Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

Biochemistry

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Summary

Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.

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Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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Abstract

Para cualquier enzima, robustos métodos cuantitativos son necesarios para la caracterización de las enzimas nativas y de ingeniería. Para polimerasas de la DNA, síntesis de ADN puede ser caracterizada mediante un en vitro síntesis análisis de ADN seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida. El objetivo de este análisis es cuantificar la síntesis de ADN natural y DNA modificado (M-DNA). Estos enfoques son particularmente útiles para la resolución de oligonucleótidos con la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación de pasos individuales durante la síntesis de oligonucleótidos enzimática. Estos métodos se han aplicado a la evaluación de una gran variedad de propiedades bioquímicas y biofísicas, como la medición de constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso de la síntesis de ADN, la tasa de error de la síntesis de ADN y la afinidad de unión de ADN. Mediante el uso de modificado componentes incluyendo pero no limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-ADN o mutantes polimerasas de la DNA, la utilidad relativa del sustrato-ADN polimerasa pares pueden evaluarse con eficacia. Detallamos aquí, el ensayo, incluyendo los cambios que deben realizarse para acomodar no tradicionales primer ADN etiquetado estrategias tales como la fluorescencia etiquetada ADN cerca de infrarrojo. Además, hemos detallado pasos técnicos cruciales para gel de acrilamida verter y correr, que puede a menudo ser un desafío técnico.

Introduction

Polimerasas de la DNA realizan precisa y eficiente la síntesis de ADN y son esenciales para mantener la integridad del genoma. La habilidad de sintetizar cientos de nucleótidos por segundo sin errores también hace herramientas esenciales de polimerasas de la DNA en biología molecular y biotecnología. Sin embargo, estas propiedades también limitan las aplicaciones de substratos DNA M; en términos generales, naturales polimerasas de la DNA no pueden sintetizar muchos sustratos potencialmente valiosos de M-DNA, probablemente debido a la alta presión selectiva contra la utilización de sustratos no estándar en vivo. Muchos grupos han desarrollado enfoques de evolución dirigida para generar mutantes polimerasas de la DNA capaces de M-DNA síntesis1a,2,3,4,5; estos esfuerzos han ampliado la utilidad biotecnológica de ADN6,7,8.

Para evaluar la capacidad del mutantes polimerasas de la DNA para sintetizar ADN M, tenemos9,10y otros11,12,13 suelen utilizar mediciones en vitro de ADN actividad de la polimerasa, que se describen en este manuscrito. En estos experimentos, polimerasas de la DNA son co incubados con una cartilla/plantilla etiqueta duplex y sustratos de trifosfato de nucleósido; los productos se evalúan por electroforesis en gel. Dependiendo de la pregunta experimental concreta, polimerasas de ADN mutantes, primers modificados, plantillas modificadas o los trifosfatos de nucleósidos modificados pueden utilizarse, permitiendo la evaluación bioquímica sistemática de la actividad de la enzima del mutante.

Históricamente, estos ensayos se han basado en una etiqueta radiactiva de 5' a la síntesis de ADN; por lo general, se han utilizado 32P y 33P; por lo general, etiquetado se consigue utilizando T4 Polinucleótido quinasa11. Sin embargo, debido a la vida finita y relativamente alto costo de las etiquetas radiactivas y su disposición segura, nuestro grupo utiliza en cambio un fluoróforo de infrarrojo cercano de sintético 5' etiquetado ADN. Utilizando a un toner de relativamente bajo costo de infrarrojo cercano de gel, hemos observado los límites de detección similares a estudios previos usando etiquetas radiactivas (resultados no publicados). Hemos reproducido con éxito más allá de observaciones9, y no hemos observado grandes diferencias cuantitativas con constantes de velocidad previamente medido (resultados no publicados).

Para analizar el tamaño del ADN y así, el grado de síntesis de ADN, contamos con métodos de electroforesis en gel de poliacrilamida desarrollados originalmente para secuenciación de Sanger14 antes de la llegada de electroforesis capilar15. La distancia de separación o de la movilidad puede ser utilizada como una medida del peso molecular; gran formato, geles verticales de poliacrilamida puede alcanzar la resolución de un solo nucleótido, que permite la observación cuantitativa de oligonucleótidos de ADN de diferentes longitudes.

Colectivamente, estos experimentos son un método robusto para la caracterización de la polimerasa. Debido al tiempo de naturaleza delicada de las reacciones, preparación y cuidado es necesario para lograr resultados reproducibles. Además, mientras que el gel de acrilamida es una forma altamente efectiva para medir la síntesis de ADN, así como numerosas otras DNA modificar reacciones, con la resolución de un solo nucleótido, puede ser un desafío técnico. Aquí el protocolo que permitirá a los usuarios para llevar a cabo estos experimentos evitando los errores más comunes.

