Оснастки чип для кросс-reactivity-свободных и без корректировщик мультиплексированных Immunoassays сэндвич

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы демонстрируем технологии чипа оснастку для выполнения иммуноанализа кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных сэндвич, просто щелкая два слайда. Оснастки аппарат используется для надежной передачи реагентов от microarray дна microarray. Оснастки чип может использоваться для любых биохимических реакций, требующих colocalization различных реагентов без перекрестного загрязнения.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мультиплексированных белка анализ показал Улучшенный диагностической чувствительностью и точностью по сравнению с одной белки. Microarrays антитела позволяют тысячи микро масштабе иммуноанализа выполняется одновременно на одном чипе. Сэндвич пробирного формат улучшает пробирного специфичность обнаружения каждой мишени с двумя антител, но страдает от перекрестной реактивности между реагентов, тем самым ограничивая их возможности мультиплексирования. Colocalization microarray антитела (ACM) был разработан для обнаружения кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных белка, но требует дорогостоящих корректировщик на месте для изготовления microarray дна во время анализов. В этой работе мы демонстрируем оснастки технологии чипа, который передает реагент от microarray дна microarray, просто щелкая две фишки вместе, таким образом не корректировщик требуется во время инкубации образца и последующего применения обнаружения антител (мазки) после Хранение предварительно пятнистый слайды, отделения подготовки слайдов от выполнения анализа. Оба одноместные и двухместные передачи методы представлены для достижения точного выравнивания между двумя microarrays и описаны изготовление слайд для обоих методов. Результаты показывают, что < был достигнут 40 мкм выравнивание с двойной передачей, достигнув массива плотность 625 пятна/см2. 50-plexed иммуноанализа была проведена продемонстрировать удобство использования оснастки чип в мультиплексированном белка анализа. Пределы обнаружения 35 белков находятся в диапазоне пг/мл.

Introduction

Группа состоит из нескольких белки biomarkers может обеспечить более высокой чувствительностью и специфичностью чем один биомаркеров в диагностике сложных заболеваний, как рак1,2. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) был золотой стандарт технологии, используемые в клинических лабораториях, достижение предела обнаружения на низких пг/мл в плазме, но пределы одной цели в Пробирной3,4,5. Microarrays антитела были разработаны для размещения тысячи миниатюрных анализы проведены параллельно на один Микроскоп слайд6,,78. Однако мультиплексирования возможности этого метода ограничено реагент driven перекрестной реактивности, вытекающих из применения смеси мазками, и она становится более проблематичным с учетом увеличения числа целевых показателей9,10 , 11. пла и др. заявили, что результирующий уязвимость мультиплекс сэндвич пробирного весы как 4N(N-1), где N — это количество целей12.

Чтобы смягчить перекрестной реактивности в microarrays антитела, colocalization microarray антитела (ACM) был разработан в нашей лаборатории для мультиплекс сэндвич пробирного12. На подложке с корректировщик microarray дна запятнаны захвата антител (кабины). После блокировки образцы применяются на поверхности, а затем отдельные мазки были замечены на же пятна с комплексом кабины антигена. Все сценарии перекрестной реактивности между антитела и антигены могут быть уменьшены с ACM, и были достигнуты пределы обнаружения в ПГ/мл. Однако протокол assay требует подготовки и кровянистые выделения мазками в ходе экспериментов с использованием корректировщик на месте microarray с высокой точностью для выравнивания цели, которая является дорогостоящим и трудоемким, ограничивающие широкое применение этой технологии в другие лаборатории. Портативных ACM, с именем оснастки чип был разработан для кросс-reactivity-бесплатно и бесплатно корректировщик мультиплекс сэндвич иммуноанализа13,14,15. Кабины и мазками предварительно заметили на слайд пробирного и передача слайд соответственно в формате microarray и хранятся. В ходе анализа слайды извлекаются и microarray мазками коллективно передаются на пробирного слайд, просто сдвинув две фишки вместе. Оснастки аппарат используется для передачи надежной реагента. Нитроцеллюлоза покрытием слайды с емкостью привязки относительно большой антитела были использованы в качестве пробирного слайды для поглощения жидких капель и таким образом содействия передаче реагента, однако, слайды дороже, чем обычные стекла слайды и microarray сканеры совместимы с непрозрачными слайды необходимы для приобретения сигнала.

