교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

Bioengineering

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Summary

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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Abstract

멀티플렉스 단백질 분석 우수한 진단 민감도 단일 단백질에 비해 정확도 보이고 있다. 항 체 microarrays는 단일 칩에 동시에 수행 하는 마이크로 스케일 immunoassays의 수천 수 있습니다. 샌드위치 분석 결과 형식 두 항 체, 각 목표를 감지 하 여 분석 결과 특이성을 향상 하지만 분 따라서 그들의 멀티플렉싱 기능을 제한 하는 시 약 사이에서 겪고 있다. 항 체 colocalization microarray (ACM) 교차 reactivity 무료 다중화 단백질 검출에 대 한 개발 되었습니다 하지만 microarray 제조 분석 실험 중에 비싼 반점을 찍는 현장. 이 작품에서는 단순히 맞춤 2 칩 함께, 따라서 아무 정찰 병 샘플 인큐베이션 및 탐지 항 체 (dAbs) 시의 후속 응용 프로그램 필요에 의해 microarray microarray에서 시 약을 전송 하는 스냅 칩 기술 시연 미리 발견된 슬라이드, 슬라이드 준비 분석 결과 실행에서 해리의 스토리지. 두 메서드 모두 단일 및 이중 전송 두 microarrays 사이 정확한 줄 맞춤을 달성 하기 위해 제공 됩니다 그리고 두 방법에 대 한 슬라이드 제작 설명. 결과 < 40 μ m 맞춤 이중 전송, 625 명소/c m2의 배열 밀도 도달 달성 되었습니다. 50 plexed immunoassay 다중화 단백질 분석에 스냅 칩의 유용성을 설명 하기 위해 실시 되었습니다. 35 단백질의 검출 한계 범위의 pg/ml에서는 이다입니다.

Introduction

높은 감도 특이성 암1,2등 복잡 한 질병의 진단에 단일 바이오 마커 보다 여러 단백질을 구성 하는 바이오 마커의 패널 제공할 수 있습니다. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 골드 표준 기술 플라즈마, 낮은 pg/mL에 탐지의 제한 하지만 분석 결과3,,45당 하나의 대상에 한계를 달성 하는 임상 실험실에서 사용 되었습니다. 항 체 microarrays는 단일 현미경 슬라이드6,,78에 병렬로 실시 소형된 분석 실험의 수천을 수용에 대 한 개발 되었습니다. 그러나,이 방법의 멀티플렉싱 기능 dAbs, 혼합물의 응용 프로그램에서 발생 하는 시 약 기반 분으로 제한 하 고 대상9,10 의 증가 함께 더 많은 문제가 된다 , 11. Pla . 다중 샌드위치 분석 실험의 결과 취약점 확장 4N(N-1)로 N은 대상12의 수 명시 된 있다.

항 체 microarrays 항 체 colocalization microarray에에서 분 완화 (ACM) 멀티플렉스 샌드위치 분석 결과12에 대 한 우리의 실험실에서 개발 되었습니다. 캡처 항 체 (택시) microarray 정찰 병으로 기판에 발견 됩니다. 차단 샘플 표면에 적용 된 다음 개별 dAbs 택시-항 원 복합체와 같은 명소에 발견 후에. 항 체와 항 원 간의 모든 분 시나리오 ACM, 함께 완화 될 수 있습니다 그리고 pg/mL에 탐지의 한계 달성 되었습니다. 그러나 준비 하 고 비싸고 시간이 소모 되는 정렬 목적에 대 한 높은 정밀도 함께 현장 microarray 정찰 병을 사용 하 여,이 넓은 응용 프로그램 제한 실험 동안에 dAbs 안보 분석 결과 프로토콜에서 요구 하는, 다른 실험실입니다. 스냅 칩 라는 휴대용 ACM 개발 되었습니다 교차 reactivity 무료 고 샌드위치 immunoassays13,,1415다중화 정찰 병 무료. 택시와 dAbs는 사전 분석 결과 슬라이드와 microarray 형태로 각각 전송 슬라이드에 발견 하 고 저장. 분석 결과, 동안 슬라이드를 검색 하 고 dAbs microarray 단순히 함께 두 개의 칩을 스냅 하 여 분석 결과 슬라이드에 집단적으로 전송 됩니다. 스냅인 장치는 신뢰할 수 있는 시 약 전송을 위해 사용 됩니다. 그러나 니트로 코팅 슬라이드는 비교적 큰 항 체 바인딩 용량 액체 작은 물방울을 흡수 분석 결과 슬라이드로 사용 되 고 전송 시 약을 촉진,, 슬라이드는 더 비싼 보다 일반 유리 슬라이드와 microarray 비-투명 슬라이드와 호환 스캐너 신호 수집 필요 합니다.