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Protocol

1. ensayo de actividad

Nota: hay dos tipos típicos de ensayos que se ejecutan a menudo para caracterizar polimerasas de la DNA usando los métodos descritos aquí. Se diferencian en si caracterizan cualitativamente síntesis general (comprende muchos pasos de la síntesis de ADN) o si se centran cuantitativamente en pasos individuales. Describimos los pasos necesarios para cada uno de estos abajo.
Nota: Como el conjunto de materiales es relativamente complejo, para los experimentos sensibles tiempo, recomendamos que todos los materiales están montados previamente. Las recetas de todos los componentes críticos del ensayo son los siguientes. Proveedores comerciales de los componentes se enumeran en la Tabla de materiales.

  1. 10 x receta del almacenador intermediario de SF (10 x SFB)
    Nota: en nuestros análisis, utilizamos normalmente el truncamiento del N-terminal de la DNA polimerasa de Thermus aquaticus, comúnmente conocido como Stoffel fragmento (SF) 16 , 17. La receta aquí es el búfer preferido para SF 3 , 13. Se pueden sustituir otros almacenadores intermediarios dependiendo de la ADN polimerasa específica.
    Nota: La concentración final de 10 x componentes de búfer de SF son 500 mM Tris, pH 8.5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s) y agua ultrapura. Las medidas son de 1 mL de tampón de SF, que es suficiente para los ensayos de 100-200, dependiendo de la escala. El buffer puede ser almacenado indefinidamente a-20 ° C.
    1. Cosechadora 0,5 mL de 1 M Tris, 65 μl de 1 M de MgCl 2, 50 μl de BSA de 10 mg/mL y 0,0373 g de KCl (s) de 1,5 mL del tubo. Añadir 385 μl de agua ultrapura para llegar a un volumen final de 1 mL.
  2. receta de Buffer de almacenamiento de 1 x (1 x SB)
    Nota: la concentración final de 1 x componentes tampón son 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM TDT, 0,6 mM EDTA y glicerol al 50%. La receta es para 20 mL 1 x SB.
    1. 0,012 g TDT, 100 μl de EDTA de 0,5 M, se combinan y llenar un tubo cónico de 50 mL con 40 mL de 100 mM Tris (pH 7.5) para hacer 2xSB. Mezclar con un vórtex.
    2. Transferir 10 mL de SB 2 x tubo un nuevo cónico de 50 mL y diluir con glicerol agregando 10 mL glicerol el nuevo cónico.
  3. Receta del Temple buffer naranja (QBO)
    Nota: cuando se utilizan etiquetas radiactivas, los usuarios a menudo empleará azul de bromofenol o cyanol xileno como un tinte de seguimiento para el progreso de la electroforesis. Sin embargo, estos tintes se fluorescencia débil en la región del infrarrojo cercano, interfiriendo con la señal de ADN. Así, utilizamos G anaranjado en su lugar para todas las reacciones que contienen las muestras. Si bien hemos encontrado Orange G para ser convenientes para el seguimiento de la carga del gel, hemos encontrado Orange G para ser menos consistentes como un tinte que rastrea el progreso de la electroforesis; así, corremos carriles vacíos conteniendo bromofenol azul en los carriles externos del gel que contienen muestra para seguir el progreso de gel.
    1. Combinar 950 μl de formamida de 95% con 25 μl de EDTA de 0,5 M y 25 μl de agua ultrapura. Añadir 1 cucharada de colorante naranja de G (~ 10 mg). Mezclar con un vórtex.
      PRECAUCIÓN: La formamida es tóxica; usar equipo de protección personal (EPP) como guantes, gafas y bata de laboratorio y desechar como residuos peligrosos.

2. Ensayo de funcionamiento

  1. caracterización cualitativa de la actividad total
    Nota: para este ensayo, por lo general mantener constante la concentración de M-PNT y variar el tiempo. El objetivo es evaluar las características totales de la proteína en lugar de medir cualquier paso individual. Para preparar una reacción, un volumen igual de dos componentes separados, la mezcla de dos caras (descrito en el paso 2.1.1) y la mezcla de dNTP (descrito en el paso 2.1.2), preparado por separado y luego se combinan para dar el volumen final de 49 μl. La adición de la enzima de x 50 μL 1 entonces iniciará la reacción. Pueden tener puntos de tiempo variable; por lo general, apagan en 0, 5, 15 y 60 min.
    1. Preparación de DNA duplex mix
      Nota: la mezcla de dos caras se compone de 10 x buffer de SF, oligonucleótido cebador, oligonucleótidos de plantilla y agua ultrapura. Volumen total añadido a cada reacción es de 25 μl. 1 μl de enzima se añadirán a la mezcla principal inmediatamente anteriores a la iniciación del experimento.
      Nota: Para nuestros ensayos, suelen utilizar una plantilla de 45-mer y una cartilla de mer 18 o 23-mer. Si bien puede utilizarse un número de diversas longitudes, tendemos a usar este porque los productos (que van de 18 nucleótidos a 45 nucleótidos) se resuelven fácilmente en un nivel de un solo nucleótido utilizando los protocolos de la electroforesis de gel descrito. Como productos de oligonucleótidos aumentar en longitud, puede ser un desafío para resolver los productos en la resolución de un solo nucleótido.
      Nota: En nuestros experimentos, utilizamos un 5 ' etiqueta colorante fluorescente cerca infrarrojo sobre el filamento de la cartilla para observar los productos de cartilla. Compramos oligonucleótidos sintetizados personalizados teniendo esta modificación; sin embargo, esta etiqueta se puede incorporar usando cualquier número de estrategias Etiquetadoras posterior sintéticas. El oligonucleótido de plantilla no está etiquetado y por lo tanto no se observa usando el reproductor de imágenes de gel. Para ambos oligonucleótidos, almacenamos los oligonucleótidos en 100 μm a 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      Nota: Porque estamos observando sólo la cartilla, un doble exceso de plantilla se utiliza para asegurar que los cebadores (el especie de DNA que está siendo observada) son recocidos a la plantilla. La concentración final de dos caras en esta reacción es de 40 nM.
      Nota: Tintes fluorescentes infrarrojo cercano son a menudo sensibles a la luz algo; cuando sea posible, cubrimos el primer (y cualquier solución que contiene la cartilla) con papel de aluminio. Esto incluye el gel de poliacrilamida mientras se está ejecutando.
      Nota: A continuación es un ejemplo representativo de la síntesis de 2 ' F M-ADN.
      1. Diluir la cartilla 1 y plantilla 1 (véase Tabla de materiales de secuencia) a 1 μm en agua ultrapura.
      2. Para cada reacción de ensayo en tubos separados, combinar 5 μl de 10 x buffer de SF, 2 μl de 1 μm la cartilla 1, 4 μL de 1 μm plantilla 1 y 13 μl de agua ultrapura en tubos compatibles con un termociclador de.
      3. Recocido dúplex en un termociclador con el siguiente programa: 98 ° C por 2 min, 70 º C durante 5 min, 50 º C durante 5 minutos, 40 ° C por 5 min, mantener a 25 ° C. El programa específico puede variar dependiendo de la temperatura de recocido de la cartilla/plantilla de dos caras. Por lo general, preferimos incluir al menos un paso de 5 min a la temperatura de recocido y luego otro paso de 5 minutos a una temperatura 5-10 grados por debajo de la temperatura de recocido.
    2. Preparación de la mezcla de x dNTP 2
      Nota: según el experimento, es posible utilizar variables dNTPs y concentraciones de dNTPs. Por lo general, usamos 50-200 μm en la reacción.
      1. Preparar una solución de 25 μl que contiene 100 μm de cada 2 ' F-NTP. Almacenar el PNT M en 100 mM.
    3. Preparación de 50 x dilución de proteína
      Nota: para almacenamiento a largo plazo, las enzimas deben ser mantenidas a-20 ° C en 1xSB. Al retirar del congelador de-20 ° C, las enzimas deben mantenerse en hielo en todo momento antes de la adición a la mezcla principal. Diluciones de enzima deben hacerse desde el caldo concentrado cada día. La acción de la enzima concentrada debe ser devuelto al congelador de-20 ° C inmediatamente después del uso.
      Nota: Porque evaluar principalmente polimerasas de ADN mutantes, utilizamos solamente las enzimas que se han expresado y purificado en nuestro laboratorio utilizando métodos establecidos 9 , 10. Para polimerasas comercialmente comprados, los usuarios deben ser de óptima tampones para diversas proteínas y su compatibilidad con los buffers descritos.
      Nota: Las concentraciones de la enzima varía para cada experimento. A continuación, os mostramos un ejemplo representativo para 2 ' la síntesis de ADN F.
      1. Para hacer una solución de enzima 10 nM, diluya 1 μl de enzima into 1 x SB hacer una concentración de la enzima final de 50 x. La concentración de la solución 50 x debe ser de 500 nM. Por ejemplo, si la concentración de enzima común es de 50 μm, añadir enzima valores de 1 μl a 99 μL 1 x código
        Nota: Puesto que la enzima se almacena típicamente en glicerol al 50%, la solución es bastante viscosa. Incluso si está usando pipetas de alta precisión, no recomendamos pipeteo menos de 0.5 μl, considerando la importancia de la exactitud y precisión durante la dilución enzimática.
    4. Inicio de ensayo
      1. ajustar la temperatura de un baño seco a 50 º C.
      2. Añadir 24 μl de recocido duplex mezcla (ver paso 2.1.1) a 25 μl de 2 x dNTPs (ver paso 2.1.2).
      3. Saque 9.8 μl de la mezcla en paso 2.1.4.2 y añadir 20 μl de QBO (véase la sección 1.3 para la receta). Esta alícuota se sirve como una " ninguna enzima " controlar y debe obtenerse para cada serie.
      4. Añadir 0,8 μl de enzima x 50 (ver paso 2.1.3.1) a la mezcla de dNTP/duplex. Pipetee hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de gran volumen para mezclar bien.
      5. Después de 5, 15 y 60 min, apagar la reacción quitando 10 μl de cada solución de reacción y agregar a un tubo de microcentrífuga conteniendo 20 μl QBO (descrito en la sección 1.3).
      6. Una vez saciada, reacciones pueden almacenarse en papel indefinidamente a 4 ° C o -20 ° C.
        Nota: Para la caracterización cuantitativa de cada paso de la síntesis de ADN M, puede ejecutar un análisis muy similar para obtener cuantitativamente parámetros de Michaelis-Menten. Este ensayo utiliza todos los materiales de la misma. Parámetros de Michaelis-Menten se pueden medir por la dNTP; en este caso, la diferencia más significativa es, en lugar de agregar la mezcla de dos caras a la mezcla de dNTP, agrega la mezcla de dos caras con la enzima a una serie de soluciones de x dNTP 2. Del mismo modo, se pueden medir parámetros de Michaelis-Menten para duplex de ADN. Condiciones deben cumplirse para satisfacer los supuestos necesarios para utilizar la ecuación de Michaelis-Menten. Estas condiciones y la mecánica básica del ensayo, se explica bien en un anterior métodos artículo 11.