В этой работе мы демонстрируем протокол выполнения мультиплекс сэндвич иммуноанализа с чипом оснастки. Роман оснастки аппарат был разработан для более удобной и надежной передачи реагент от microarray дна microarray. Важно отметить, что здесь мы создали метод передачи реагентов на обычные стекла слайды с чипом оснастки. 1024 пятна были успешно переведены и выровнены на стекло слайд, значительно расширить использование этой технологии в большинстве лабораторий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление и хранение оснастки микросхемы

  1. один метод ( Рисунок 1a)
    1. пятно кабины растворы, содержащие 400 мкг/мл антител и 20% глицерина в фосфат амортизированное saline (PBS) на нитроцеллюлозную (или функционализированных стекла) пробирного слайд с струйных корректировщик microarray 13 при относительной влажности воздуха 60% (1.2 nL для каждого пятна) с 800 мкм-центр интервал. Убедитесь, что слайд фиксируется на палубе корректировщик согласно один угол (здесь, был использован в нижнем левом углу).
    2. Инкубировать пятнистый пробирного слайд при комнатной температуре за 1 час с относительной влажности 60%.
    3. Зажим модуль прокладка слайд с 16 отсеков на слайде пробирного разделить его на 16 скважин. Промойте слайд три раза путем добавления 80 мкл PBS, содержащие 0,1% Tween-20 (PBST) в каждый хорошо и тряски при 450 об/мин на шейкер, 5 мин каждый раз,.
    4. Добавить 80 мкл блокирования решения для каждой хорошо и трясти за 1 ч при 450 об/мин.
    5. Удаление прокладки и сухой пробирного слайд с потоком азота.
    6. Исправить передачи слайдов на палубе корректировщик и нажмите в левом нижнем углу слайда с нижнем левом углу корректировщик палубы. Струйный пятно массив меток выравнивания (решение микро шарики полистироля) с тот же макет, что и для кабин.
    7. Пусть сухой меток выравнивания. Флип передачи слайдов и положил его обратно на палубу корректировщик, фиксации против в нижнем левом углу.
    8. Подготовить dAb кровянистые выделения растворов, содержащих 20 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% BSA.
    9. С использованием корректировщик ' s камеры, возьмите картину Марк выравнивания. Реализовать эту картину в пятнистость программу как доверительное и получить изображения распознавания системы струйных корректировщик для выявления наиболее верхний левый Марк. Используйте свои координаты как первое место тыкать массива. Место 8 nL за капли с центр центр расстояние 800 мкм.
  2. Метод двойной передачи ( рис. 1b)
    1. место передачи слайд 1 на палубе корректировщик струйный против в нижнем левом углу. Найди кабины растворы, содержащие 400 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% BSA в PBS на слайд с струйных microarray корректировщик при относительной влажности воздуха 60% (0,4 nL для каждого пятна и ~ 200 мкм в диаметре). Центр центр расстояние составляет 400 µm.
    2. Оснастки передачи с нитроцеллюлоза покрытием (или функционализированных стекла) пробирного слайда с помощью оснастки аппарат ( рис. 2) для передачи кабины капельки на пробирного слайд.
      1. Повернуть все шесть кнопок на стороне аппарата оснастки на 90 градусов, чтобы вытащить и заблокировать все поршни в открытом положении. Вставьте слайд передачи в слайд держатель в его сосуд с обрезанный угол, сталкивается с фиксированной ПОГО ПИН. Включите первый набор из трех кнопок освободить поршни с золотой ПОГО PIN-код и убедитесь, что слайды толкнул направляющие контакты.
      2. Вставить слайд нитроцеллюлозы покрытием в аппарат сидит вверх вниз оснастки на 4 контактов pogo. Поверните второй набор из трех кнопок освободить поршни с серебряной PIN-код и убедитесь, что слайды толкнул направляющие контакты.
      3. Закройте оснастку аппарат, поместив верхней оболочки на держателе слайдов с помощью выравнивания столбов и отверстия для точного позиционирования.
      4. Вставить аппарат закрытым оснастки в своей клетке и задвиньте закрытия вкладки довести microarrays лицом к лицу при применении соответствующего давления. Держать закрытыми за 1 мин
    3. Отдельные слайды. Инкубируйте пробирного слайд при комнатной температуре за 1 час с относительной влажности 60%. Вымойте, блокировать и сухой пробирного слайд, как описано в шагах 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Место другой передачи слайдов на струйных корректировщик палубы и упираются в нижнем левом углу. Пятно тыкать растворы, содержащие 50 или 100 мкг/мл антител (см. таблицу 1), 20% глицерина и 1% BSA в PBS. Убедитесь, что каждое пятно 0,8 nL и центр центр расстояние между пятна-400 мкм.
    5. Магазин пробирного и передача слайд. Уплотнение пробирного и передачи слайды в герметичной сумке с сиккативом и положить в морозильник-20 ° С.

