. 제조 법은 1 x SB 20 mL.
    1. 0.012 g DTT, 0.5 M EDTA의 100 µ L를 결합 하 고 100 m m 2xSB를 만들기 위해 트리 스 (pH 7.5) 40 mL 50 mL 원뿔 튜브를 채울. Vortexing에 의해 혼합.
    2. 새 50 mL 원뿔 튜브와 원뿔 새로운 10 mL 글리세롤을 추가 하 여 글리세롤과 희석 2 x SB의 10 mL 전송.
  3. Quenching 버퍼 오렌지 (QBO) 제조 법
    참고: 방사성 레이블을 사용 하는 경우 사용자가 자주 채용 합니다 bromophenol 블루 / 자일 렌 cyanol 전기 이동 법 진행에 대 한 추적 염료로. 그러나, 이러한 염료 약하게이 DNA 신호 방해 근처-적외선 영역에서 형광 것입니다. 따라서, 우리 샘플을 포함 하는 모든 반응에 대 한 그들의 장소에서 오렌지 G 사용 합니다. 오렌지 G 젤 로드를 추적 하기 위한 적합 한 수를 발견합니다 하는 동안 우리는 덜 전기 이동 법 진행;을 추적 하는 염료로 일관 되 게 오렌지 G을 발견 따라서, 우리 bromophenol 젤 진행 상황을 추적 하기 위해 샘플을 포함 하지 않는 젤의 외부 차선에 블루를 포함 하는 빈 레인을 실행 합니다.
  4. 결합 950 µ L 25 95 %formamide
      µ L의 0.5 M EDTA, 그리고 25 µ L의 초순. 오렌지 G 염료 (~ 10 mg)의 1 국자를 추가 합니다. Vortexing에 의해 혼합.
      주의: Formamide은 독성; 개인 보호 장비 (PPE) 장갑, 안경 등 실험실 외 투를 착용 하 고 유해 폐기물로 처리.

