Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Bioengineering

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Summary

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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Abstract

Multiplexado proteína análise mostrou sensibilidade diagnóstica superior e precisão em comparação com proteínas única. Os microarrays do anticorpo permitem milhares de micro escala imunoensaios executados simultaneamente em um único chip. Formato de ensaio sanduíche melhora a especificidade do ensaio, detectando cada alvo com dois anticorpos, mas sofre de reactividade cruzada entre reagentes, limitando assim a sua capacidade de multiplexação. Anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido para a deteção de proteínas multiplexado cross-reactivity-livre, mas requer um caro observador no local para a fabricação de microarray durante os ensaios. Neste trabalho, vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap que transfere o reagente de microarray-para-microarray por simplesmente tirando dois chips juntos, que assim, nenhum observador é necessária durante a incubação da amostra e posterior aplicação de anticorpos de deteção (dAbs) em cima armazenamento de slides pre-manchados, dissociando a preparação de slide da execução do ensaio. Ambos os métodos de transferência de simples e duplas são apresentados para atingir o alinhamento exato entre os dois microarrays e a fabricação de slide para ambos os métodos são descritos. Os resultados mostram que < 40 μm alinhamento foi conseguido com dupla transferência, atingindo uma densidade de matriz de 625 pontos/cm2. Um imunoensaio 50-plexed já foram realizado para demonstrar a facilidade de utilização do chip snap na análise de proteína multiplexado. Limites de detecção de 35 proteínas estão no intervalo de pg/mL.

Introduction

Um painel de biomarcadores, compreendendo várias proteínas pode fornecer maior sensibilidade e especificidade do que um único biomarcador no diagnóstico de doenças complexas como câncer1,2. O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a padrão-ouro tecnologia utilizada em laboratórios clínicos, alcançar um limite de detecção em baixa pg/mL no plasma, mas os limites para um destino por ensaio3,4,5. Os microarrays do anticorpo foram desenvolvidos para acomodar milhares de ensaios miniaturizados conduzidas em paralelo em um microscópio único slide6,7,8. No entanto, a capacidade de multiplexação desse método é limitada pela reactividade cruzada orientada no reagente, decorrentes da aplicação de uma mistura de dAbs, e torna-se mais problemático com um número crescente de destinos9,10 , 11. Pla et al. afirmaram que a vulnerabilidade resultante de um ensaio de sanduíche multiplex dimensiona como 4N(N-1) onde N é o número dos alvos12.

Para atenuar a reactividade cruzada em Microarrays do anticorpo, o anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido em nosso laboratório para ensaio de sanduíche multiplex12. Anticorpos de captura (táxis) estão manchados em uma carcaça com um localizador de microarray. Após bloqueio amostras são aplicadas na superfície, e então pinceladas individuais são avistadas nos mesmos pontos com o complexo antígeno-táxi. Todos os cenários de reactividade cruzada entre antígenos e anticorpos podem ser atenuados com ACM, e limites de detecção em pg/mL foram alcançados. No entanto, o protocolo de ensaio requer preparação e manchando os dAbs durante os experimentos usando um localizador de microarray no local com alta precisão para efeito de alinhamento, que é caro e demorado, limitando a ampla aplicação desta tecnologia na outros laboratórios. Um ACM portátil, chamado snap chip foi desenvolvido para cross-reactivity-free e livre de observador multiplex sanduíche imunoensaios13,14,15. Táxis e pinceladas são pre-manchadas em um slide de ensaio e um slide de transferência respectivamente em formato de microarray e armazenadas. Durante o ensaio, os slides são recuperados e um microarray de pinceladas são transferidos coletivamente para o slide de ensaio simplesmente estalar dois chips juntos. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagente. Slides de nitrocelulose revestido com uma capacidade de ligação do anticorpo relativamente grande têm sido usados como os slides de ensaio para absorver as gotas de líquido e, assim, facilitar a transferência de reagente, no entanto, os slides são mais caros que microarray e corrediças de vidro normal os scanners compatíveis com lâminas transparentes são necessários para a aquisição do sinal.

Neste trabalho, vamos demonstrar o protocolo da realização de um imunoensaio sanduíche multiplex com um chip de snap. Um aparelho de pressão romance foi desenvolvido para transferência de reagente mais conveniente e confiável de microarray-para-microarray. Importante, aqui nós temos estabelecido o método de transferência de reagente para lâminas de vidro normal com o chip de snap. 1024 pontos com êxito foram transferidos e alinhados numa lâmina de vidro, ampliando significativamente o uso desta tecnologia na maioria dos laboratórios.