2. Мультиплексированных иммуноанализа с оснастки чипов

  1. получить пробирного слайд из морозильной камеры. Оставьте мешок, опечатали за 30 мин до тех пор, пока слайд доходит до комнатной температуры.
  2. Подготовка 7-точка серийный разбавлена пики белков в PBS, содержащие 0,05% примеры решений Tween-20.
    Примечание: Здесь используется коэффициент разрежения 5 раз. В таблице 1 перечислены начальной концентрации для каждого белка.
  3. Подготовка образца решения в случае необходимости. Например, разбавить человеческой сыворотки 4 раза в буфер PBST.
  4. Хомут 16-купе прокладка на слайде пробирного.
  5. Заполнить один столбец 8 скважин с решениями 7 белка разрежения и белка бесплатная PBST буферный раствор, закупорить. Пипетка примеры решений в других 8 скважин на тот же слайд.
    Примечание: 80 мкл решения может поместиться в каждом хорошо. Более слайдов может использоваться для измерения дополнительных образцов при необходимости.
  6. Проинкубируйте образцы на шейкер при 450 об/мин за 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. мыть слайд три раза с PBST на шейкер при 450 об/мин, 5 мин каждый раз. Удалите прокладку и сухой слайд под струей газа азота.
  7. Получить передачи слайд с мазками из морозильной камеры. Держите сумку, запечатаны в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем, инкубировать слайд в закрытой камере (например, бокс пустые советы), содержащие 60% влажности стабилизации Бусины для 20 мин для регидратации.
  8. Оснастки передачи слайд с Пробирной слайд с помощью оснастки аппарат ( рис. 2) для передачи тыкать капельки. Смотрите раздел 1.2.2 для функционирования аппарата оснастки.
  9. Отдельные слайды. Инкубировать пробирного слайд в закрытой камере, содержащие 60% влажности стабилизации Бусины для 1 h. зажим пробирного слайд с прокладкой 16-купе и промойте слайд 4 раза с помощью PBST на шейкер при 450 об/мин, 5 мин каждый раз,.
  10. Пипетку 80 мкл растворы, содержащие 2,5 мкг/мл стрептавидина Флюорофор в PBS в каждой скважине. Проинкубируйте втечение 20 мин на шейкер при 450 об/мин.
  11. Промыть слайд 3 раза с PBST и один раз с дистиллированной водой в шейкер при 450 об/мин. Удалите прокладку и сухой слайдов, используя газ азот.