이 작품에서 스냅 칩 다중 샌드위치 immunoassay 수행 프로토콜을 설명 합니다. 새로운 스냅인 장치 microarray microarray에서 보다 편리 하 고 믿을 수 있는 시 약 전송을 위해 개발 되었습니다. 중요 한 것은, 여기 우리가 시 전송 방법 스냅 칩 일반 유리 슬라이드에 설립 했다. 1024 명소 했다 성공적으로 전송 되 고 크게 확대 대부분 실험실에서이 기술 사용 하 여 유리 슬라이드에 정렬 됩니다.

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Protocol

1. 스냅 칩 제조 및 저장

  1. 이전 방법 ( 그림 1a)
    1. 자리 cAb 솔루션 400 µ g/mL 항 체를 포함 하 고 20% 글리세롤 인산 염 버퍼 염 분에 (PBS)을 nitrocellulose (또는 기능성된 유리)에는 잉크젯 microarray 정찰 병 13 60%의 상대 습도에서 분석 결과 슬라이드 (1.2 각 명소에 대 한 nL) 800 µ m 센터-센터 간격. 슬라이드 한 구석에 따르면 정찰 병 갑판에 고정 되어 있는지 확인 (여기, 왼쪽 아래 사용 되었다).
    2. 60%의 상대 습도와 1 시간 실 온에서 발견된 분석 결과 슬라이드를 품 어.
    3. 클램프 16 구획 16 우물으로 그것을 분할 하는 분석 결과 슬라이드에 슬라이드 모듈 가스 켓. 0.1%를 포함 하는 PBS의 80 µ L을 추가 하 여 슬라이드 세 번 씻어 트윈-20 (PBST) 각 잘 떨고 통, 5 분 각 시간에 450 rpm으로.
    4. 차단 솔루션을 각각 잘 고 450 rpm에서 1 h에 대 한 동요의 추가 80 µ L.
    5. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소의 스트림 분석 결과 슬라이드.
    6. 정찰 병 갑판에 전송 슬라이드를 해결 하 고 정찰 병 갑판의 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 슬라이드의 왼쪽 아래를 밀어. 잉크젯 택시에 대 한 것과 동일한 레이아웃으로 정렬 표시 (폴리스 티 렌 마이크로-비즈 솔루션)의 배열을 자리.
    7. 건조 맞춤 표시 하자. 이전 슬라이드를 대칭 이동 하 고 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 고정 정찰 병 갑판에 그것을 다시 넣어.
    8. 20 µ g/mL 항 체, 20% 글리세롤과 1 %BSA 포함 하는 솔루션을 발견 하는 소량 준비.