3. Electrophoresis del gel del

Nota: debido a verter el gel es urgentes, todos los materiales están montados previamente. Las recetas de todos los componentes críticos del ensayo son los siguientes; proveedores están listados en la Tabla de materiales.

  1. Preparación de acrilamida para gel de acrilamida de 20%.
    Nota: Esta receta es para 1 L de mezcla de acrilamida; aproximadamente 120 mL de esta solución es utilizado por gel. Almacenar esta solución a temperatura ambiente bajo papel hasta por un año.
    PRECAUCIÓN: Poliacrilamida es neurotóxica. Es importante usar guantes y una bata de laboratorio durante todas las etapas de verter el gel. Si poliacrilamida entra en guantes, reemplazar inmediatamente los guantes. Si la acrilamida no se polimeriza, colocar el material contaminado en una bolsa de residuos de poliacrilamida etiquetados.
    Nota: La acrilamida 40% premezclado con 38.67% de acrilamida y bis-acrilamida de 1.33% para un monómero relación vinculante de 29: 1 fue utilizada en este protocolo.
    1. Peso 17 g de polvo premezclado de TBE. Pesa seis porciones separadas de 70 g de urea (un total de 420 g).
      Nota: La urea se debe agregar en porciones. Nos resulta mejor dividir en seis partes.
    2. Configurar un vaso plástico de 2 L en una placa de agitación. Añadir una sola varilla grandes en el vaso. Cubrir el vaso con papel de aluminio cuando se mezcla para evitar salpicaduras.
    3. Agregar 500 mL de solución de acrilamida del 40% en el vaso. Asegúrese de que está revolviendo la solución.
    4. Agregar previamente pesado a TBE. Añadir una alícuota de la urea. Deje que la solución de la mezcla. Urea se disuelve lentamente y puede aparecer borroso y blanco sobre la suma inicial. Agregue lentamente las restantes alícuotas de urea en la mezcla durante la hora siguiente. Deje que la solución de la mezcla hasta que esté completamente transparente e incoloro.
      Nota: Por lo general, ello revolver durante la noche. Si la solución es todavía no disuelta, añadir pequeñas alícuotas de agua y esperar a que la urea disolver.
    5. La adición de urea aumentará el volumen cerca de 1 L. Agregue agua para aumentar el volumen a exactamente 1 L.
    6. Tienda en una botella de vidrio teñido de 1 L o tapa de la botella de vidrio con papel de aluminio.
  2. Colada del gel de acrilamida.
    Nota: Al manipular las placas de vidrio, tenga cuidado para evitar el contacto entre las placas de vidrio y cualquier superficie dura. Esto es especialmente importante que una manipulación descuidada puede provocar pequeñas grietas en el cristal; Estas fisuras pueden no ser visibles hasta que el gel se está ejecutando, que ocurre a una temperatura superior. Usamos anillos de corcho para evitar que este contacto no deseado.
    1. Limpio placas placas de gel
      1. adquirir dos de 33 x 42 cm, una muesca y una placa sin muescas. Coloque las placas en anillos de corcho separado.
      2. Placas de enjuague con agua y jabón. Asegúrese de que no hay manchas de jabón o gel manchas dejados.
      3. Tome nota de qué lado de los granos de la placa menos agua. Este lado es el gel hacia lado.
        Nota: Si el gel se ejecuta en el otro lado de la placa, puede hacer la transferencia de gel desafiante.
    2. Seco placas
      1. Use toallas de papel para secar ambas caras de cada placa.
      2. Limpiaparabrisas de tarea delicada de uso para secar áreas restantes. Preste especial atención a los bordes de las placas donde se aplicará cinta.
      3. Las placas de vidrio con etanol de ~ 70% de enjuague y limpie con limpiadores de tarea.
      4. Asegúrese de que no hay las fibras del papel toalla o gotitas de agua. Estos pueden causar burbujas al verter el gel de.
    3. Añadir espaciadores
      1. adquirir separadores de 0,75 mm. Ejecutar los dedos enguantados bajo el agua DI y suavemente mojado los distanciadores con los dedos enguantados.
      2. Separadores de lugar a lo largo de los bordes laterales de la muesca de la placa. Limpiar agua que salpicó en el resto de las placas. Asegúrese de que los espaciadores están alineados con la placa de vidrio y colgando sobre el borde no.
    4. Sello del gel
      1. Colóquese guantes secos. Seque los bordes del vidrio nuevo con limpiaparabrisas tarea delicada.
      2. Alinee la placa superior encima de la placa dentada y lentamente baja hacia abajo para presionar las placas entre sí. Revise otra vez para asegurarse de que estén alineados los bordes de las placas de todos.
      3. Usando gel cinta, coloque la cinta en todos los bordes excepto en la parte superior. Asegúrese de cinta está alineada de manera uniforme y sellada firmemente. Cinta puede ser aplicada en un solo movimiento, o cada lado se puede hacer individualmente. Cortar los extremos de la cinta con una navaja de afeitar.
      4. Añadir una capa adicional de la cinta a la parte inferior del gel. La más estricta la cinta, el menos probable que el gel se escapará al verter.
      5. Clip de los lados del sandwich de cristal con las pinzas blancas. Agregue 3 clips a cada lado y 4 clips en el fondo.
    5. Verter el gel
      1. hacer 3 mL de solución de persulfato de amonio 10% (APS) disolviendo 0,3 g persulfato de amonio y diluir en agua ultrapura hasta 3 mL.
        Nota: 1,2 mL de APS es necesario por gel. Fecha el tubo después de lo que es. Solución APS caduca dentro de 2 semanas y debe mantenerse a 4 ° C.