3. Слайд-сканирование и анализ данных

  1. Сканировать пробирного слайд с флуоресцентным microarray программы, используя Лазер 635 нм.
  2. Экстракт чистой интенсивности в каждом месте, с помощью анализа программного обеспечения (например, массив про анализатор) 16.
  3. Рассчитать предел обнаружения (LOD) каждого белка, с помощью программного обеспечения статистики и определения концентрации белка в пробах.
    Примечание: Лод определяется как Y-пересечение стандарта cuувеличивается в три раза стандартное отклонение трех независимых анализов RVE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пробирного процедура для одно- и двухместные методы передачи показан на рисунке 1. В одной передаче кабины запятнаны прямо на слайде пробирного и мазками передаются на пробирного слайд после использования в шаблоне зеркало кабины (рис. 1a). Требуется только одна передача процедура, но этот метод страдает от рассогласования между двумя microarrays, главным образом вызван угловое смещение между слайд и струйный козловые (рис. 2). Один из подходов к решению этой задачи состоит в передаче кабины и мазками последовательно на слайд пробирного после кровянистые выделения и фиксации слайды в оснастке аппарат правильно (рис. 1b). С помощью этого метода, оба microarrays передаются точно же позицию. Нет изображения распознавания системы или выравнивание маркер требуется для метода двойной передачи. В течение 41 мкм, кратные улучшение по сравнению с одной передачи метода14рассогласования на 98% пятна.

Оснастки аппарат был разработан чтобы быть простым в использовании, без каких-либо подготовки и свести к минимуму риск смещения массива. Слайды принесены вместе с точного позиционирования благодаря направляющие контакты общие для анализа и передачи слайдов. Передача слайд немного меньше по размеру ниже пробирного слайд при приостановке ПОГО булавками, до тех пор, пока аппарат оснастки закрыт. Разделитель включен на поддержание микрометра размера разрыв, который позволяет осуществлять передачу надежной капли на стекле слайд слайд передачи. Наконец клетка и ее закрытия вкладки предназначены для применения давление, необходимое для эффективной передачи на каждой оснастки для воспроизводимых, высокое качество передачи. На рисунке 3показано фото оснастку аппарата.

Представитель изображения, иллюстрирующие результаты передачи реагентов на слайде нитроцеллюлозы и стеклянное скольжение показаны на рисунке 4. Alexa 532 помечены IgGs были использованы в качестве первого реагента и Alexa 647 помечены IgGs были использованы в качестве второго реагента. После передачи, слайд был отсканирован с 532 нм и 635 нм лазеры. Результат показывает, что 3136 (для нитроцеллюлозных слайд) или 1024 (для стекла слайд) были переданы точек с нулевой неудачи на слайды пробирного и не перекрестное загрязнение было отмечено при передаче второго реагента. При использовании стекла слайдов, можно создать более гидрофобной поверхности, функционализации, таким образом уменьшая размер каждого места и уменьшения spot спот расстояние для передачи большего числа мест. Эта работа расширяет применение технологии чипа оснастки для часто используемых стеклянные подложки.

Стандартные кривые 50-plex иммуноанализа таргетинга РМЖ связанные белки изображены на рисунке 5, соответствующий крупнейшим мультиплекс сэндвич антитело microarray на сегодняшний день без перекрестной реактивности. Двухместный передача метод был использован в этот assay, слайд был отсканирован и интенсивности флуоресценции был количественно для создания стандартных кривых. 35 из 50 белки достиг LODs на ПГ/мл (см. таблицу 1) и далее может быть улучшена путем оптимизации анализа условий. Colocalization реагенты облегчает использование нескольких пар антитела на одном слайде без перекрестной реактивности и позволяет оптимизировать каждой пары независимо с без вмешательства других пар12. Эти результаты показывают, что чип оснастки это масштабируемая технология, которая может использоваться для количественного определения мультиплексированных белка.