    9. 는 정찰 병을 사용 하 여 ' s 카메라, 맞춤 마크의 사진을. 이 그림을 표준으로 탐지 프로그램으로 구현 하 고 가장 상단 왼쪽된 마크를 식별 하기 위해 잉크젯 정찰 병의 이미지 인식 시스템. 좌표를 사용 하 여 dAb 배열의 첫 번째 장소. 드롭릿 800 µ m의 센터-센터 간격 당 자리 8 nL.
  2. 이중 전송 방법 ( 그림 1b)
    1. 전송 슬라이드 1 왼쪽된 하단에 대 한 잉크젯 정찰 병 갑판에 배치. 택시 솔루션, 포함 된 400 µ g/mL 항 체 20% 글리세롤, PBS에서 1 %BSA 60%의 상대 습도 잉크젯 microarray 정찰 병으로 슬라이드에 자리 (0.4 각 명소에 대 한 nL 및 ~ 200 µ m 직경에서). 센터-센터 간격은 400 µ m.
    2. 스냅 스냅 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 분석 결과 슬라이드에 택시 물방울 전송 전송 슬라이드 코팅 nitrocellulose (또는 기능성된 유리) 분석 결과 슬라이드.
      1. 차례 모든 6 버튼 잠금 열림 위치에서 모든 plungers를 90도 스냅 기구 측면. 잘린 모서리 고정된 포고 핀을 직면 하 고 그것의 소켓에서 슬라이드 홀더에 전송 슬라이드를 삽입 합니다. 3 개의 버튼으로 황금 포고 핀 plungers를 슬라이드 맞춤 핀에 대 한 적용 됩니다 있는지 확인 하십시오의 첫 번째 집합 설정.
      2. 스냅 기구 거꾸로 앉아 4 포고 핀에에 니트로-코팅 슬라이드를 삽입 합니다. 실버 핀 plungers를 슬라이드 맞춤 핀에 대 한 적용 됩니다 있는지 확인 하는 3 개의 버튼의 두 번째 세트를 차례로.
      3. 가기 셸 슬라이드 홀더 맞춤 기둥 구멍을 사용 하 여 정확한 위치에 배치 하 여 맞춤 장치를 닫습니다.
      4. 그것의 감 금으로 닫힌된 스냅 기구를 삽입 하 고 밀어 폐쇄 탭 완전히 microarrays 적절 한 압력을 적용 하는 동안 얼굴을가지고. 1 분에 대 한 폐쇄 유지
    3. 슬라이드를 분리. 60%의 상대 습도와 1 시간 실 온에서 분석 결과 슬라이드를 품 어. 세척, 차단, 및 단계 1.1.3-1.1.5에에서 설명 된 대로 분석 결과 슬라이드 건조.
    4. 는 잉크젯 정찰 병 갑판에 밀어 하단 왼쪽된 모서리에 대 한 또 다른 전송 슬라이드를 배치합니다. 자리 dAb 솔루션 50 또는 100 µ g/mL의 항 체 (표 1 참조), 20% 글리세롤과 PBS에서 1 %BSA 포함. 각 자리 0.8 인지 확인 nL와 관광 명소의 센터-센터 간격은 400 µ m.
    5. 분석 결과 및 이전 슬라이드를 저장합니다. 분석 결과 전송 슬라이드 시키는 포함 하는 밀폐 봉지에 밀봉 하 고는-20 ° C 냉동 실에 넣어.