      2. Transferencia de 125 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED) a un tubo de microcentrífuga separado.
        Nota: TEMED es tóxica; usar EPP como guantes, anteojos y laboratorio de la capa cuando maneje.
      3. Adquirir un frasco rociador y retire el embudo acentuado. Medir 125 mL de agua en una probeta graduada y añadir a la botella. Marque el nivel del agua en el exterior de la botella con un marcador permanente. Deseche el agua. Esta botella de squirt modificado puede ser reutilizada indefinidamente con limpieza adecuada (véase abajo).
      4. Establecer los anillos tapadas con corcho al lado del fregadero hay un lugar para poner el gel una vez que se vierte. Coloque el sandwich de la placa aquí. Poner un tapón en el fregadero hay un lugar para sentarse las placas mientras se vierte el gel. El gel se vierte en el sandwich de la placa de vidrio en un ángulo, por lo que la parte inferior descansará sobre el corcho, mientras que la parte superior se apoyará en el borde del fregadero. Asegúrese de que hay cojines por debajo de estas áreas en el caso de poliacrilamida vierte apagado
      5. Solución de
      6. lugar APS y TEMED al otro lado de la pileta, con el vacío botella con pulverizador. Coloque el peine bien con el número deseado de pocillos en el lado del fregadero con las placas. Poner 4 abrazaderas cerca.
        Nota: El siguiente paso en el procedimiento es tiempo muy sensible. Esté preparado para moverse rápidamente a través de estos pasos. Hay una cantidad limitada de tiempo para conseguir la mezcla entre las placas antes de se polimeriza. Todos los componentes (Micropipetas preestablecidos con el volumen correcto, soluciones, placas de vidrio) se arreglan cuidadosamente verter el gel lo antes posible. Si se desea una polimerización más lenta, pueden reducirse a la mitad las concentraciones de APS y TEMED; Esto, sin embargo, requerirá un tiempo de polimerización.
      7. Verter la solución del gel de acrilamida de 20% en la botella de squirt al punto marcado. Vierta la solución en gel un poco más arriba de la línea marcada, así que hay suficiente solución en el caso de pequeñas fugas. Esto es aproximadamente 120 mL de gel solución.
      8. Añadir 120 μl de TEMED y 600 μl de APS en la solución de poliacrilamida gel en la botella de squirt al mismo tiempo. Agregar rápidamente un adicional 600 μl de APS a la solución del gel de poliacrilamida.
      9. Tapa rápidamente el frasco rociador y remolino. Coloque el sandwich de la placa en el fregadero.
      10. Empezar a verter. Esto debe tomar solamente 1-2 min para evitar la polimerización. Lento, pero constante, añada presión a la botella de squirt para que la solución de gel sale uniformemente. Si la solución comienza a salpicaduras irregular de la botella de squirt, liberar la presión para que la botella llega a ser hinchada y volver a verter. Reloj para asegurarse de que la solución de gel cubre todas las áreas, y no hay fugas de cualquiera de los lados. Para quitar las burbujas de aire, cambiar el ángulo de las placas. Las burbujas aparecerá en la parte superior y funcionará más rápido si el ángulo es más pronunciado. Continuar vertiendo hasta que la solución ha llegado a la parte superior de la zona dentada y ligeramente está desbordando el borde dentado. Eliminar todas las burbujas de aire.
        Nota: Si el sandwich de la placa hay una fuga, o no es suficiente solución de gel y la solución no llega a la parte superior de las placas, no se puede utilizar el gel. Espere hasta que el gel ha polimerizado y limpiar por consiguiente.
      11. Añadir el peine bien al sandwich de la placa. Colocar 4 abrazaderas en el peine de apretar y permitir la distribución uniforme de los pozos de.
      12. Rápidamente deseche la solución restante del gel en la botella de squirt en residuos de poliacrilamida etiquetados. Enjuagar el frasco rociador con DI agua 2 - 3 veces, a través de la boquilla del chorro de salida.
        Nota: Es importante realizar esta limpieza rápidamente para impedir la obstrucción en la botella de squirt de poliacrilamida. Si incluso una pequeña cantidad de polimerización ocurre dentro de la boquilla, el siguiente gel se vierte muy lentamente y no con éxito. Deseche el frasco rociador si se produce polimerización.
  3. Corriendo el gel de acrilamida
    1. mientras que el gel es ser polimerizado, hacer 1 buffer de corriente x TBE. Disolver 17 g de sólido premezclado TBE en 1 L de agua ultrapura. Agitar búfer hasta que se disuelva todo de TBE.
    2. Quitar todos los clips de la carpeta del sandwich de la placa.
    3. Utilizar una maquinilla de afeitar para cortar la cinta y quite la cinta de los bordes del sándwich placa.
    4. Clean off gel polimerizado de las superficies de vidrio. Utilice un producto a lo largo de los bordes para raspar el gel restante. Limpie las placas con agua para quitar la mayor cantidad posible de residuos de poliacrilamida y toallas de papel. Acrilamida exceso o cinta a menudo puede quemar durante la electroforesis en gel de.
    5. Quitar el peine bien empujando hacia fuera uniformemente en ambos lados.
    6. Utilizar una maquinilla de afeitar para cortar el exceso gel a lo largo de la parte superior de lo sandwich de la placa. Corte el borde con muescas de la placa de.
    7. Use una jeringa y agua desionizada para enjuagar los pozos y eliminar la suciedad en los pocillos. Asegúrese de que cada pozo puede ser llenado con agua y no se bloquea por exceso gel polimerizado.