Figure 1
Рисунок 1. Схема анализа процедуры сравнения сингл () и (b) двойные методы передачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Схематическое отображение различий между одно - и двойной передача. (a) зеркального отображения передачи реагентов усиливает угловое смещение между слайд и струйный Ху этап. (b) двойной передача метод преодолевает угловое смещение. Адаптировано из 14 ссылка с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Фото оснастку аппарата. (a) открыл устройство. (b) закрытое устройство. (c) перспективный вид устройства. Вкратце, (i) передавать слайды располагаются в слайд держатель и толкнул направляющие контакты с помощью pogopin, установленный на поршни. (ii пробирного слайды размещены в верхней части pogopins и толкнул направляющие контакты, используя второй набор плунжеров. (iii) верхней оболочки расположены на вершине слайд владельца и вставляется в клетке. Давление с помощью закрытия вкладки для сжатия pogopin и объединить слайды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Коллективный трансфер пятен с помощью оснастки чип. Флуоресценции сканирования с помощью 532 нм и 633 нм лазеры для демонстрации передачи антител на (a) нитроцеллюлоза слайд (адаптировано из 14 ссылка с разрешения) и (b) стекла слайд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Флуоресценции изображение слайда пробирного и стандартные кривые 50 белков, измеренная параллельно с использованием метода двойной передачи. () изображение флуоресценции пробирного слайд для генерации калибровочной кривой. (b) макро массива. Шкалы бар = 2 mm. (c) стандарт кривых для 50 белков. Планки погрешностей были рассчитаны как стандартных отклонений от трех независимых экспериментов. Адаптировано из 14 ссылка с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Имя белка Начальная концентрация (нг/мл) LOD (ПГ/мл) Имя белка Начальная концентрация (нг/мл) LOD (ПГ/мл)
ANG2 500 1.3 × 10-4 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1.0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 10-3 ИЛ-4 1000 1,5 × 10-4 СЕА 1000 5.4 × 10-3 ИЛ-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 ЛЭП 200 4.0 × 102 CRP 200 44 МИГ 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 EGF 50 1,8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1,9 × 102 ММП-3 500 1.0 × 102 ФАС L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 10-3 ФБП 500 1.0 × 10-3 ММП-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 ГМ КСФ 50 3.8 NCAM-1 500 1.7 × 10-3 ГРУ Α 50 3.0 × 102 Β-ФУН 200 1.4 × 10-3 HER2 500 3,5 × 10-3 NT-3 200 5.8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1,9 × 10-3 IL-1Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL-1ra 200 1.1 × 10-3 SPARC 1000 4,6 × 10-4 IL-15 50 8.2 × 102 ФНО Α 50 4.4 ИЛ-12 1 30 TNF-РИ 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 10-3 TNF-RII 50 12 ИЛ-10 500 6.1 × 102 ФАС/TNFRSF6 200 2,8 × 102 ИЛ-8 50 6.6 УПА 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

Таблица 1. Концентрацию белка и LOD ' ы в буфере от 50-plex assay. LOD для CA 15-3 находится в ед/мл (*). Адаптировано из 14 ссылка с разрешения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе мы представили оснастки чип технологии, что делает кросс-reactivity-бесплатный мультиплекс иммуноанализа широко доступны для исследователей с основные экспериментальной установки. В отличие от существующих microarrays антитела, не microarray корректировщик необходим для конечных пользователей. Продемонстрировал как в одиночных, так и в двойные методы передачи, и двойной передачи обеспечивает улучшенный выравнивание точность вниз до ~ 40 мкм для 98% пятна, с крупнейшим рассогласованием 63 мкм14. Роман оснастки аппарат был разработан удобно хватать два слайда с постоянное давление, что делает эту технологию доступной для исследователей. Надежные реагент передачи осуществляется не только на слайдах нитроцеллюлозы покрытием, но и на обычных стеклянных вставках, значительно расширить применение этой технологии без необходимости широкого обучения. Для демонстрации использования оснастки чип, 50-plex иммуноанализа был проведен с использованием предварительно пятнистый и хранить слайды и 70% белков LOD ' ы в диапазоне пг/мл14. По сравнению с существующих мультиплекс immunoassays, которые применяются мазки как смесь, важным преимуществом ACM и технологии чипа оснастки является, что анализы на чипе независимы друг к другу, таким образом позволяя для добавления или удаления любых антитела пар без вмешательства с другими парами. Десятки и сотни белки могут быть измерены одновременно с чипом оснастки, таким образом сокращая время пробирного, по сравнению с других методов, таких как автоматизированное измерение серийный последовательной инкубации, которая требует последовательного применения каждого антитела 17. Только суб nanoliter каждого антитела необходим для изготовления оснастки чип, что делает его более экономичным, чем обычные иммуноанализа.