2. 스냅 칩 immunoassays 다중화

  1. 검색 냉장고에서 분석 결과 슬라이드. 슬라이드는 실내 온도에 올 때까지 30 분 동안 봉인 가방 두고.
  2. 준비 7-포인트 시리얼 단백질 0.05%를 포함 하는 PBS에 급상승 하 여 샘플 솔루션을 희석 트윈 20.
    참고: 여기, 5 희석 요소 사용 됩니다. 각 단백질에 대 한 시작 농도 표 1에 나와 있습니다.
  3. 적절 한 준비 샘플 솔루션입니다. 예를 들어 PBST 버퍼에 4 번 인간의 혈 청을 희석.
  4. 분석 결과 슬라이드에 16 실 가스 켓을 클램프.
  5. Pipetting으로 7 단백질 희석 솔루션 및 단백질-무료 PBST 버퍼 솔루션 8 우물의 한 열을 입력합니다. 같은 슬라이드에 다른 8 우물에서 샘플 솔루션을 플라스틱.
    참고: 각에 들어갈 수 있는 80 µ L 솔루션 잘. 필요한 경우 추가 샘플을 측정 하 더 많은 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
  6. 실 온에서 1 h 또는 4 ° C. 세척 슬라이드 세 번 450 rpm, 5 분 때마다 통에 PBST에서 하룻밤을 위해 450 rpm에서 통에 샘플을 품 어. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소 가스의 스트림 아래 슬라이드.
  7. 는 냉장고에서 dAbs과 전송 슬라이드를 검색합니다. 실 온에서 30 분 동안 봉인 가방을 유지. 그런 다음 60% 습도 안정화 구슬 재에 대 일 분을 포함 하는 닫힌된 챔버 (예: 빈 팁 박스)에 슬라이드를 품 어.
  8. 는 DAb 물방울 전송 스냅 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 분석 결과 슬라이드와 전송 슬라이드 스냅. 1.2.2 스냅 기구 운영에 대 한 섹션을 참조 하십시오.
  9. 슬라이드를 구분합니다. 품 어 60% 습도 안정화 구슬 1 h. 클램프 16 구획 가스 켓과 분석 결과 슬라이드를 포함 하는 닫힌된 챔버에 분석 결과 슬라이드와 슬라이드 4 번 린스 450 rpm, 5 분 때마다 통에 PBST를 사용 하 여.
  10. 피펫은 80 µ L의 각 음에 PBS에 2.5 µ g/mL streptavidin fluorophore 포함 하는 솔루션. 450 rpm에서 통에 20 분 동안 품 어.
  11. 450 rpm에서 통에 3 번과 PBST 슬라이드와 증류수 한 번 씻어. 개 스를 제거 하 고 건조 한 질소 가스를 사용 하 여 슬라이드.

3. 검색 및 데이터 분석 슬라이드

  1. 635 nm 레이저를 사용 하 여 형광 microarray 스캐너로 분석 결과 슬라이드를 스캔.
  2. 추출 분석 소프트웨어 (예: 배열 프로 분석기) 16를 사용 하 여 각 자리의 순 강도.
  3. 통계 소프트웨어를 사용 하 여 각 단백질의 탐지 (LOD)의 계산 하 고 샘플에서 단백질 농도 결정.
    주: LOD cu 표준의 Y 절편으로 정의 됩니다.rve 3 번 3 개의 독립적인 분석의 표준 편차 증가.

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Representative Results

단일 및 이중 전송 방법에 대 한 분석 결과 절차는 그림 1에 표시 됩니다. 단일 전송, 분석 결과 슬라이드에 직접 택시를 발견 하 고는 dAbs 분석 결과 슬라이드 거울 패턴의 택시 (그림 1a)에서 사용 시에 전송 됩니다. 하나의 전송 절차는 필요, 하지만이 방법은 주로 슬라이드와 잉크젯 갠트리 (그림 2) 사이 모 난 부정합으로 인 한 두 microarrays 사이의 부정합에서 겪고 있다. 이 문제를 해결 하기 위해 한 가지 방법은 택시와 분석 결과 슬라이드에 순차적으로 dAbs 구경, 그리고 스냅 장치에 슬라이드를 제대로 수정 후 전송 하는 것입니다 (그림 1b). 이 메서드를 사용 하 여 두 microarrays는 정확한 동일한 위치로 전송 됩니다. 아니 이미지 인식 시스템 또는 맞춤 마커는 이중 전송 방법에 대 한 필요 합니다. 관광 명소의 98%에 대 한 오차는 41 µ m,14의 이전 방법 비해 6-fold 개선 이내 했다.

스냅 장치는 어떤 훈련을 하지 않고 사용 하기 편리 하 고 배열 부정합의 위험을 최소화 설계 되었습니다. 슬라이드는 분석 결과 전송 슬라이드에 공통 맞춤 핀 덕분에 정확한 위치와 함께 주어진 다. 전송 슬라이드 분석 결과 슬라이드 스냅 기구 닫힐 때까지 포고 핀에 의해 일시 중지 될 때 아래에 맞게 약간 작습니다. 스페이서는 유리 슬라이드에 신뢰할 수 있는 작은 물방울 전송 허용 마이크로미터 크기의 간격을 유지 하는 전송 슬라이드에 포함 되어 있습니다. 마지막으로, 감 금 소 및 그 폐쇄 탭 설계를 재현할 수, 높은 품질의 전송에 대 한 모든 스냅인에서 전송에 필요한 압력. 스냅 기구 사진 그림 3에 표시 됩니다.