2. 시험의 실행

  1. 전체 활동의 질적 특성
    참고:이 분석 결과 대 한 우리가 일반적으로 M-NTPs의 일정 한 농도 유지 하 고 시간 다. 목표는 어떤 개별 단계를 측정 하기 보다는 단백질의 전반적인 특성을 평가 하는. 한 반응을 준비 하려면 두 가지 별도 구성 요소, 이중 믹스 (2.1.1 단계에서 설명)와 dNTP 믹스 (2.1.2 단계에서 설명)는 동일한 볼륨 별도로 준비 고 49 µ L의 최종 볼륨을 주고 결합 됩니다. 다음 1 µ L 50 x 효소의 반응을 시작 하 게 합니다. 가변 시간 포인트를 취할 수 있습니다; 일반적으로, 우리는 0, 5, 15, 및 60 분 끄다.
    1. 준비의 DNA 이중 믹스
      참고: 이중 믹스 SF 버퍼와 oligonucleotide 뇌관, 템플릿 oligonucleotide 초순 x 10의 구성 되어 있습니다. 각 반응에 추가 총 볼륨은 25 µ L. 1 µ L이 효소의 실험의 개시를 선행 하는 즉시 마스터 믹스에 추가 됩니다.
      참고: 우리의 분석에 대 한 우리가 일반적으로 사용 하 여 45-메 르 템플릿과 18-메 르 또는 23 메 르 뇌관. 다른 길이의 숫자를 사용할 수 있습니다, 우리는 제품 (18 뉴클레오티드에서 45 뉴클레오티드에 배열 되는) 쉽게 설명된 젤 전기 이동 법 프로토콜을 사용 하 여 단일 염기 수준에서 해결 하기 때문에이 길이 사용 하는 경향이 있다. 단일 뉴클레오티드 해상도 제품을 해결 하기 위해 그것에 도전 수 있습니다 oligonucleotide 제품 길이 증가,.
      참고: 우리의 실험에서 우리는 5 사용 ' 뇌관 제품을 관찰 하는 뇌관 물가에 근 적외선 형광 염료 상표. 우리가 구매 사용자 지정 합성된 oligonucleotides 베어링이 수정; 그러나,이 라벨 라벨 후 합성 전략의 어떤 숫자를 사용 하 여 통합할 수 있습니다. 템플릿 oligonucleotide는 레이블이 고 그래서 안 젤 영상 장치를 사용 하 여 관찰 된다. 두 oligonucleotides에 대 한 저장 100 µ M에서 oligonucleotides 10 mm Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      참고: 우리는 단지 뇌관을 관찰 하 고, 때문에 템플릿의 두 배 초과 모든 뇌관 (관찰 되는 DNA 종) 서식 파일에 단련은 되도록 사용 됩니다. 이 반응에서 마지막 이중 농도 40 nM.
      참고: 근 적외선 형광 염료는 종종 다소 빛에 민감한; 가능 하면 우리 커버 뇌관 (뇌관을 포함 하는 어떤 해결책 든 지) 호. 실행 되는 동안 polyacrylamide 젤 포함 됩니다.
      참고: 아래 2의 합성의 대표적인 예는 ' F M-DNA.
      1. 뇌관 1과 템플릿 1 희석 (시퀀스에 대 한 재료의 표 참조) 1 µ m 각 초순에.
      2. 별도 튜브에서 각 분석 결과 반응 결합 SF 버퍼 x 10의 5 µ L, 1 µ M 뇌관 1, 튜브 열 cycler와 호환에 초순의 1 µ M 템플릿 1, 13 µ L의 4 µ L의 2 µ L.
      3. Anneal thermocycler 다음과 같은 프로그램을 사용 하 여에 듀플렉스: 2 분, 5 분, 5 분, 5 분 동안 40 ° C 50 ° C 70 ° C에 98 ° C 25 ° c.에서 개최 특정 프로그램 입문서/템플릿 이중의 어 닐 링 온도 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리 적어도 1 5 분 스텝 어 닐 링 온도에 온도에 다른 5 분 단계를 포함 하는 것을 선호 어 닐 링 온도 5-10.
    2. 2 x dNTP 혼합물의 준비
      참고: 실험에 따라 가변 dNTPs dNTPs의 농도 사용 하 여 가능 하다. 일반적으로, 50-200 µ M 사용 하 여 반응.
    3. 준비 포함 하는 각 2의 100 µ M 25 µ L 솔루션
        ' F-NTP. 100 m m M NTPs 저장.
    4. 단백질 희석 x 50의 준비
      참고: 장기 저장을 위한 효소 1xSB에-20 ° C에서 유지 되어야 한다. -20 ° C 냉동 고에서 제거 될 때 마스터 혼합에 추가 하기 전에 항상 효소 얼음에 보관 한다. 효소 희석 여야 한다 집중된 주식에서 신선한 매일. 집중된 효소 재고는-20 ° C 냉동 고로 사용 후 즉시 반환 되어야 합니다.
      참고: 우리는 주로 돌연변이 DNA polymerases 평가, 때문에 우리만 사용 하 여 표현 되 고 정화 된 효소 설립된 방법 9 , 10를 사용 하 여 우리의 실험실에. 상업적으로 구입한 polymerases에 대 한 사용자의 서로 다른 단백질 및 여기에 설명 된 버퍼와의 호환성에 대 한 최적의 버퍼 주의 해야 한다.
      참고: 효소 농도 각 실험에 대 한 달라 집니다. 여기, 우리는 2에 대 한 대표적인 예제 표시 ' F-DNA 합성.
    5. 10 nM 효소 솔루션, 효소 int 1 µ L를 희석
        o 1 x SB 50 x 최종 효소 농도 만들기 위해. 50 x 솔루션의 농도 500 이어야 한다 nM. 예를 들어 주식 효소 농도 50 μ M 인 경우에, 추가 1 µ L 재고 효소 99 µ L 1 하고있다 x
        참고: 효소는 보통 50% 글리세롤에 저장 하 고, 솔루션 이므로 상당히 점성. 매우 정확한 펫을 사용 하는 경우에 권장 하지 않습니다 미만 0.5 µ L를 pipetting 효소 희석 동안 정확도 정밀도의 중요성을 고려 하 고.
    6. 분석 결과의 개시
      1. 50 건조 목욕의 온도 설정 ° c.
      2. 단련된 이중의 추가 24 µ L 믹스 (2.1.1 단계 참조) 2 x dNTPs (단계 2.1.2 참조)의 25 µ L을.
      3. 제거 9.8에서 혼합물의 µ L 2.1.4.2 단계 및 20 추가 µ L의 QBO (제조 법에 대 한 섹션 1.3 참조). 이 약 수 역할는 " 아무 효소 " 제어 하 고 각 실행에 대 한 취득 해야 합니다.
      4. 추가 50 x 효소의 0.8 µ L (단계 2.1.3.1 참조) 이중/dNTP 혼합에. 철저 하 게 혼합 하는 큰 볼륨 micropipette와 아래로 플라스틱.
      5. 5, 15, 60 분 후 각 반응 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 20 µ L QBO (절 1.3에서에서 설명)을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에 추가 하 여 반응 끄다.
      6. 침묵, 일단 반응을 무기한에서 4 ° C 또는-20 호에서 저장 될 수 있다 ° c.
        참고: M-DNA 종합의 개별 단계의 양적 특성, 매우 유사한 분석 결과 양적 Michaelis-Menten 매개 변수를 실행할 수 있습니다. 이 분석 결과 같은 자료의 모든 사용합니다. Michaelis-Menten 매개 변수 dNTP;에 대 한 측정 될 수 있다 이 경우에, 가장 중요 한 차이점은, 보다는 오히려 2 x dNTP 솔루션 시리즈를 효소로 이중 혼합 추가 이중 믹스 dNTP 믹스에 추가. 마찬가지로, DNA 이중 대 한 Michaelis-Menten 매개 변수를 측정할 수 있습니다. 특정 조건은 만족 Michaelis-Menten 방정식을 사용 하는 데 필요한 가정에 충족 되어야 합니다. 이러한 조건, 그리고, 분석 결과의 기본적인 역학 이전 방법 제 11에 설명 잘.

3. 젤 전기 이동 법

참고: 모든 재료는 미리 조립 이므로 젤 붓는 시간에 민감한. 분석 결과의 모든 중요 한 구성 요소의 요리법 같습니다; 공급 업체는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.

  1. 아크릴 20% 아크릴 아 미드 젤에 대 한 준비.
    참고:이 제조 법은 1 L의 아크릴 혼합물; 이 솔루션의 약 120 mL 젤 당 사용 됩니다. 이 솔루션에서 최대 1 년 동안 호 일 실내 온도에 저장.
    주의: Polyacrylamide 신경 이다입니다. 장갑을 착용 하 고 실험실 코트 젤 쏟아져의 모든 단계 동안 중요 하다. Polyacrylamide 장갑에 되 면, 즉시 장갑 교체 합니다. 아크릴 생산 하지 경우 레이블이 polyacrylamide 폐기물 봉투에 오염 된 재료를 놓고.
    참고: 38.67% 아크릴 아 미드와 1.33% 두번째-아크릴 아 미드 단위체 cross-linker 29: 1의 비율에 대 한 포함 하는 Premixed 40% 아크릴이이 프로토콜에 사용 되었다.
  2. Premixed TBE 분말의 무게 17 g
      . 6 별도 부분 요소 (총 420 g)의 70 g의 무게.
      참고: 있는 요소 부분에 추가 되어야 합니다. 우리가 가장 6 부분으로 분할.
    1. 저 어 접시에 2 L 플라스틱 비 커를 설정합니다. 비 커에 하나의 큰 교 반 막대를 추가 합니다. 튀는 것을 방지 하기 위해 혼합 하는 때 호 비 커를 커버.
    2. 비 커에 40% 아크릴 아 미드 용액 500 mL를 추가합니다. 솔루션 감동입니다 있는지 확인 하십시오.
    3. 추가 이전 무게-아웃 TBE. 우 레 아의 한 약 수를 추가 합니다. 혼합 솔루션을 허용 합니다. 우 레 아 천천히 녹이 고 흐릿한과 초기 추가 시 흰색 나타날 수 있습니다. 천천히 다음 시간 동안 혼합물으로 우 레 아의 나머지 aliquots를 추가 합니다. 때까지 완전히 명확 하 고 무색 혼합 솔루션을 보자.
      참고: 일반적으로, 밤새 저 어이 수 있습니다. 솔루션은 여전히 녹지 않는다, 물의 작은 aliquots를 추가 하 고 해산 하기 위해 요소에 대 한 대기.
    4. 요소 추가 정확 하 게 1로 볼륨을 높이 1 나 추가 물 가까이 볼륨을 증가 것입니다 L.
    5. 1 L 착 색된 유리 병 또는 커버 알루미늄 호 일로 유리 병에 게.
  3. 아크릴 아 미드 젤의 탕.
    참고: 때 처리 유리 접시, 유리 접시 및 어떤 하드 표면 사이의 접촉을 피하기 위해 주의 해야 합니다. 이것은 특히 중요 한에 거친 처리; 유리에 작은 균열을 일으킬 수 있습니다. 이러한 균열까지 젤은 실행, 발생 하는 높은 온도에서 볼 수 있습니다. 우리이 원치 않는 접촉을 코르크 링을 사용 합니다.
    1. 클린
      1. 취득 두 33 cm x 42 cm 젤 판, 노치 하나 및 하나 unnotched 접시 접시. 별도 코르크 반지에 접시를 놓습니다.
      2. 린스 비누와 물으로 철저 하 게 접시. Soap 줄무늬 또는 젤 반점 뒤에 남아 있는지 확인 하십시오.
      3. 적어 접시 구슬의 측면 적은 물. 이 쪽은 측면에 직면 젤.
        참고: 접시의 다른 쪽에는 젤을 실행 하는 경우 그것은 수 젤 전송 도전 할.
    2. 접시 건조
      1. 종이 타 올을 사용 하 여 각 접시의 두 얼굴을 건조.
      2. 사용 섬세 한 작업 퍼 나머지 영역을 건조. 테이프 적용 될 접시의 가장자리에 특별 한 주의.
      3. ~ 70% 에탄올, 유리 접시를 헹 구 고 작업와이 퍼로 닦아.
      4. 방울을 물 이나 아무 종이 타월 섬유 다는 것을 확인 합니다. 젤을 따르는 때 이러한 거품을 발생할 수 있습니다.
    3. 스페이서를 추가
      1. 0.75 m m 스페이서를 취득. 디 물 아래 gloved 손가락을 실행 하 고 부드럽게 젖은 장갑 낀된 손가락으로 스페이서.
      2. 장소 스페이서는 노치의 긴 가장자리를 따라 플레이트. 플레이트의 나머지에 뿌리지는 어떤 물 든 지 정리. 스페이서는 유리 접시와 함께 정렬 됩니다 있는지 확인 하 고 가장자리 위에 걸려 하지.
    4. 젤 봉인
      1. 건조 장갑에 넣어. 섬세 한 작업와이 퍼와 함께 다시 유리의 가장자리를 드라이.
      2. 노치 접시 위에 상단과 서로 대 한 번호판을 눌러 아래로 천천히 낮은 unnotched 접시를 맞춥니다. 모든 접시의 가장자리 정렬 되 다는 것을 반드시 다시 확인.
      3. 사용 젤 테이프 상단 제외한 모든 가장자리에서 테이프를 놓습니다. 테이프를 균등 하 게 정렬 하 고 단단히 봉인 다는 것을 확인 하십시오. 테이프 한 모션에 적용 될 수 있습니다 또는 각 측면을 개별적으로 할 수 있습니다. 면도칼으로 테이프의 끝을 잘라.
      4. 젤 하단에 테이프의 추가 레이어를 추가합니다. 어깨는 테이프, 덜 가능성이 젤 누출 됩니다 때 쏟아져.
      5. 흰색 클램프와 유리 샌드위치의 측면을 클립. 하단에 각 측에 3 개의 클립 및 4 클립 추가.
    5. 젤 쏟아져
      1. 0.3 g 암모늄 persulfate를 해산 하 고 초순에 최대 3 mL를 희석 하 여 10% 염화 persulfate 솔루션 (APS)의 3 mL 확인.
        참고: AP의 1.2 mL 젤 당 필요 하다. 그것을 만드는 후 튜브를 날짜. APS 솔루션 2 주에 만료 되 고 4에서 지켜져야 한다 ° c.
      2. 전송 125 µ L의 별도 microcentrifuge 튜브를 tetramethylethylenediamine (TEMED).
        참고: TEMED는 독성; 보호구 착용, 장갑 등 안경 및 실험실 코트 처리 때마다.
      3. 물 총 병을 획득 하 고 뾰족한 깔때기를 제거 합니다. 125ml 졸업된 실린더에 물 밖으로 측정 하 고 병 추가. 영구 마커 수 위 병의 외부에 표시 합니다. 물을 삭제 합니다. 이 수정 된 물 총 병 적절 한 청소 (아래 참조)와 무한정 다시 사용할 수 있습니다.
      4. 설정 싱크대 옆 코르크 고리를 부는 일단 젤을 저장 하는 장소가 있다. 여기 접시 샌드위치를 놓습니다. 젤 부 어 판 앉아 하는 장소 이므로 싱크대에 코르크 마 개를 넣어. 젤 상단 싱크대의 가장자리에 휴식 하는 동안 하단의 코르크 마 개에 휴식 그래서 각도, 유리 접시 샌드위치에 부 어 있을 것 이다. 확인이 영역 아래에 패드 polyacrylamide에서 쏟아지는 경우
      5. 장소 APS 솔루션 및 빈 싱크로의 반대편에 TEMED 솔루션 병 물 총. 우물의 원하는 번호로 잘 빗 접시와 싱크 측면에 놓습니다. 근처 4 클램프 넣어.
        참고: 절차의 다음 단계는 매우 시간에 민감한. 이러한 단계를 통해 신속 하 게 이동 하는 준비 되십시오. 제한 된 양의 시간 전에 그것 polymerizes 판 사이의 혼합물이 있다. 모든 구성 요소 (micropipettes 올바른 볼륨, 솔루션, 유리 접시로 프리셋) 신중 하 게 젤을 가능한 한 빨리 부 어 정렬 됩니다. 느린 중 합 원하는 경우, APS와 TEMED 농도 절반 가까이 떨어졌다 될 수 있습니다; 그러나 이것은,, 더 이상 중 합 시간 필요.
      6. 표시 된 지점에 물 총 병에 20% 아크릴 아 미드 젤 솔루션을 붓는 다. 작은 누출의 경우 충분 한 솔루션 이므로 표시 된 선 위에 좀 더 젤 솔루션을 붓는 다. 이것은 약 120 mL 젤 솔루션의.
      7. TEMED 및 600의 µ L 추가 120 µ L APS의 동시에 물 총 병에 polyacrylamide 젤 솔루션. APS의 추가로 600 µ L polyacrylamide 젤 솔루션에 신속 하 게 추가.
      8. 신속 하 게 모자는 물 총 병 및 소용돌이입니다. 싱크대에 접시 샌드위치를 놓습니다.
      9. 쏟아져 시작합니다. 이 중 합을 방지 하기 위해 1-2 분 소요 됩니다. 천천히, 하지만 꾸준히 추가 압력 물 총 병에 젤 솔루션 균등 하 게 나온다. 솔루션 시작 되 면 물 총 병에서 불규칙 spattering, 압력 병 증가 된다, 그래서 놓고 쏟아져 다시 시작. 시계 되도록 젤 솔루션 모든 영역을 다루는 어떤 측면에서 유출 되지 않습니다. 기포 제거, 플레이트의 각도 변경 합니다. 거품, 상단에 나타납니다 그리고 각도가 가파른 경우 더 빠르게 실행 됩니다. 계속 쏟아져 솔루션 노치 영역의 상단에 도달 했습니다 때까지 약간 노치 지 넘쳐. 모든 기포를 제거.
        참고: 접시 샌드위치 누수 하는 경우 또는 하지 충분 한 젤 솔루션 및 솔루션 플레이트의 상단에 도달 하지 않습니다, 젤을 사용할 수 없습니다. 젤 생산은 때까지 기다려 고 그에 따라 청소.
      10. 접시 샌드위치를 잘 빗을 추가합니다. 아래로 누르고 우물의 분배에 대 한 허용 빗에 클램프 장소 4.
      11. 신속 하 게 물 총 병에 나머지 젤 솔루션의 레이블이 polyacrylamide 낭비로 처분. Di 물 총 병 분출 노즐을 통해 2-3 번, 물 밖으로 씻어.
        참고: 그것은이 청소 물 총 병에 막힘에서 polyacrylamide를 방지 하기 위해 신속 하 게 수행 하는 것이 중요입니다. 작은 양의 합 노즐 내에서 발생 하면, 다음 젤 너무 천천히 그리고 성공적으로 부 어 있을. 물 총 병 중 발생 하는 경우 삭제.
  4. 아크릴 아 미드 젤을 실행
    1. 젤은 생산 되 고, 1 x TBE 실행 버퍼 확인. 초순의 1 리터에 17 g premixed TBE 고체의 분해. 모든 TBE 해산 될 때까지 버퍼를 흔들.
    2. 접시 샌드위치에서 모든 바인더 클립 제거.
    3. 면도칼을 사용 하 여 테이프 잘라 접시 샌드위치의 모든 가장자리에서 테이프를 제거 하.
    4. 깨끗 한 유리 표면에서 모든 polymerized 젤 떨어져. 가장자리를 따라 면도기를 사용 하 여 나머지 젤을 다쳤어요. 종이 타 올, 최대한 많은 polyacrylamide 잔류물을 제거 하는 물 접시를 닦아. 초과 아크릴 또는 테이프 종종 젤 전기 이동 법 동안 구울 수 있습니다.
    5. 양쪽에 균등 하 게 밖으로 밀어 잘 빗을 제거.
    6. 면도기를 사용 하 여 잘라 접시 샌드위치 상단의 초과 젤. 접시의 금이 낸된 가장자리를 따라 슬라이스.
    7. 린스 우물 우물에서 파편을 제거 하는 주사기와 디 물을 사용 합니다. 각 잘 물으로 채워질 수 있다 그리고 과잉 생산 젤에 의해 차단 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
    8. 배치 접시 샌드위치는 장치에 더 이상 접시 바깥쪽, 직면 하 고 노치 공간 안쪽으로 직면 하 고.
    9. 기구 함께 접시 샌드위치와 알루미늄 플레이트를 추가 클립. 실행 되 고 있는 홍보 플레이트의 바깥쪽에 추가.
    10. 추가 TBE 버퍼 기본 노치와 상단에 우물을 충당 하기 위해 충분히 커버입니다. TBE 버퍼를 필터링 하 고 약 5 젤에 대 한 다시 사용할 수 있습니다.
    11. W. 50에서 젤 전기 이동 법을 실행 하 여 20 분 동안 따뜻한 접시
    12. 번호판 온난 후 우물을 청소. 나머지 버퍼 소금 우물에서 물 총 목욕에서 주사기와 TBE 버퍼를 사용 합니다. 되도록 깨끗 한 우물이 여러 번 마십시오. 우물 깨끗 한 있다면, 밴드는 희생양 그리고 이미지 해석할 수 없습니다. 비록이 시간이 소요 될 수 있습니다, 우리는 그것을 발견 좋은 데이터를 취득 하는 것이 필수적.
    13. 피펫으로 5 µ L bromophenol 블루 95 %formamide 양쪽에 바깥쪽 레인을. 이것은 동일한 솔루션 QBO, 하지만 오렌지 G. 대신 블루 bromophenol 이 젤 이미징, 그리고 DNA 내려 얼마나 멀리 잘라 어디에 visual 실행을 제공 합니다.
    14. 분석할 각 샘플 (섹션 2.1.1에서에서 생성), 젤의 단일 잘 3 µ L 추가. 모든 샘플을 로드 한 후 정착 샘플에 대 일 분 기다립니다.
    15. 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 욕조에 넣어
    16. 모자. 장치에 와이어를 연결 합니다. 레드 DNA 달리 아래쪽 하단에 있어야 그래서 긍정적인 전기 료를 나타냅니다.
    17. 첨부 한 소스 전선과 약 3 h 젤 50-55 W. 실행을 설정 또는 파란색 염료 전면 실행은 bromophenol까지 젤 아래로 적어도 2/3.
  5. 젤 이미징
    참고:이 젤 매우 얇은 이며 처리 하기 어려울 수 있습니다. 훌륭한 고 전체 젤의 손실을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다.
    참고: DNA 라벨에 따라 그것은 이미 저는 다른 젤을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜 사용 하 여 근 적외선 형광 염료와 샘플의 이미징 젤 영상에서 수행 되었다 (재료의 표 참조). 프로토콜은 특별히 그 영상에 작성 됩니다.
    1. Bromophenol 파랑 염료 전면 실행 때 젤 아래로 2/3 이상 (~ 28 cm), 젤 힘을 해제 하 여 중지 할 수 있습니다. 기구 및 코르크 반지에 장소에서 젤 제거.
    2. 판 작은 쐐기 판 구분 구분합니다. 내부에는 구분 기호를 배치를 노치의 코너. 주의 사용 하 고 과도 한 힘;를 사용 하지 마십시오 노치는 너무 많은 압력이 적용 되 면 깰 수 있다.
    3. 일단 접시 사이 흡입 출시, 신중 하 게 상단 플레이트 들어올린 젤은에 있는 접시를 결정. 만약 젤 하단 플레이트에 스틱, 상단 플레이트 챌 고 코르크 링에 놓습니다. 해제 되 고 상단 플레이트에 젤 있으면 천천히 이동 하 고 젤 아래 접시 다시 떨어질 수 있습니다. 젤이을 하지 않는 경우 다시 천천히 이동 아래 접시에서 젤의 나머지 부분을 당겨 그리고 별도 코르크 반지는 상단 플레이트에 젤 위.
    4. 판 분리는 일단 젤에 염료가 참조 고 젤의 위아래에서 초과 젤을 제거 합니다. 일반적으로, 우리의 구조는 18 또는 23 뉴클레오티드 뇌관 및 45 뉴클레오티드 서식 파일 중 하나를 사용 하 여 있다 bromophenol 파랑 염료 앞과 젤의 바닥 사이 아무 DNA. 젤 상단에는 염료에서 수직으로 잘라. 염료와 젤의 가장자리 사이의 공간에는 또한 아무 DNA 있다. 마지막으로,에 젤 잘 공간 아래 몇 인치를 절단. 젤의 맨에 없는 핵 산이 있다.
      참고: 작은 크기 가능한에 젤 절단 쉽게 크게 이미징 장치에 전송 있습니다. 젤 너무 큰 경우에, 그것은 전송 하는 동안 리핑에 더 취약입니다. 우리는 종종 이미징 전에 젤 트림, 하는 동안 케어 촬영 되지 않습니다 경우 관련 데이터는 손실 될 수 있습니다으로 트리밍 때 극단적인 주의 사용 하는 것이 좋습니다. 추가 데이터를 포함 하는 부분 제거 여부를 확인, 하 우리 종종 데이터가 손실 되었습니다 있도록 젤의 삭제의 추가 검사를 수행 합니다.
    5. 밖으로 건조를 방지 하기 위해 물으로 젤 코트.
    6. 영상 표면 청소. 물과 에탄올으로 표면 아래로 닦아 작업와이 퍼를 사용 하 여. 젤을 배치할 것 이다 표면에 물의 얇은 코트를 추가.
    7. Li-오호의 젖은 표면에 젤의 원하는 부분을 전송
    8. 여 부드럽게 그들을 밖으로 젤에서 작업와이 퍼로 닦아의
    9. 제거 공기 거품 그것은 매우 쉽게 공기 거품을 너무 열심히 추진 하 여 젤을 버리고 주의 사용.
    10. 이미지는 제조 업체에 따르면 젤 ' s 프로토콜. 영상에 대 한 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 젤 분석.
    11. 젤 몇 군데 되 고는, 하는 동안 초과 아크릴 아 미드 젤을 제거, 세척 접시, 및 TBE 버퍼를 다시 사용할 수를 필터링 하 여 작업 공간을 청소.

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Representative Results

안정-상태 활동 (섹션 2.1, 그림 2의 결론에서 참고에서 설명)와 (섹션 2.1, 그림 1에 설명 된) 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석 표시 됩니다. 실패 polyacrylamide 젤 분석 (그림 3) 표시 됩니다.

참고 아무 상업적으로 사용할 수 있는 사다리 또는 분자 마커 사용 됩니다. 때때로,를 사용 하 여 알려진된 중 합 효소-기질 조합을 만드는 분자 마커; 그러나, 다른 수정된 뉴클레오티드 매우 다른 전기 이동 mobilities, 부적절 한 길이가 동일 하지만 서로 다른 염기 구조 oligonucleotides의 비교를 만들기가 중요 하다.

Figure 1
그림 1: 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석의 예. 참고 개별 밴드는 잘 정의 되 고 일반. 밴드 대표 oligonucleotides의 서로 다른 길이; 이 젤 쉬운 비교를 polymerases 수 있습니다. 없는 효소 제어 차선 표시 됩니다 있는 "-". 활동은 제품의 두 길이 및 더 큰 제품으로 변환 되는 레이블이 뇌관의 부분에 의해 재판 된다. 이 분석에서 E6 및 e 5는 가장 활발. E 3와 e 2는 약 활동에서 동일 하지만 E6 또는 E5, 보다 적게 고 E4 및 e 1은 최소한 활성 효소.

Figure 2
그림 2: 정상 상태 활동을 사용 하 여 정량 분석에 대 한 성공적인 젤의 예. 밴드는 잘 해결 하 고 잘 정의 된 note. Oligonucleotide 종합에서 개별 단계의 정상 속도 상수를 측정 하는 효소 (이 경우에 dCTP); nucleoside 3 인산 염의 다양 한 양으로 incubated 참고만 n (n + 1) 제품 사용 단 수 이벤트의 정량화 합성 됩니다.

Figure 3
그림 3: 전반적인 활동에 대 한 실패 한 젤의 예. 젤 밴드에 표시 간격의 결과로 처리 하는 동안 찢 어 졌다. 젤 밴드는 불규칙 모양, 정량화 그리고 분석을 어렵게 하는 참고.

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Discussion

여기, 우리는 M-DNA의 DNA 중 합 효소 중재 합성 특성 분석 결과 설명 했습니다. 근처-적외선 레이블이 DNA 뇌관을 사용 하 여 다르게 크기 oligonucleotides 해결 하려면 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 합성의 정확한 측정을 사용 oligonucleotides, 단일 뉴클레오티드 해상도 얻을 수 있습니다 우리. 이러한 접근 하거나 효소 (섹션 2.1)의 전반적인 활동을 측정 하거나 개별 단계 (다음 단계 2.1 참고)의 Michaelis-Menten 매개 변수를 측정에 사용할 수 있습니다. 연구소는 최근 사용이 둘 다 이전 진화 효소9 특성으로 효소10를 합리적으로 설계.

여기에 설명 된 우리의 분석 비 방사성 DNA 라벨의 그들의 사용에서 이전 방법에서 차이가 있습니다. 역사적으로, 방사능 방사성 인 라벨11,18를 사용 하 여 얻을 수 있는 높은 감도 때문에 DNA 합성을 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 불행 하 게도, 처리의 높은 비용 뿐만 아니라 방사성 라벨의 한정 된 수명 만들 수 있습니다 방사성 상표 사용 금지. 여기, 우리는 근처-적외선 fluorophore 이러한 단점에서 고통을 하지 않는 DNA 분류를 사용 하 여를 설명 합니다. 특히, 근 적외선 형광 염료와 우리 방사성 레이블이 DNA (게시 되지 않은 결과)에 비슷한 검색 제한 참조. 그러나, 눈에 보이는 범위에서 형광 염료, 우리 수 없었습니다 비슷한 검출 한계 (게시 되지 않은 결과)를 관찰 하. 우리의 그룹은 일반적으로 근처-적외선 fluorophores 베어링 상업적으로 준비 된 DNA를 사용, 이러한 염료 설립 후 종합 5' 수정 화학이이 라벨을 설치 하는 데 사용할 수의 숫자와 호환 됩니다.

근 적외선 형광 염료는 또한 유리한 단일 실험에서 두 개의 레이블된 oligonucleotides의 합성을 모니터링 하는 보다 복잡 한 실험을 설정할 수 있습니다 여러 상용 색깔이 있다. 방사성 레이블 multicomponent 실험의이 종류는 쉽게 실행 되지 않습니다. 이 가능성이 더 복잡 한 실험, 특히 직교 복제 실험에 대 한 수가 있게 된다.

이 분석 결과 및 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 분석 하는 모든 결과 전기 이동 법, 낮은 처리량 제한 크기 범위에서 관찰 되는 이러한 실험의 실행 기술적인도 전에 의해 주로 제한 됩니다. 단일 뉴클레오티드 해상도입니다. 이 상세한 프로토콜 이러한 분석 실험의 기술적 과제를 극복 하기 위해 그룹을 사용 하겠습니다. 특히, 분석 결과의 처리량을 제한 하는 동안 근 적외선 형광 라벨의 사용은 증가 시킨다 처리량는 autoradiograph를 개발 하는 사용자를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 젤은 여전히 약 4-6 h 설정 하 고 실행, 하루 실행 될 수 있는 실험의 수를 제한 걸립니다. 제한 된 범위는 polyacrylamide 전기 이동 기능에 의해 발생 합니다. 이러한 제한은 실질적으로 말하기,이 분석 실험은 단일 뉴클레오티드 해상도 요구 하는 집중된 연구 질문에 대 한 최고의 의미.

최근, 높은 처리량 DNA 시퀀싱19 DNA polymerases20,21을 특성화 하는 방법으로 점점 사용 되었습니다. 이 분석 실험은 시퀀스 편견과 오류 스펙트럼에 초점을 맞춘 광범위 한 질문을 가능 하 게 그들의 극적으로 증가 된 처리량에 대 한 주목할 만하다. 중요 한 것은, 높은 처리량 시퀀싱 많은 병렬 실험을 설정할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 단일 뉴클레오티드 기준 해석 하 도전적 될 수 있다. 이이 문서에서 설명 하는 방법와 서 몇 년 동안 관련 되도록 높은 처리량 연속 격차에 채우기 위해 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 채용 하는 효소 분석 실험에 대 한 흥미로운 기회를 제공 한다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 작품은 과학 발전 (Cottrell 대학 학술 상 #22548)에 대 한 연구 corporation 및 TriLink 바이오 (ResearchReward 그랜트 #G139)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

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References

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