Концентрации антитела используются и антиген инкубации шаги имеют решающее значение для достижения высокого анализа чувствительности. В изготовление оснастки чипов концентрация антитела могут быть оптимизированы в зависимости от сродства антитела пар и типы пробирного слайды (нитроцеллюлозы или не нитроцеллюлозы). Объемы каждое пятно антитела могут быть скорректированы на основе потенциала корректировщик и точность совмещения, и центр центр расстояние между пятна могут быть соответственно изменены. После передачи кабины пробирного слайд, мы инкубировали пробирного слайд при комнатной температуре за 1 ч. ночи инкубации при температуре 4 ° C может дать лучше антитела связывающая способность. BSA бесплатные стабилизатор решения (см. таблицу материалов) были использованы здесь чтобы блокировать пробирного слайд после инкубации кабины. Другие блокирующие реагентов как животные сыворотки или молока могут также работать для этого приложения.

В мультиплексированном immunoassays протоколы для не нитроцеллюлозные слайды с различных химии поверхности можно разработаны и оптимизированы. Коэффициент разрежения различных может использоваться для сделать стандартной кривых в зависимости от целевых белков. Различные флуорофоров может использоваться для обозначения мазками, и слайд могут быть отсканированы с помощью лазера на различные волны для сигнала коллекции.

В настоящее время с двойной передачей метода14был достигнут плотность 625 пятна/см2 . Для дальнейшего улучшения мультиплексирования возможности оснастки чип, доступны несколько стратегий. Во-первых меньшие объемы может использоваться для уменьшения размера пятна, таким образом позволяя короче центр центр расстояние между пятнами и плотности увеличение массива. Во-вторых можно выбрать передачу слайд с более гидрофобной поверхности для уменьшения размера пятна. В-третьих выравнивания соотношения между двумя microarrays может быть достигнуто путем выполнения тонкой регулировки струйный корректировщик и дальнейшей оптимизации пятнистость такие параметры, как расстояние между насадками и поверхности слайда.

Что касается всех иммуноанализа на основе антител производительность иммуноанализа чип оснастки зависит доступность и качество антител. Оснастки чип работает с использованием сэндвич пробирного формат, который является наиболее широко используемым пробирного формат в ELISA вследствие высокой чувствительностью и специфичностью, обеспечиваемой двойной, последовательные привязки пары антител против различных эпитопов, но это зависит наличие пары совместимы антител, необходимые для отслеживания и обнаружения целевого белка.

Значение технологии чипа оснастки для иммуноанализа, и ожидается, что он может использоваться для любых химических и биохимических реакций, которые требуют применения различных реагентов без кросс загрязнений18,19 , 20 , 21 , 22. на самом деле, оснастки чип обеспечивает общее решение для доставки различных предварительно пятнистый реагентов от microarray дна к-microarray дна, таким образом отмежевывается изготовление чип с процедурой анализа и поэтому помогает решению» макро микро» взаимодействие вызов23. В качестве примера оснастки чип использовался для assay ингибирование однородной фермента 4-plex для анализа 128 условий с точные сроки и сопоставимые результаты для большого объема экспериментов14. Он также применяется для окрашивания мультиплексированных ткани. Кроме того она может способствовать наркотиков скрининг приложений для тестирования тысячи химических веществ на различных бактерий или клетки, для одной ячейки анализ21,24, или для тестирования различных условий в одно- или многоступенчатые химической реакции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Университет Макгилла подал заявку на патент на некоторые аспекты этой работы с ли Huiyan и Дэвид Juncker как изобретатели.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Роб Сладек за использование струйных корректировщик. Мы отмечаем окончательное поддержки от канадской институтов для медицинских исследований (КНИИЗ), естественные науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ), Канадский научно-исследовательский институт рака общества и Канадский фонд для инноваций (CFI). D.J. Спасибо поддержки от Канада исследований кафедры.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6, (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410, (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844, (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7, (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10, (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3, (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11, (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301, (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11, (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84, (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407, (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11, (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88, (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106, (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83, (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5, (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270, (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32, (3), 841-848 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics