DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Biochemistry

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

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Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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Abstract

Für jedes Enzym sind robustere, quantitative Methoden zur Charakterisierung von Einheimischen und veränderter Enzyme erforderlich. Für DNA-Polymerasen kann DNA-Synthese mit einem in-vitro- DNA-Synthese Assay gefolgt von Polyacrylamid Gelelektrophorese charakterisiert werden. Dieser Test soll Synthese der natürlichen DNA und veränderte DNA (M-DNA) zu quantifizieren. Diese Ansätze sind besonders nützlich für die Lösung Oligonukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung, Beobachtung der einzelnen Schritte bei der enzymatischen Oligonukleotid-Synthese ermöglicht. Diese Methoden wurden für die Bewertung von einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften wie die Messung von stationären Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Schritte der DNA-Synthese, die Fehlerquote der DNA-Synthese und DNA Bindungsaffinität angewendet. Durch die Verwendung modifiziert Komponenten einschließlich aber nicht beschränkt auf, veränderte Nukleosid Triphosphate (NTP), M-DNA und/oder mutierte DNA-Polymerasen, der relative Nutzen der Substrat-DNA-Polymerase, die Paare effektiv ausgewertet werden können. Hier zeigen wir die Probe selbst, einschließlich der Änderungen, die vorgenommen werden müssen, um nicht traditionele Primer-DNA Kennzeichnung Strategien wie Nahinfrarot-Fluoreszent DNA mit der Bezeichnung unterzubringen. Darüber hinaus haben wir entscheidende technische Schritte für Acrylamid Gel Gießen detaillierte und ausgeführt, die häufig lassen sich technisch anspruchsvoll.

Introduction

DNA-Polymerasen führen Sie genaue und effiziente DNA-Synthese und sind unerlässlich, um die Integrität des Genoms. Die Möglichkeit, Hunderte von Nukleotiden pro Sekunde zu synthetisieren, ohne Fehler macht auch DNA-Polymerasen wesentliche Instrumente in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Jedoch schränken diese Eigenschaften auch die Anwendungen für M-DNA-Substrate; im Allgemeinen können nicht natürlichen DNA-Polymerasen viele potentiell wertvolle M-DNA-Substrate, wahrscheinlich wegen zu hohen Selektionsdruck gegen die Verwendung von nicht standardmäßigen Substrate in Vivozu synthetisieren. Viele Gruppen entwickelten gerichteten Evolution Ansätze um mutierte DNA-Polymerasen von M-DNA Synthese1a,2,3,4,5fähig zu generieren; Diese Bemühungen haben das biotechnologische Dienstprogramm DNA-6,7,8erweitert.

Die Fähigkeit des mutierten DNA-Polymerasen, M-DNA synthetisieren bewerten wir9,10, und andere11,12,13 RadioButtonList-Steuerelement in Vitro Messungen der DNA Polymeraseaktivität, die in dieser Handschrift beschrieben werden. In diesen Experimenten sind DNA-Polymerasen zusammen mit beschrifteten Grundierung/Vorlage duplex und Nukleosid Triphosphat Substrate inkubierten; die Produkte werden durch Gelelektrophorese bewertet. Je nach spezifischen experimentellen Frage, mutierte DNA-Polymerasen, modifizierte Primer können geänderten Vorlagen oder modifizierte Nukleosid Triphosphate verwendet werden, ermöglicht die systematische biochemische Auswertung der mutierten Enzym-Aktivität.

In der Vergangenheit haben diese Tests auf einem 5' radioaktive Aufkleber, DNA-Synthese zu verfolgen verlassen; am häufigsten sind 32P und 33P benutzt worden; in der Regel ist das beschriften mit T4 Polynukleotid Kinase11erreicht. Durch die endliche Lebensdauer und relativ hohen Kosten der radioaktiven Etiketten und deren sichere Entsorgung verwendet unsere Fraktion jedoch stattdessen ein Nahinfrarot-Fluorophor synthetische 5' DNA bezeichnet. Verwenden einen relativ kostengünstige Nahinfrarot-Gel-Imager, haben wir ähnliche Nachweisgrenzen zu früheren Studien, die mit radioaktiven Etiketten (unveröffentlichte Ergebnisse) beobachtet. Wir haben erfolgreich reproduziert, vorbei an Beobachtungen9, und wir haben keinen großen quantitativen Unterschied mit zuvor gemessenen Geschwindigkeitskonstanten (unveröffentlichte Ergebnisse) nicht eingehalten.

Um die Größe der DNA und damit das Ausmaß der DNA-Synthese zu analysieren, setzen wir auf Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Methoden ursprünglich für Sanger-Sequenzierung14 vor dem Aufkommen der Kapillarelektrophorese15entwickelt. Der Abstand der Trennung oder Mobilität kann als ein Maß der Molekulargewicht verwendet werden; Großformat, vertikale Polyacrylamid-Gele können Einzel-Nukleotid-Auflösung, ermöglicht quantitative Beobachtung der DNA Oligonucleotides unterschiedlicher Länge erreichen.

Gemeinsam sind diese Experimente eine robuste Methode zur Charakterisierung der Polymerase. Aufgrund der Zeit ist sensiblen Reaktionen, Vorbereitung und Betreuung notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Weiter, während die Acrylamid-Gel eine äußerst effektive Methode zur Messung der DNA-Synthese, sowie zahlreiche andere DNA Änderungen Reaktionen, mit Einzel-Nukleotid-Auflösung ist, kann es technisch anspruchsvoll sein. Das Protokoll hier wird hoffentlich ermöglichen Benutzern, diese Experimente durchführen, während die häufigsten Fehler zu vermeiden.

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Protocol

1. Activity Assay

Hinweis: Es gibt zwei typische Arten von Assays, die häufig ausgeführt werden, um DNA-Polymerasen mit den beschriebenen Methoden hier zu charakterisieren. Sie unterscheiden sich in ob sie qualitativ charakterisieren allgemeine Synthese (umfasst viele Schritte der DNA-Synthese) oder ob sie quantitativ auf einzelne Schritte konzentrieren. Wir beschreiben die notwendigen Schritte für jede dieser unten.
Hinweis: Da die Montage von Materialien für empfindliche Experimente Zeit relativ komplex sind, empfehlen wir, dass alle Materialien vorher montiert werden. Die Rezepte aller kritischen Komponenten des Assays sind unten aufgeführt. Kommerzielle Anbieter für Komponenten in der Tabelle der Materialien aufgeführt sind.

  1. 10 x SF Puffer Rezept (10 X SFB)
    Hinweis: In unseren Tests verwenden wir in der Regel die N-terminale Abschneiden der DNA-Polymerase I von Thermus Aquaticus, allgemein bekannt als Stoffel fragment (SF) 16 , 17. Das Rezept hier ist der bevorzugte Puffer für SF 3 , 13. Anderen Puffer können je nach den spezifischen DNA-Polymerase ersetzt werden.
    Hinweis: Die Endkonzentration der 10 x SF Puffer Komponenten sind 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s), und Reinstwasser. Messungen sind für 1 mL der SF-Puffer, der für 100-200-Assays, je nach Umfang ausreicht. Der Puffer kann auf unbestimmte Zeit bei-20 ° c aufbewahrt werden
    1. Kombinieren 0,5 mL 1 m Rohr Tris, 65 µL 1 M MgCl 2, 50 µL 10 mg/mL BSA und 0,0373 g KCl (s) in einer 1,5 mL. Fügen Sie 385 µL Reinstwasser zu einem Endvolumen von 1 mL.
  2. 1 X Puffer speichern Rezept (1 X SB)
    Hinweis: die Endkonzentration von 1 x Puffer Komponenten sind 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 0,6 mM EDTA und 50 % Glycerin. Das Rezept macht 20 mL 1 X SB.
    1. Kombinieren 0,012 g DVB-t, 100 µL 0,5 M EDTA, und füllen Sie ein 50 mL konische Rohr mit 40 mL 100 mm Tris (pH 7,5), 2xSB zu machen. Mix von vortexen.
    2. 10 mL 2 X SB eine neue 50 mL konische Rohr und verdünnen mit Glycerin durch Zugabe von 10 mL Glycerin auf die neue konische überführen.
  3. Sprüh Puffer orange (QBO) Rezept
    Hinweis: wenn radioaktive Etiketten verwendet werden, Benutzer werden oft beschäftigen Bromophenol blue und/oder Xylol Cyanol als Farbstoff für Elektrophorese Fortschritte verfolgen. Jedoch fluoreszieren diese Farbstoffe schwach in der Nah-Infrarot-Region, das DNA-Signal stört. Daher verwenden wir Orange G an ihrer Stelle für alle Reaktionen, die Proben enthalten. Während wir Orange G geeignet für die Verfolgung von Gel laden gefunden haben, fanden wir Orange G weniger konsequent als Farbstoff, die Elektrophorese mitverfolgen; so laufen wir leere Gassen mit Bromophenol blue auf den äußeren Bahnen des Gels, die keine Probe um den Gel-Fortschritt zu verfolgen.
    1. Kombinieren 950 µL 95 % Formamid mit 25 µL 0,5 M EDTA und 25 µL Reinstwasser. Fügen Sie 1 Messlöffel von orange G Farbstoff (~ 10 mg). Mix von vortexen.
      Achtung: Formamid ist giftig; persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wie Brillen, Handschuhe und Kittel zu tragen, und als Sondermüll entsorgen.

2. Test Run

  1. qualitativen Charakterisierung der Gesamttätigkeit
    Hinweis: für diesen Test in der Regel pflegen wir konstanten Konzentration des M-NTPs und Zeit variieren. Ziel ist es, die grundlegenden Eigenschaften des Proteins zu bewerten, als jeden einzelnen Schritt zu messen. Um eine mögliche Reaktion vorzubereiten, wird ein gleiches Volumen von zwei separaten Komponenten, den duplex-Mix (siehe Schritt 2.1.1) und der dNTP-Mix (siehe Schritt 2.1.2), separat hergestellt und dann kombiniert, um das Endvolumen von 49 µL geben. Die Zugabe von 1 µL 50 X Enzym wird dann die Reaktion einleiten. Variable Zeitpunkten können genommen werden; in der Regel löschen wir bei 0, 5, 15 und 60 Minuten.
    1. Vorbereitung von DNA duplex Mischung
      Hinweis: der duplex-Mix besteht aus 10 x SF Puffer, Grundierung Oligonukleotid, Vorlage Oligonukleotid und Reinstwasser. Hinzugefügt, um jede Reaktion beträgt 25 µL. 1 µL Enzym zu den master-Mix unmittelbar vor der Einweihung des Experiments hinzukommen werden.
      Hinweis: Für unsere Tests verwenden wir in der Regel eine 45-Mer-Vorlage und ein 18-Mer oder 23-Mer Primer. Während eine Reihe von unterschiedlichen Längen verwendet werden kann, neigen wir dazu, diese Länge zu verwenden, da die Produkte (von 18 Nukleotiden bis 45 Nukleotide) auf einer Einzel-Nukleotid-Ebene mit der beschriebenen Gel-Elektrophorese-Protokolle leicht gelöst werden. Wie Oligonukleotid-Produkte in der Länge zu erhöhen, kann es schwierig sein, um die Produkte mit Einzel-Nukleotid-Auflösung zu beheben.
      Hinweis: In unseren Experimenten, verwenden wir ein 5 ' Fluoreszenzfarbstoff Nahinfrarot-Label auf dem Primer-Strang, die Grundierung Produkte zu beobachten. Wir kaufen benutzerdefinierte synthetisierte Oligonukleotide, wobei diese Änderung; jedoch kann dieses Etikett mit einer Reihe von Post-synthetische Kennzeichnung Strategien integriert werden. Die Vorlage Oligonukleotid ist nicht beschriftet und so ist es nicht mit der Gel-Imager beobachtet. Für beide Oligonukleotide, speichern wir die Oligonucleotides bei 100 µM in 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      Hinweis: Da wir nur die Grundierung beobachten, ein zwei-Fach-Überschuss an Vorlage dient um sicherzustellen, dass alle Primer (DNA-Spezies, die beobachtet wird) an der Vorlage geglüht werden. Die Endkonzentration duplex in dieser Reaktion ist 40 nM.
      Hinweis: Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffen sind oft etwas lichtempfindlich; Wenn möglich, abdecken wir die Grundierung (und jede Lösung mit dem Primer) mit Folie. Dazu gehören das Polyacrylamid-Gel, während er ausgeführt wird.
      Hinweis: Im folgenden ist ein repräsentatives Beispiel der Synthese von 2 ' F M-DNA.
      1. Verdünnen Primer 1 und Vorlage 1 (siehe Tabelle der Materialien für Sequenz) bis 1 µM Reinstwasser.
      2. Für jedes Assay-Reaktion, in getrennten Röhren, kombinieren, 5 µL 10 x SF Puffer, 2 µL 1 µM Grundierung 1, 4 µL 1 µM Vorlage 1 und 13 µL Reinstwasser in Tuben mit einem Thermocycler.
      3. Glühen die Maisonette in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 98 ° C für 2 min, 70 ° C für 5 min, 50 ° C für 5 min, 40 ° C für 5 min halten bei 25 ° C. Das spezifische Programm variieren je nach der Anlasstemperatur der duplex-Grundierung/Vorlage. Wir bevorzugen in der Regel mindestens 5 min Schritt für Schritt die Anlasstemperatur und dann ein weiterer 5-min Schritt bei einer Temperatur von 5-10 Grad unter der Anlasstemperatur.
    2. Vorbereitung der 2 X dNTP Mischung
      Hinweis: je nach dem Experiment, es ist möglich, Variablen dNTPs und Konzentrationen von dNTPs verwenden. In der Regel verwenden wir 50-200 µM in der Reaktion.
      1. Bereiten Sie eine 25 µL Lösung enthält 100 µM je 2 ' F-NTP. Speichern Sie die M-NTPs bei 100 mM.
    3. Vorbereitung von 50 x Protein Verdünnung
      Hinweis: für die langfristige Lagerung, Enzyme bei-20 ° C im 1xSB aufbewahrt werden. Entnahme aus der Tiefkühltruhe-20 ° C sollte Enzyme auf dem Eis zu jeder Zeit vor der Zugabe zu den master-Mix gehalten werden. Jeden Tag sollten Enzym Verdünnungen frisch aus der Kraftbouillon erfolgen. Die konzentrierte Enzym-Aktie in den Gefrierschrank-20 ° C sofort nach Gebrauch zurückgegeben werden sollten.
      Hinweis: Da wir in erster Linie die mutierte DNA-Polymerasen bewerten, verwenden wir nur Enzyme, die zum Ausdruck gebracht und gereinigt wurden in unserem Labor mit etablierten Methoden 9 , 10. Für im Handel gekaufte Polymerasen, Benutzer sollten vorsichtig sein, der optimale Puffer für verschiedene Proteine und deren Kompatibilität mit der hier beschriebenen Puffern.
      Hinweis: Für jedes Experiment Enzymkonzentrationen variieren. Hier zeigen wir ein repräsentatives Beispiel für 2 ' F-DNA-Synthese.
      1. Machen eine 10 nM Enzymlösung, verdünnen Sie 1 µL Enzym into 1 X SB, eine 50 X letzte Enzym-Konzentration zu machen. Sollte die Konzentration der Lösung 50 X 500 nM. Zum Beispiel, wenn die Lager Enzym Konzentration 50 µM, hinzufügen 1 µL Lager Enzym 99 µL 1 x SB
        Hinweis: Da das Enzym in der Regel in 50 % Glycerin gespeichert ist, ist die Lösung relativ zähflüssig. Auch wenn hochgenaue Pipetten verwenden, empfiehlt sich nicht weniger als 0,5 µL Pipettieren in Anbetracht der Bedeutung von Genauigkeit und Präzision während Enzym Verdünnung.
    4. Einleitung der Assay
      1. stellen Sie die Temperatur von einem Trockenbad bis 50 ° c
      2. Hinzufügen 24 µL des geglühten Duplex mischen (siehe Schritt 2.1.1) zu 25 µL 2 X dNTPs (siehe Punkt 2.1.2).
      3. Entfernen 9,8 µL des Gemischs im Schritt 2.1.4.2 und fügen Sie auf 20 µL QBO (siehe Abschnitt 1.3 für Rezept). Dieser Aliquote dient als ein " kein Enzym " Steuern und erhalten Sie für jeden Lauf.
      4. 0,8 µL 50 X Enzym hinzufügen (siehe Schritt 2.1.3.1) in den Duplex/dNTP-Mix. Pipette rauf und runter mit einem großvolumigen Mikropipette gründlich mischen.
      5. Nach 5, 15 und 60 min., stillen die Reaktion von 10 µL jeder Reaktionslösung entfernen und hinzufügen zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 20 µL QBO (beschrieben in Abschnitt 1.3).
      6. Einmal gestillt, verstauen Reaktionen unter Folie auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C oder-20 ° c
        Hinweis: Für quantitative Charakterisierung der einzelnen Schritte des M-DNA-Synthese, kann eine sehr ähnliche Tests ausgeführt werden, um quantitativ Michaelis-Menten-Parameter zu erhalten. Dieser Assay verwendet alle aus dem gleichen Material. Michaelis-Menten-Parameter können für die dNTP gemessen werden; in diesem Fall der wichtigste Unterschied ist, dass, anstatt dNTP-Mix die duplex Mischung hinzufügen, es fügt die duplex-Mix mit Enzym zu einer Reihe von 2 X dNTP Lösungen. Ebenso können die Michaelis-Menten-Parameter für DNA Duplex gemessen werden. Bestimmte Bedingungen müssen erfüllt sein, um die Annahmen erforderlich, um die Michaelis-Menten-Gleichung verwenden gerecht zu werden. Diese Bedingungen und die grundlegende Mechanik des Assays, sind gut erklärt in einem vorherigen Methoden Artikel 11.

3. Gel-Elektrophorese

Hinweis: da das Gel Gießen zeitkritisch ist, werden alle Materialien vorher montiert. Die Rezepte aller kritischen Komponenten des Assays sind unten aufgeführt; Lieferanten sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

  1. 20 % Acrylamid Gel Acrylamid vorbereiten.
    Hinweis: Dieses Rezept macht 1 L von Acrylamid Mischung; ca. 120 mL dieser Lösung wird pro Gel verwendet. Diese Lösung bei Raumtemperatur unter Folie bis zu einem Jahr speichern.
    Achtung: Polyacrylamid ist neurotoxisch. Es ist wichtig, bei allen Arbeitsschritten des Gießens Gel Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen. Wenn Polyacrylamid auf Handschuhe bekommt, ersetzen Sie die Handschuhe sofort. Wenn Acrylamid nicht polymerisiert, legen Sie die kontaminierten Materialien in eine beschriftete Polyacrylamid Auffangbeutel.
    Hinweis: Vorgemischte 40 % Acrylamid mit 38,67 % Acrylamid und 1,33 % Bis-Acrylamid für ein Monomer Vernetzer Verhältnis von 29,1 wurde in dieses Protokoll verwendet.
    1. Wiegen 17 g vorgemischten FSME-Pulver. Sechs separate Teile von 70 g Harnstoff (insgesamt 420 g) wiegen.
      Hinweis: Der Harnstoff muss portionsweise hinzugefügt werden. Wir finde es am besten, es in sechs Teile aufgeteilt.
    2. Richten Sie ein 2 L Kunststoffbecher auf einem Teller rühren. Das Becherglas eine einzelne große Rührstab hinzufügen. Das Becherglas mit Folie abdecken, beim Mischen um Spritzer zu vermeiden.
    3. Fügen Sie 500 mL 40 % Acrylamid-Lösung in Becher füllen. Stellen Sie sicher die Lösung rühren.
    4. Add vorher gewogen-Out FSME. Fügen Sie eine Aliquote von Harnstoff. Lassen Sie die Lösung zu mischen. Harnstoff löst sich langsam und erscheinen verschwommen und weiß bei der ersten Zugabe. Fügen Sie langsam die restlichen Aliquote von Harnstoff in die Mischung im Laufe der nächsten Stunde. Lassen Sie die Lösung mischen, bis es vollkommen klar und farblos ist.
      Hinweis: In der Regel zulassen, dass dies über Nacht rühren. Wenn die Lösung noch nicht aufgelöst ist, kleine aliquoten Wasser hinzufügen und warten auf den Harnstoff aufzulösen.
    5. Die Zugabe von Harnstoff erhöhen Sie die Lautstärke in der Nähe von 1 L. Add Wasser erhöhen Sie die Lautstärke auf genau 1 L.
    6. Store in einem 1-L-getöntes Glas-Flasche oder die Glasflasche mit Aluminiumfolie abdecken.
  2. Eingießen von Acrylamid Gel.
    Hinweis: Beim Umgang mit Glasplatten, achten Sie darauf den Kontakt zwischen den Glasplatten und eine harte Oberfläche zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig, dass grobe Behandlung dazu, dass kleine Risse im Glas führen kann; diese Risse möglicherweise nicht sichtbar, bis das Gel die Auftritt bei einer höheren Temperatur läuft. Wir verwenden Kork Ringe um diesen unerwünschten Kontakt zu verhindern.
    1. Platten sauber
      1. erwerben zwei 33 x 42 cm Gel Platten, eine eingekerbt und einer ungekerbten Platte. Legen Platten auf separaten Korken Ringe.
      2. Teller spülen Sie gründlich mit Wasser und Seife. Stellen Sie sicher, es gibt keine Seife Streifen oder Gel Flecken hinterlassen.
      3. Notieren Sie sich die Seite der Platte Perlen weniger Wasser. Diese Seite befindet sich das Gel zugewandten Seite.
        Hinweis: Wenn das Gel auf der anderen Seite der Platte ausgeführt wird, kann es machen den Gel-Transfer herausfordernden.
    2. Trocknen Platten
      1. Papiertücher verwenden, um beide Gesichter jeder Platte trocken.
      2. Einsatz heikle Aufgabe Scheibenwischer verbleibende Flächen trocknen lassen. Besonderes Augenmerk auf die Ränder der Platten wo Band angewendet werden.
      3. Spülen die Glasplatten mit ~ 70 % Ethanol, und wischen Sie mit Aufgabe Scheibenwischer.
      4. Stellen Sie sicher, es gibt keine Papier-Handtuch-Fasern oder Wassertropfen. Diese können Luftblasen verursachen, wenn das Gel gießen.
    3. Fügen Sie Abstandshalter
      1. 0,75 mm Spacer zu erwerben. Behandschuhte Fingern unter DI Wasser laufen und die Abstandshalter mit behandschuhten Fingern sanft nass.
      2. Ort Abstandshalter entlang den langen Kanten von der gekerbte Platte. Bereinigen Sie Wasser, das auf den Rest der Platten gespritzt wird. Stellen Sie sicher, Abstandhalter sind abgestimmt auf die Glasplatte und nicht über den Rand hängen.
    4. Gel zu versiegeln
      1. trockene Handschuhe anziehen. Trocknen Sie die Kanten des Glases wieder mit heiklen Aufgabe Scheibenwischer.
      2. Ausrichten die ungekerbten Platte oben über der gekerbte Platte und langsam weiter unten die Platten gegeneinander drücken. Überprüfen Sie noch einmal, sicher sein, dass die Kanten alle Platten ausgerichtet sind.
      3. Mit Gel Band, legen Sie das Maßband über die Ränder mit Ausnahme der Spitze. Stellen Sie sicher Band ist gleichmäßig ausgerichtet und fest verschlossen. Klebeband aufgebracht werden, in einer Bewegung, oder jede Seite kann individuell erfolgen. Kürzen Sie die Enden des Bandes mit einem Rasiermesser.
      4. Fügen eine zusätzliche Schicht aus Klebeband auf den Boden des Gels. Je enger das Band, desto weniger wahrscheinlich das Gel wird Leck beim Ausgießen.
      5. Clip Seiten des Glassandwich mit den weißen Klemmen. Fügen Sie 3 Clips an jeder Seite und 4 Clips unten.
    5. Gießen das Gel
      1. 3 mL 10 % Ammonium-Bleichen-Lösung (APS) durch Auflösung 0,3 g Ammonium bleichen und Verdünnung bis zu 3 mL Reinstwasser machen.
        Hinweis: 1,2 mL APS wird pro Gel benötigt. Das Rohr nach so dass es bis heute. APS-Lösung läuft in 2 Wochen und aufbewahrt werden, bei 4 ° c
      2. Transfer 125 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) zu einem separaten Microcentrifuge Schlauch.
        Hinweis: TEMED ist giftig; tragen der PSA wie Handschuhe, Brillen und Lab beschichten wenn Handhabung.
      3. Erwerben eine Spritzflasche und entfernen Sie den Spitzen Trichter. 125 mL Wasser in einem Messzylinder abmessen und Hinzufügen der Flaschenhals. Markieren Sie der Wasserstand auf der Außenseite der Flasche mit einem wasserfesten Filzstift. Entsorgen Sie das Wasser. Diese modifizierte Spritzflasche wiederverwendet werden auf unbestimmte Zeit mit der richtigen Reinigung (siehe unten).
      4. Einrichten korkigen Ringe neben der Spüle, so gibt es ein Ort, um das Gel zu setzen, sobald es gegossen wird. Legen Sie das Sandwich Platte hier. Setzen Sie einen Korken in der Spüle, so gibt es ein Ort, um die Platten sitzen auf, während das Gel gegossen ist. Das Gel wird in die Glas-Platte-Sandwich in einem Winkel so unten auf den Korken ruhen wird, während oben auf den Rand der Spüle ruhen wird gegossen. Stellen Sie sicher, es gibt Pads unter diesen Bereichen für den Fall, dass Polyacrylamid ergießt sich aus
      5. Ort-APS und TEMED Lösung auf der anderen Seite des Beckens, mit der leeren Flasche Spritzen. Legen Sie die gut Kamm mit der gewünschten Anzahl von Brunnen auf der Seite der Spüle mit den Platten. Legen Sie 4 Klammern in der Nähe.
        Hinweis: Der nächste Schritt des Verfahrens ist sehr zeitkritisch. Seien Sie bereit, sich durch diese Schritte schnell bewegen. Gibt es eine begrenzte Menge an Zeit, um die Mischung zwischen den Platten bevor es polymerisiert. Alle Komponenten (Mikropipetten voreingestellt auf korrekte Volumen, Lösungen, Glasplatten) sind liebevoll eingerichtet, das Gel so schnell wie möglich zu gießen. Auf Wunsch eine langsamere Polymerisation ist APS und TEMED Konzentrationen können halbiert werden; Dies erfordert jedoch eine längere Polymerisationszeit.
      6. Mischung 20 % Acrylamid Gel in die Spritzflasche auf den markierten Punkt. Gießen Sie ein wenig mehr Gel-Lösung über die Strichmarke, so gibt es genügend Lösung bei kleinen Lecks. Dies ist etwa 120 mL Gel Lösung.
      7. Fügen Sie 120 µL TEMED und 600 µL APS der Polyacrylamid-Gel-Lösung in die Spritzflasche zur gleichen Zeit. Schnell eine zusätzliche 600 µL APS der Polyacrylamid-Gel-Projektmappe hinzufügen.
      8. Cap schnell die Spritzflasche und Wirbel. Legen Sie das Sandwich Platte in der Spüle.
      9. Beginnen Gießen. Dies dauert nur 1-2 min, um die Polymerisation zu vermeiden. Fügen Sie langsam, aber stetig, die Spritzflasche Druck hinzu, so dass die Gel-Lösung gleichmäßig herauskommt. Wenn die Lösung Spritzen unregelmäßig aus der Spritzflasche beginnt, lassen Sie den Druck, so dass die Flasche aufgeblasen wird und wieder Gießen. Beobachten Sie, um sicherzustellen, dass die Gel-Lösung deckt alle Bereiche, und es ist nicht undicht, von allen Seiten. Um Luftblasen zu entfernen, ändern Sie den Winkel der Platten. Die Bläschen erscheint an der Spitze und werden schneller ausgeführt, wenn der Winkel steiler ist. Fahren Sie fort, gießen, bis die Lösung den oberen Rand des gekerbten erreicht hat, und ist leicht gekerbten Rand überfüllt. Entfernen Sie alle Luftblasen.
        Hinweis: Wenn die Platte Sandwich undicht ist, oder es gibt nicht genügend Gel-Lösung und die Lösung erreicht nicht die Oberseite der Platten, das Gel kann nicht verwendet werden. Warten Sie, bis das Gel polymerisiert hat, und entsprechend reinigen.
      10. Fügen gut Kamm zum Sandwich Platte. Legen Sie 4 Klammern auf dem Kamm nach unten drücken und für eine gleichmäßige Verteilung der Brunnen ermöglichen.
      11. Schnell entsorgen Sie das restliche Gel-Lösung in die Spritzflasche in beschrifteten Polyacrylamid Abfall. Aus der Spritzflasche mit DI Wasser 2 - 3 Mal durch die Spritzen-Düse spülen.
        Hinweis: Es ist wichtig, dass diese Reinigung schnell Polyacrylamid verhindern Verstopfung in die Spritzflasche. Tritt sogar eine kleine Menge der Polymerisation innerhalb der Düse, wird das nächste Gel zu langsam und nicht erfolgreich gegossen. Spritzflasche zu verwerfen, tritt Polymerisation.
  3. Laufen die Acrylamid-Gel
    1. Gel ist polymerisiert werden, machen 1 X TBE laufenden Puffer. 17 g feste vorgemischten FSME in 1 Liter Reinstwasser auflösen. Puffer zu schütteln, bis alle FSME aufgelöst ist.
    2. Entfernen Sie alle Bindemittel-Clips aus der Platte Sandwich.
    3. Mit einem Rasiermesser schneiden Sie das Band und nehmen Klebeband von den Rändern der Platte Sandwich.
    4. Reinigen Sie alle polymerisierten Gel aus dem Glas-Oberflächen. Verwenden Sie ein Rasiermesser an den Rändern Gelreste abkratzen. Wischen Sie die Platten mit Papiertüchern und Wasser, so viel Polyacrylamid wie möglich entfernen. Überschüssige Acrylamid und/oder Band kann oft brennen, während Gelelektrophorese.
    5. Gut Kamm zu entfernen, indem Sie auf beiden Seiten gleichmäßig herausschieben.
    6. Verwenden Sie ein Rasiermesser, schneiden Sie das überschüssige Gel am oberen Rand der Platte-Sandwich. Scheibe den gekerbten Rand der Platte.
    7. Verwenden eine Spritze und VE-Wasser, spülen die Brunnen und entfernen Schmutz in den Vertiefungen. Stellen Sie sicher, jeder kann mit Wasser gefüllt werden, und ist nicht durch überschüssige polymerisierten Gel blockiert.
    8. Platte Sandwich in den Apparat zu platzieren, so dass die längere Platte steht nach außen vor, und der gekerbte Raum mit nach innen Blick.
    9. Add-Clips schneiden Sie die Platte Sandwich und Aluminium-Platte zusammen mit dem Gerät. Fügen Sie an der Außenseite der Platte zu fördern, sogar laufen.
    10. Hinzufügen TBE-Puffer zur Deckung der Basis Kerben und gerade genug, um den Brunnen an der Spitze zu decken. TBE Puffer gefiltert und für etwa 5 Gele wiederverwendet werden kann.
    11. Warme Platten für 20 min durch Ausführen der Gelelektrophorese bei 50 w.
    12. Nach Erwärmung der Platten, die Brunnen zu reinigen. Verwenden Sie eine Spritze und der TBE-Puffer in den Bädern, um die verbleibenden Puffer Salze aus den Vertiefungen Spritzen. Tun Sie dies mehrere Male um saubere Brunnen zu gewährleisten. Wenn der Brunnen nicht sauber sind, werden die Bänder Ausfransen und das Bild wird nicht interpretierbar sein. Obwohl dies zeitaufwändig sein kann, wir fanden es zwingend notwendig, um gute Daten zu erhalten.
    13. Auf der äußersten Spur auf beiden Seiten Pipettieren 5 µL 95 % Formamid mit Bromophenol Blue. Dies ist die gleiche Lösung wie QBO aber mit Bromophenol blau anstelle von Orange G. Dieses versieht eine visuelle auf, wo man das Gel für die Bildgebung und wie weit unten die DNA schneiden gelaufen.
    14. Für jede zu analysierende Probe (erzeugt in Abschnitt 2.1.1), geben Sie 3 µL in einer einzigen des Gels. Warten Sie nach dem Laden alle Proben, 1 min für Proben zu begleichen.
    15. Put Kappen an den oberen und unteren Kunststoff Bäder. Befestigen Sie die Drähte an den Apparat. Rot zeigt die positive elektrische Ladung, so dass es am Ende sein sollte, so dass die DNA nach unten läuft.
    16. Anhängen Drähte mit einem Exponenten Quelle und auf 50-55 W. Run das Gel für ca. 3 h oder bis die Bromophenol blauen Farbstoff vorne laufen hat mindestens 2/3 nach unten das Gel.
  4. Das Gel imaging
    Hinweis: dieses Gel ist extrem dünn und kann schwierig sein zu behandeln. Großer Vorsicht getroffen werden, zu Rippen und den Verlust des gesamten Gels zu verhindern.
    Hinweis: abhängig von der DNA-Label es mit verschiedenen Gel Imager erfordern. Dieses Protokoll verwendet Nahinfrarot-fluoreszierende Farbstoffe und Bildgebung der Proben erfolgte auf einem Gel-Imager (siehe Tabelle der Materialien). Das Protokoll ist speziell für die Imager geschrieben.
    1. Ausführung Bromophenol blauen Farbstoff vorne hat mindestens 2/3 nach unten das Gel (~ 28 cm), das Gel kann durch Ausschalten des Systems gestoppt werden. Entfernen Sie das Gel aus dem Apparat und auf Kork Ringe.
    2. Trennen die Platten mit einem kleinen Keil-Platte-Separator. Legen Sie das Trennzeichen im inneren Ecke der Kerben oben zu ziehen. Seien Sie vorsichtig und verwenden Sie keine übermäßigen Kraft; die Kerben können brechen, wenn zu viel Druck ausgeübt wird.
    3. Einmal saugen zwischen den Platten sind freigegeben, heben Sie die obere Platte vorsichtig und bestimmen, welche Platte ist das Gel auf. Wenn das Gel auf der unteren Platte klebt, ziehen Sie obere Platte ab und setzen Sie Korkring auf. Wenn das Gel auf der oberen Platte gehoben ist, bewegen sich langsam und das Gel auf die Bodenplatte zurückgreifen kann. Wenn das Gel nicht fällt, wieder langsam bewegen und ziehen Sie den verbleibenden Teil des Gels aus der Bodenplatte, und legen Sie die obere Platte mit dem Gel auf eine separate Korkring.
    4. Sobald die Platten voneinander getrennt sind, sehen, wo der Farbstoff auf das Gel und entfernen Sie überschüssiges Gel aus der Ober- und Unterseite des Gels. In der Regel mit unserer Konstrukte gibt mit entweder einem 18 oder 23 Nukleotid-Primer und eine 45 Nukleotid-Vorlage es keine DNA zwischen Bromophenol blauen Farbstoff vorne und der Unterseite des Gels. Schneiden Sie vertikal von der Farbstoff an der Spitze des Gels. Die Zwischenräume zwischen den Farbstoff und die Kanten des Gels haben auch keine DNA. Zu guter Letzt Schnitt ein paar Zoll unterhalb der gut Platz auf dem Gel. Es gibt keine Nukleinsäuren an der Spitze des Gels.
      Hinweis: Schneiden das Gel in die kleinstmögliche Größe erleichtert deutlich auf die imaging-Gerät übertragen. Wenn das Gel zu groß ist, ist es anfälliger für Rippen während der Übertragung. Obwohl wir oft schneiden Sie das Gel vor Bildgebung, empfehlen wir mit äußerster Vorsicht beim Trimmen, da relevante Daten verloren gehen können, wenn nicht geachtet wird. Um zu überprüfen ob entfernt Teile enthalten zusätzliche Daten, führen wir oft einen zusätzlichen Scan der ausgeschnittenen Teile des Gels um sicherzustellen, dass keine Daten verloren gegangen sind.
    5. Mantel das Gel mit Wasser, um Austrocknung zu verhindern.
    6. Reinigen Imager. Mit Aufgabe Scheibenwischer, wischen Sie die Oberfläche mit Wasser und Ethanol. Fügen Sie eine dünne Schicht von Wasser an die Oberfläche, wo das Gel platziert werden.
    7. Überweisen Sie den gewünschten Teil des Gels auf die nasse Oberfläche des Li-Kor
    8. Entfernen Air Bubbles von sanft drücken sie heraus aus dem Gel, und wischte sich mit einer Aufgabe Wischer. Seien Sie vorsichtig, da es sehr einfach, das Gel zu zerreißen, um die Luftblasen zu übertreiben ist.
    9. Bild das Gel nach Angaben des Herstellers ' s-Protokolle. Analysieren Sie das Gel mit verfügbaren Software für den Imager.
    10. Während das Gel Image erstellt ist, reinigen Sie den Arbeitsraum entfernen überschüssige Acrylamid Gel, Teller waschen und Filterung des TBE-Puffers wiederverwendet werden.

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Representative Results

Eine erfolgreiche Polyacrylamid-Gelanalyse der qualitativen Charakterisierung der Gesamtaktivität (beschrieben in Abschnitt 2.1, Abbildung 1) und der Steady-State Kinetik (siehe die Anmerkung am Schluss des Abschnitts 2.1, Abbildung 2) werden angezeigt. Eine erfolglose Polyacrylamid Gelanalyse zeigt auch (Abbildung 3).

Beachten Sie, dass keine handelsüblichen Leiter oder molekulare Marker verwendet wird. Gelegentlich nutzen wir eine bekannte Polymerase-Substrat-Kombination, um einen molekularen Marker zu erstellen; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass verschiedene NUK sehr verschiedene elektrophoretische Mobilitäten, unangemessene Vergleich der Oligonukleotide der gleichen Länge aber unterschiedlichen Nukleotid-Struktur haben.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiel für erfolgreiche Polyacrylamid-Gelanalyse der qualitativen Charakterisierung der Gesamtaktivität. Beachten Sie, dass die Bands gut definiert und regelmäßig sind. Die Bänder repräsentieren Oligonukleotide unterschiedlicher Länge; Dieses Gel ermöglicht einfachen Vergleich zwischen Polymerasen. Die keine Enzym-Kontrolle-Spur wird mit einem "-". Aktivität wird danach beurteilt sowohl die Länge der Produkte und der Teil der beschrifteten Grundierung, die für größere Produkte umgewandelt wird. Aus dieser Analyse sind E6 und E5 am aktivsten. E3 und E2 sind ungefähr gleich in der Aktivität, aber weniger als E6 oder E5 und E4 und E1 sind die zuletzt aktive Enzyme.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für erfolgreiche Gel für Quantitative Analyse mit Steady-State Kinetik. Beachten Sie, dass die Bänder sind gut gelöst und gut definiert. Zur Messung der stationären Geschwindigkeitskonstanten einzelner Schritte im Oligonukleotid-Synthese ist ein Enzym mit unterschiedlichen Mengen von Nukleosid-Triphosphat (in diesem Fall, dCTP); inkubiert. Beachten Sie, dass nur die n und (n + 1) Produkte synthetisiert werden, ermöglicht die Quantifizierung der singuläres Ereignis.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiel für einen erfolglosen Gel für die Gesamtaktivität. Das Gel wurde bei der Handhabung, wodurch sichtbare Lücken in Bänder gerissen. Beachten Sie, dass die Gel-Bands unregelmäßig geformt sind, Quantifizierung und Analyse erschwert.