    8. Coloque el sandwich de la placa en el aparato, para que la placa más larga quede hacia afuera, y el espacio con muescas es mirando hacia el interior.
    9. Agregar clips a la placa de emparedado y aluminio junto con el aparato. Añadir a la parte exterior de la placa para promover incluso ejecutando.
    10. Tampón TBE añadir para cubrir las ranuras de la base y lo suficiente para cubrir los pozos en la parte superior. Almacenador intermediario TBE puede ser filtrada y reutilizado para geles de aproximadamente 5.
    11. Placas calientes para 20 min de correr la electroforesis en gel de 50 w.
    12. Después de calentar los platos, limpiar los pozos. Utilice una jeringa y el buffer TBE en los baños a chorros las restantes sales de buffer de los pozos. Hacer este varias veces para limpiarlos pozos. Si los pozos no están limpios, las bandas se debilite y la imagen no será interpretable. Aunque esto puede ser desperdiciador de tiempo, nos hemos encontrado imprescindible para obtener buenos datos.
    13. En el carril exterior en ambos lados, pipeta de 5 μl de formamida de 95% con azul de bromofenol. Esta es la misma solución como QBO, pero con el bromofenol azul en lugar de G. naranja Esto proporcionará un visual en donde cortar el gel para la proyección de imagen y hasta qué punto el ADN ha corrido.
    14. Para cada muestra a analizar (generado en la sección 2.1.1), agregar 3 μl a un único pozo del gel. Después de cargar las muestras, esperar 1 minuto para las muestras a.
    15. Ponga tapas de baños de plástico superior e inferior. Conectar los cables al aparato. Rojo indica que la carga eléctrica positiva, por lo que debe ser en la parte inferior para que el ADN funciona hacia abajo.
    16. Conecte los cables a un poder de origen y establece en 50-55 W. funciona el gel durante aproximadamente 3 horas o hasta el bromofenol frente blue dye ha ejecutado por lo menos 2/3 abajo el gel de.
  4. Proyección de imagen el gel
    Nota: este gel es extremadamente fino y puede ser difícil de manejar. Gran precaución se debe evitar la Ripeo y pérdida del gel todo.
    Nota: dependiendo de la etiqueta de ADN, requieran usar toner de gel de diferentes. Este protocolo utiliza tintes fluorescentes de infrarrojo cercano y la proyección de imagen de las muestras fue realizada en un formador de gel (véase Tabla de materiales). El protocolo está escrito específicamente para esa imager.
    1. Cuando ha quedado al frente de tinte de azul de bromofenol al menos 2/3 abajo el gel (~ 28 cm), el gel se puede detener desactivando la energía. Retirar el gel del aparato y lugar en los anillos de corcho en.
    2. Separar las placas con un separador de placa pequeña cuña. Coloque el separador en el interior rincón de las muescas para tirar para arriba. Tenga cuidado y no use fuerza excesiva; las muescas pueden romperse si se aplica demasiada presión.
    3. Una vez que se liberan la succión entre las placas, con cuidado levante la placa superior y determinar que el gel está en la placa. Si el gel se pega sobre la placa inferior, sacar la placa superior y coloque el anillo de corcho. Si el gel está en la placa superior se levanta, se mueven lentamente y el gel puede recurrir a la placa inferior. Si el gel no se caiga, otra vez se mueven lentamente y tire de la parte restante del gel de la placa inferior y coloque la placa superior con el gel en un anillo de corcho separado.
    4. Una vez que las placas se separan, ver dónde está el tinte en el gel y eliminar gel sobrante de la parte superior e inferior del gel. Por lo general, nuestras construcciones, no utilizando un primer nucleótido 18 o 23 y una plantilla de 45 nucleótido, hay ninguna DNA entre el frente de colorante azul de bromofenol y la parte inferior del gel. Corte vertical de la tintura a la parte superior del gel. Los espacios entre el tinte y los bordes del gel también no tienen ninguna DNA. Por último, cortar un par de pulgadas por debajo el espacio bien en el gel. No hay los ácidos nucleicos en la parte superior del gel.
      Nota: Cortar el gel en el posible más pequeño de tamaño es significativamente más fácil de transferir a dispositivo del imagen. Si el gel es demasiado grande, es más susceptible a la extracción durante la transferencia. Mientras que a menudo nos recorte el gel antes de la proyección de imagen, recomendamos extrema precaución al podar como datos relevantes se puede perder si no se tiene cuidado. Para comprobar si quitar porciones contienen datos adicionales, a menudo realizamos una exploración adicional de las porciones suprimidas del gel para asegurarse de que no hay datos se perdieron.
    5. Cubrir el gel con agua para evitar que se sequen.
    6. Limpiar la superficie del sensor. Usar limpiadores de tarea, limpiar la superficie con agua y etanol. Añadir una capa fina de agua a la superficie donde se colocará el gel de.
    7. Transferir la porción de gel a la superficie mojada de la Li-Cor.
    8. Quitar aire burbujas suavemente presionando hacia fuera del gel y limpiar con un limpiador de tarea. Tenga cuidado ya que es muy fácil de extraer el gel empujando las burbujas de aire muy duro.
    9. La imagen el gel según el fabricante ' protocolos de s. Analizar el gel utilizando el software disponible para el reproductor de imágenes.
    10. Mientras el gel está siendo fotografiado, limpiar el espacio de trabajo quitando gel de acrilamida exceso, lavar las placas y filtrado el buffer TBE para ser reutilizado.