니트로 슬라이드 및 유리 슬라이드에 시 약의 결과 설명 하는 대표적인 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. 알 렉 사 532 IgGs 표시 된 첫 번째 시 약으로 사용 되었다 그리고 알 렉 사 647 IgGs 라는 두 번째 시 약으로 사용 되었다. 전송 후 슬라이드 532와 검색 및 635 nm 레이저. 결과 보여 줍니다 (대 한 니트로 슬라이드) 3136 또는 1024 (유리 슬라이드)에 대 한 마이크로 분석 결과 슬라이드에 제로 실패와 전송 및 교차 오염 없이 전송 하는 두 번째 시에 관찰 되었다. 유리 슬라이드를 사용 하면 그것은 더 많은 소수 성 표면 기능화, 따라서 각 스팟의 크기를 감소 하 고 감소 하는 관광 명소의 많은 수를 전송 하기 위한 반점 거리에 의해 만들 수 있습니다. 이 작품은 일반적으로 사용 되는 유리 기판에 스냅 칩 기술의 응용 프로그램을 확장합니다.

50-플렉스 immunoassay 대상 유방암의 표준 곡선 관련 단백질 그림 5, 해당 날짜 분 없이 최대 멀티플렉스 샌드위치 항 체 microarray 하에서 설명 된다. 슬라이드 검색, 그리고 형광 강도 표준 곡선을 생성 하기 위해 계량,이 분석 결과에 이중 전송 방법 사용. 35 중 50 단백질 pg/mL에서 Lod를 도달 (하십시오 표 1 참조) 시험 조건 최적화를 통한 더욱 향상 될 수 있습니다. Colocalization 시 약의 분 없이 단일 슬라이드에 여러 항 체의 사용을 용이 하 게 하 고 다른 쌍12에 방해 없이 독립적으로 각 쌍의 최적화를 허용 한다. 이러한 결과 스냅 칩은 멀티플렉스 단백질 정량화에 사용할 수 있는 확장 가능한 기술 나타냅니다.

Figure 1
그림 1입니다. (A) 단일 및 (b) 이중 전송 방법 비교 분석 결과 절차의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 차이 사이의 단일 및 이중 전송 보여주는 도식. (a) 전송 시 약의 미러링 슬라이드와 잉크젯 XY 스테이지 사이 모 난 부정합을 증폭 시키고 있다. (b) 이중 전송 메서드 각도 오차를 극복 한다. 허가 기준 14 에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 스냅 기구 사진. (a) 열된 장치입니다. (b) 폐쇄 장치입니다. (c) 관점 장치 보기 간단히, (i) 전송 슬라이드 슬라이드 홀더에 배치 되며 plungers에 장착 된 pogopin를 사용 하 여 정렬 핀에 대 한 밀어. (ii) 분석 결과 슬라이드는는 pogopins 위에 배치 하 고 두 번째 집합이 plungers 사용 하 여 맞춤 핀에 대 한 밀어. (iii) 최고 쉘 슬라이드 홀더 위에 배치 하 고 감 금 소에 삽입 합니다. 압력은 압축 하는 pogopin 고 슬라이드를 함께 폐쇄 탭을 사용 하 여 적용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 스냅 칩을 사용 하 여 관광 명소의 양도. 532를 사용 하 여 형광 스캔 및 전송 (a) 니트로에 항 체를 보여 633 nm 레이저 슬라이드 (허가 기준 14 에서 적응) 및 (b) 유리 슬라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 이중 전송 메서드를 사용 하 여 병렬로 측정 분석 결과 슬라이드의 형광 이미지 및 50 단백질의 표준 곡선. (표준 곡선을 생성 하기 위한 분석 결과 슬라이드의 a) 형광 이미지. (b)는 배열의 클로즈업. 눈금 막대 = 50 단백질에 대 한 2. (c) 표준 곡선. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차로 계산 했다. 허가 기준 14 에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단백질 이름 시작 하는 농도 (ng/ml) LOD (pg/ml) 단백질 이름 시작 하는 농도 (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 일리노이-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1.0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1.5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 일리노이-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 미그 500 11 × 102 공학과 1000 6.2 × 102 CCL3/밉-1Α 50 3.3 EGF 50 1.8 × 102 CCL4/밉-1Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP-3 500 1.0 × 102 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1.0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 보안-1 500 1.7 × 103 촉진제-Α 50 3.0 × 102 Β-NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3.5 × 103 NT-3 200 5.8 × 102 PDGF BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL 1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-리 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2.8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 일리노이-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 일리노이-6는 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

표 1. 단백질 농도 그리고 50-플렉스 분석 결과에서 버퍼에 Lod. CA 15-3에 대 한 LOD U/ml (*)입니다. 허가 기준 14 에서 적응.

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Discussion

이 작품에서는, 우리는 기본적인 실험 설치 연구자 멀티플렉스 교차 reactivity 무료 immunoassays 널리 이용할 수 있게 하는 스냅 칩 기술을 제시 했습니다. 다른 기존 항 체 microarrays, 아니 microarray 정찰 병은 최종 사용자를 위해 필요 합니다. 단일 및 이중 전송 방법을 시연 하 고 이중 전송 월급 우수한 정렬 정확도 ~ 40 μ m 63 µ m14의 가장 큰 오차와 98%의 관광 명소에 대 한. 새로운 스냅 기구가이 기술 연구에 액세스할 수 만들기, 일관 된 압력으로 두 개의 슬라이드를 편리 하 게 개발 되었다. 신뢰할 수 있는 시 약 전송 nitrocellulose-코팅 슬라이드에 뿐만 아니라 일반 유리 슬라이드에이 기술의 광범위 한 훈련의 필요 없이 응용 프로그램을 크게 확대 실현 된다. 단백질의 70% 범위의 pg/mL14에서 Lod를 달성 및 스냅 칩의 유용성을 보여 50-플렉스 immunoassay 미리 발견 하 고 저장 된 슬라이드를 사용 하 여 실시 했다. DAbs 혼합으로 적용 되는 기존 멀티플렉스 immunoassays에 비해, ACM 및 스냅 칩 기술의 중요 한 이점은 이다 칩 분석 실험은 서로 독립 되므로 추가 하거나 제거 하지 않고 어떤 항 체 쌍 다른 쌍 방해. 단백질의 수백 수만 스냅 칩, 따라서 각 항 체 17의 직렬 응용 프로그램을 필요로 하는 순차적 외피에 의해 자동된 연속 측정 등 다른 방법에 비해 시험 시간을 단축 동시에 측정할 수 있습니다. 각 항 체의만 하위-nanoliter 스냅 칩 제조, 기존의 immunoassays 보다 더 경제 만들기에 필요 합니다.

사용 하는 항 체 농도 및 항 원 부 화 단계는 분석 결과 높은 감도 달성 하기 위해 중요 합니다. 스냅 칩의 제조, 항 체 농도 분석 결과 슬라이드 (니트로 또는 니트로 비)의 유형과 항 체 쌍의 선호도 따라 최적화할 수 있습니다. 각 항 체 자리 볼륨 정찰 병 용량 및 정렬 정확도에 따라 조정 될 수 있다 그리고 관광 명소 센터-센터 간격 그에 따라 변경 될 수 있습니다. 분석 결과 슬라이드에 택시를 전송 후 우리 실 온에서 분석 결과 슬라이드를 incubated 하는 4 ° C에서 1 h. 하룻밤 인큐베이션 더 나은 항 체 바인딩 용량을 줄 수도 있습니다. BSA 무료 안정제 솔루션 (재료의 표 참조)를 사용 하 여기 택시 잠복기 후 분석 결과 슬라이드를 차단. 동물 혈 청 또는 우유 등 다른 차단 시 약 또한이 응용 프로그램에 대 한 작동 수 있습니다.

멀티플렉스 immunoassays에서 비 니트로 슬라이드 다른 표면 화학에 대 한 프로토콜 개발 고 최적화 될 수 있습니다. 다른 희석 요소 대상 단백질에 따라 표준 곡선을 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 fluorophores dAbs, 라벨을 사용할 수 있습니다 그리고 신호 컬렉션에 대 한 다른 파장에서 레이저를 사용 하 여 슬라이드를 검색할 수 있습니다.

현재, 625 명소/c m2 의 밀도와 이중 전송 방법14달성 되었습니다. 추가로 스냅 칩의 멀티플렉싱 기능을 개선 하기 위해, 여러 전략 있습니다. 첫째, 관광 명소, 관광 명소 및 증가 배열 밀도 사이의 짧은 센터에 센터 거리에 대 한 되므로의 크기를 줄이기 위해 작은 볼륨을 사용할 수 있습니다. 둘째, 한 점 크기를 줄이기 위해 더 많은 소수 성 표면 전송 슬라이드를 선택할 수 있습니다. 셋째, 두 microarrays 사이 더 나은 맞춤 잉크젯 정찰 병의 정밀한 조정을 수행 하 고 더 노즐 및 슬라이드 표면 사이의 거리 등 탐지 매개 변수를 최적화 하 여 얻을 수 있습니다.

모든 항 체 기반 immunoassays 관해서는 스냅 칩 immunoassay의 성능 여부 및 항 체의 품질입니다. 스냅 칩은 높은 감도 특이성 다른 epitopes를 대상으로 하는 항 체에의 한 쌍의 듀얼, 순차적 바인딩에서 여유 때문 애 란에서 가장 널리 사용 되는 분석 결과 형식, 샌드위치 분석 결과 형식을 사용 하 여 작동 하지만 그것은 의존 캡처 및 대상 단백질의 검출에 필요한 호환 항 체에의 한 쌍의 가용성.

스냅 칩 기술의 값 immunoassays에 대 한 설정 되 고 교차 오염18,19 없이 다른 시 약을 적용 해야 하는 모든 화학 및 생화학 반응에 사용 될 수 있습니다. , 20 , 21 , 22. 실제로, 스냅 칩 일반적인 솔루션을 제공 하는 microarray-하-microarray, 따라서 분리 분석 결과 절차와 칩 제조에서에서 다양 한 사전 발견된 시 약을 제공 하 고 따라서 해결 하는 데 도움이 합니다 " 매크로 마이크로 "인터페이스23을도전 한다. 예를 들어, 스냅 칩 정확한 타이밍, 및 대량 실험14비교 결과 128 조건 분석 4-플렉스 동종 효소 저해 분석 결과 대 한 사용 되었습니다. 그것은 또한 멀티플렉스 조직 얼룩에 대 한 적용 되었습니다. 또한, 그것은 다른 박테리아 또는 단일 세포 분석21,24, 세포에 화학 물질의 수천을 테스트 하거나 단일 또는 여러 단계의 화학에 다른 조건을 테스트 응용 프로그램을 차단 하는 약물에 기여할 수 있는 반응입니다.

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Disclosures

맥 길 대학교는 발명가로 Huiyan Li와 데이비드 융 커와 함께이 작품의 몇 가지 측면에 특허 출원을 제기 했다.

Acknowledgments

우리는 잉크젯 정찰 병의 사용에 대 한 박사 롭 Sladek을 감사합니다. 우리는 최종 지원 캐나다 기관에서 건강 연구 (CIHR), 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 암 학회 연구소 및 캐나다 재단에 대 한 혁신 (CFI)에 대 한 인정합니다. Dj가 감사 합니다 캐나다 연구의 자에서 지원합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

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References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6, (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410, (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844, (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7, (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10, (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3, (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11, (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301, (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11, (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84, (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407, (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11, (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88, (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106, (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83, (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5, (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270, (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32, (3), 841-848 (2011).

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