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Discussion

Hier haben wir einen Test zur Charakterisierung der DNA-Polymerase-vermittelten Synthese von M-DNA beschrieben. Von Nah-Infrarot-beschrifteten DNA Zündkapseln und denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, um unterschiedlich große Oligonukleotide zu lösen, erhalten wir Einzel-Nukleotid-Auflösung auf Oligonukleotide, ermöglicht die präzise Messung der Synthese. Diese Ansätze können verwendet werden, um entweder die gesamte Aktivität des Enzyms (Abschnitt 2.1) messen oder die Michaelis-Menten-Parameter der einzelnen Schritte (Hinweis nach Schritt 2.1) zu messen. Unser Labor hat vor kurzem verwendet diese beide zuvor entwickelten Enzyme9 zu charakterisieren sowie Enzyme10rational konstruiert.

Unsere Tests hier beschriebenen unterscheiden sich von vorherigen Methoden bei der Nutzung eines nichtradioaktiven DNA-Labels. In der Vergangenheit wurde Radioaktivität zur DNA-Synthese aufgrund der hohen Sensitivität zu verfolgen, die mit radioaktivem Phosphor Etiketten11,18gewonnen werden können. Leider können die hohen Kosten der Entsorgung sowie die begrenzte Haltbarkeit von radioaktiven Etiketten die Verwendung von radioaktiven Etiketten unerschwinglich machen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Nah-Infrarot-Fluorophor gekennzeichnet DNA, die nicht von diesen Nachteilen leidet. Vor allem, mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffen sehen wir ähnliche Nachweisgrenzen, radioaktiv markierte DNA (unveröffentlichte Ergebnisse). Mit Fluoreszenz-Farbstoffen im sichtbaren Bereich waren wir nicht in der Lage, ähnliche Nachweisgrenzen (unveröffentlichte Ergebnisse) zu beobachten. Während unsere Gruppe in der Regel kommerziell hergestellte DNA mit Nahinfrarot-Fluorophore verwendet, sind diese Farbstoffe kompatibel mit einer Reihe von etablierten Post-Synthese 5' Änderung Chemikalien, die verwendet werden können, diese Etiketten anzubringen.

Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffen sind auch vorteilhaft, gibt es mehrere handelsübliche Farben, die komplexere Experimente ermöglichen können, die Synthese von zwei markierte Oligonukleotide in einem einzigen Experiment zu überwachen. Mit radioaktiven Etiketten sind diese Arten von Mehrkomponenten Experimente nicht leicht ausgeführt. Dies wird wahrscheinlich eine Reihe komplexer Experimente, vor allem für orthogonale Replikation Experimente ermöglichen.

Dieser Assay und jeder Assay mit denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, ist in erster Linie durch die technische Herausforderung für die Ausführung der Elektrophorese, die niedrigen Durchsatz von diesen Experimenten sowie die begrenzte Größe-Bereiche, die auf zu beobachten sind begrenzt Einzel-Nukleotid-Auflösung. Wir hoffen, dass dieses ausführliche Protokoll Gruppen ermöglicht, die technischen Herausforderungen dieser Assays zu überwinden. Vor allem während der Durchsatz des Tests ist die Begrenzung, steigt die Verwendung von Nah-Infrarot-Fluoreszenzmarkierungen den Durchsatz erfordert nicht die den Benutzer, eine Autoradiograph zu entwickeln. Allerdings dauert das Gel noch ca. 4-6 h zum Einrichten und ausführen, Begrenzung der Anzahl der Versuche, die pro Tag ausgeführt werden können. Die begrenzte Reichweite wird durch den elektrophoretischen Leistungsumfang Polyacrylamid verursacht. Praktisch gesprochen, diese Einschränkungen bedeuten, dass diese Tests sind am besten für fokussierte Forschungsfragen, die Einzel-Nukleotid-Auflösung erfordern.

Vor kurzem hat Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung19 zunehmend als eine Methode der Charakterisierung von DNA-Polymerasen20,21verwendet. Diese Tests sind bemerkenswert für ihre drastisch erhöhten Durchsatz, der allgemeinere Fragen konzentrierte sich auf Sequenz Verzerrungen und Fehler Spektren ermöglicht. Wichtig ist, während Hochdurchsatz-Sequenzierung viele parallele Experimente ermöglichen kann, kann es schwierig sein, um auf einer Einzel-Nukleotid-Basis zu interpretieren. Dies bietet eine spannende Möglichkeit für Enzym-Assays mit Polyacrylamid Gelelektrophorese, füllt die Lücken im Hochdurchsatz-Sequenzierung, um sicherzustellen, dass die in diesem Artikel beschriebenen Methoden für viele Jahre relevant sind.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Research Corporation für wissenschaftlichen Fortschritt (Cottrell College Scholar Award #22548) und TriLink Biotechnologien (ResearchReward Grant #G139) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

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References

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