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Representative Results

Se muestran un análisis de gel de poliacrilamida al éxito de una caracterización cualitativa de la actividad total (descrito en la sección 2.1, figura 1) y de la cinética de estado estacionario (descrito en la nota final de la sección 2.1, figura 2). Un análisis de gel de poliacrilamida al fracasado también se muestra (figura 3).

Tenga en cuenta que ninguna escalera disponible comercialmente o marcador molecular se utiliza. De vez en cuando, usamos una combinación de sustrato-polimerasa conocida para crear un marcador molecular; sin embargo, es importante tener en cuenta que los diferentes nucleótidos modificados tienen muy diferentes movilidades electroforéticas, haciendo comparación de los oligonucleótidos de la misma longitud pero diferente estructura de nucleótido inadecuado.

Figure 1
Figura 1: ejemplo de análisis de gel de poliacrilamida al éxito de una caracterización cualitativa de la actividad general. Tenga en cuenta que las bandas individuales son bien definidos y regulares. Las bandas representan oligonucleótidos de diferente longitud; Este gel permite la comparación fácil entre polimerasas. El ningún carril de control de enzima se indica con un "-". Actividad se considera por tanto la longitud de los productos y la porción del primer etiquetado que se convierte en productos más grandes. De este análisis, E6 y E5 son los más activos. E3 y E2 son aproximadamente iguales en la actividad, pero menos que E6 o E5, y E4 y E1 son las enzimas menos activas.

Figure 2
Figura 2: ejemplo de gel exitoso para el análisis cuantitativo mediante cinética de estado constante. Tenga en cuenta que las bandas están bien resuelto y bien definidas. Para medir las constantes de velocidad de estado estacionario de cada paso en la síntesis del oligonucleótido, se incuba una enzima con diferentes cantidades de trifosfato de nucleósido (en este caso, dCTP); Tenga en cuenta que sólo la n y (n + 1) productos se sintetizan lo que permite la cuantificación del singular evento.

Figure 3
Figura 3: ejemplo de un gel sin éxito para el conjunto de la actividad. El gel fue rasgado durante la manipulación, resultando visibles huecos en las bandas. Tenga en cuenta que las bandas de gel son de forma irregular, haciendo difícil la cuantificación y análisis.

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Discussion

Aquí, hemos descrito un ensayo para caracterizar la síntesis mediada por la ADN polimerasa de la DNA de M. Utilizando cebadores de ADN etiquetados infrarrojo cercano, y usando electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización para resolver diverso tamaño de oligonucleótidos, podemos obtener la resolución de un solo nucleótido en oligonucleótidos, permitiendo una medición precisa de la síntesis. Estos enfoques se pueden utilizar para medir ya sea el conjunto de la actividad de la enzima (sección 2.1) o para medir los parámetros de Michaelis-Menten de pasos individuales (nota siguiente paso 2.1). Nuestro laboratorio ha utilizado recientemente que tanto caracterizan enzimas previamente evolucionada9 como racionalmente diseñado enzimas10.

Nuestros ensayos aquí descritos difieren de los métodos anteriores en su uso de una etiqueta de DNA no radioactivo. Históricamente, radiactividad se ha utilizado para rastrear la síntesis de ADN debido a la alta sensibilidad que puede obtenerse utilizando etiquetas de fósforo radiactivo11,18. Desafortunadamente, el alto costo de la disposición, así como la limitada vida útil de las etiquetas radiactivas puede hacer el uso de etiquetas radiactivas prohibitivo. Aquí, describimos el uso de infrarrojo cercano fluoróforo etiquetado ADN, que no sufren de estos inconvenientes. En particular, con tintes fluorescentes infrarrojo cercano vemos los límites de detección similar al ADN marcado radiactivamente (resultados no publicados). Sin embargo, con los tintes fluorescentes en la gama visible, no pudimos observar los límites de detección similares (resultados no publicados). Mientras que nuestro grupo utiliza típicamente DNA preparado comercialmente con fluoróforos de infrarrojo cercano, estos tintes son compatibles con un número de establecido después de la síntesis 5' modificación análisis bioquímico que puede utilizarse para instalar estas etiquetas.

Tintes fluorescentes infrarroja también son ventajosos en que hay varios colores disponibles en el mercado, que permiten experimentos más complejos que controlan la síntesis de dos oligonucleótidos marcados en un solo experimento. Con las etiquetas de radiactivas, estos tipos de experimentos múltiples componentes no se ejecutan fácilmente. Es probable que esto le permitirá a una serie de experimentos más complejos, particularmente para los experimentos de replicación ortogonal.

Este ensayo y cualquier análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de desnaturalización, está limitado principalmente por el desafío técnico de la ejecución de la electroforesis, el bajo rendimiento de estos experimentos, así como los rangos de tamaño limitado que son observables en el resolución de un solo nucleótido. Esperamos que este protocolo detallado permite a los grupos superar los retos técnicos de estos ensayos. En particular, mientras que limita el rendimiento del ensayo, el uso de etiquetas fluorescentes infrarroja aumentar el rendimiento, como no requiere el usuario desarrollar un autoradiograph. Sin embargo, el gel todavía toma aproximadamente 4-6 h para establecer y ejecutar, limitar el número de experimentos que se pueden ejecutar por día. La gama limitada es causada por las capacidades de electroforesis de poliacrilamida. Prácticamente hablando, estas limitaciones significan que estos ensayos son los mejores para las preguntas de investigación que requieren la resolución de un solo nucleótido.

Recientemente, alto rendimiento de secuenciación de ADN19 se ha utilizado cada vez más como un método de caracterización de ADN polimerasas20,21. Estos ensayos destacan por su rendimiento notablemente mayor, que permite preguntas más amplio centrados en espectros de errores y sesgos de la secuencia. Lo importante, mientras que la secuenciación de alto rendimiento permite muchos experimentos paralelos, puede ser difícil interpretar de forma de un solo nucleótido. Esto proporciona una oportunidad para pruebas enzimáticas utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida a llenar los vacíos en la secuenciación de alto rendimiento, asegurando que los métodos descritos en este artículo son relevantes para muchos años.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Corporación de investigación para el progreso científico (Cottrell Colegio académico Premio #22548) y biotecnologías TriLink (ResearchReward beca #G139).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

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References

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