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Protocol

1. fabricação e armazenamento de fichas de snap

  1. método de transferência única ( Figura 1a)
    1. ponto táxi soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos e glicerol 20% em tampão fosfato salino (PBS) para uma nitrocelulose (ou um vidro funcionalizado) slide de ensaio com um jato de tinta microarray spotter 13 em uma umidade relativa de 60% (1.2 nL para cada spot) com espaçamento de centro--800 µm. Certifique-se de que o slide é fixado sobre o convés do observador de acordo com um canto (aqui, foi usado o canto inferior esquerdo).
    2. Incubar o slide manchado ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%.
    3. Pinça uma junta de módulo de slide com 16 compartimentos no slide do ensaio para dividi-lo em 16 poços. Enxágue o slide três vezes adicionando 80 µ l de PBS contendo 0,1% Tween-20 (PBST) em cada bem e tremendo a 450 rpm num agitador, 5 minutos de cada vez.
    4. Adicionar 80 µ l de bloqueio soluções para cada um bem e agitar durante 1 h a 450 rpm.
    5. Remover a junta e seque o slide de ensaio com um fluxo de nitrogênio.
    6. Consertar um slide de transferência do convés de observador e empurrar o canto inferior esquerdo do slide contra o canto inferior esquerdo do baralho observador. Jato de tinta manchar uma matriz de marcas de alinhamento (uma solução de microesferas de poliestireno) com o mesmo layout que para os táxis.
    7. Seque as marcas de alinhamento. O slide de transferência da aleta e colocá-lo de volta para o convés do observador, fixação contra o canto inferior esquerdo.
    8. Preparar o dAb manchando soluções contendo 20 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% de BSA.
    9. Usando o localizador ' s câmera, tire uma foto de uma marca de alinhamento. Implementar esta imagem no programa como um fiducial manchar e obter o sistema de reconhecimento de imagem dos auxiliares do inkjet para identificar a marca mais superior esquerda. Use seu coordenar como o primeiro ponto da matriz dAb. Ponto 8 nL por gota com um espaçamento de centro a centro de 800 µm.
  2. Método de transferência dupla ( Figura 1b)
    1. colocar um slide de transferência 1 no convés de observador de jato de tinta contra o canto inferior esquerdo. Ponto de táxis soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos, 20% de glicerol e 1% BSA em PBS a lâmina com um localizador de microarray de jato de tinta em uma umidade relativa de 60% (0.4 nL para cada local e ~ 200 µm de diâmetro). O espaçamento do centro-à-centro é 400 µm.
    2. Estalar o slide de ensaio de slide com uma nitrocelulose revestido (ou um vidro funcionalizado) transferência usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de táxi para o slide de ensaio.
      1. Vez todos os seis botões no lado do aparelho de pressão em 90 graus para puxar e travar todos os êmbolos na posição aberta. Introduza o slide de transferência no suporte de slide em seu receptáculo com o canto cortado virado para o pino fixo pogo. Vire o primeiro conjunto de três botões para liberar os êmbolos com o pino de pogo ouro e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.
      2. Inserir um slide de nitrocelulose revestido no snap aparelhos de ponta-cabeça sentado nos 4 pinos pogo. Virar o segundo conjunto de três botões para libertar êmbolos com o pino prateado e certifique-se que os slides são empurrados contra os pinos de alinhamento.
      3. Fechar o aparelho de pressão, colocando o revestimento superior no suporte do slide usando o alinhamento pilares e buracos para um posicionamento preciso.
      4. Inserir o aparelho de pressão fechado em sua gaiola e aperte a aba de fechamento completamente para trazer os microarrays face a face e aplicando a pressão adequada. Manter fechado por 1 min.
    3. Separar os slides. Incube o slide de ensaio à temperatura ambiente durante 1 h com uma humidade relativa de 60%. Lavar, bloquear e secar o slide de ensaio conforme descrito nas etapas 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Coloque outro slide de transferência sobre o convés do observador de jato de tinta e empurre contra o canto inferior esquerdo. Soluções de ponto dAb contendo 50 ou 100 µ g/mL de anticorpos (ver tabela 1), 20% de glicerol e 1% de BSA em PBS. Certifique-se de que cada ponto é 0.8 nL e o centro--espaçamento entre pontos é de 400 µm.
    5. Armazenar o ensaio e o slide de transferência. Selo do ensaio e a transferência de slides em um saco hermético contendo dessecante e colocar no congelador-20 ° C.

2. Multiplexado imunoensaios com snap chips

  1. recuperar o slide de ensaio do freezer. Deixar o saco selado por 30 min até que o slide vem à temperatura ambiente.
  2. Série 7-ponto de
  3. preparar diluído soluções de amostra por cravação proteínas em PBS contendo 0,05% Tween-20.
    Nota: Aqui, um factor de diluição de 5-fold é usado. As concentrações inicial para cada proteína estão listadas na tabela 1.
  4. Preparar soluções de amostra conforme apropriado. Por exemplo, diluir o soro humano 4 vezes em tampão PBST.
  5. Braçadeira uma junta 16-compartimento do slide ensaio.
  6. Preencher uma coluna de 8 poços com as soluções de diluição de 7 proteína e uma solução-tampão PBST livre de proteína por pipetagem. Pipetar as soluções de amostra em outros 8 poços no mesmo slide.
    Nota: podem ser ajustar 80 soluções µ l em cada poço. Mais slides podem ser usados para medir amostras adicionais quando necessário.
  7. Incubar as amostras num agitador a 450 rpm 1 h à temperatura ambiente ou para pernoite no 4 ° C. lavagem do slide 3 vezes com PBST no agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez. Remova a gaxeta e seque o slide em um fluxo de gás nitrogênio.
  8. Recuperar o slide de transferência com pinceladas do congelador. Manter o saco selado por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, incubar o slide em uma câmara fechada (por exemplo, caixa de dicas vazio) contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% por 20 min para reidratação.
  9. Estalar o slide de transferência com o slide de ensaio usando um aparelho de pressão ( Figura 2) para transferir as gotas de bagatela. Ver secção 1.2.2 para a operação do aparato snap.
  10. Separar os slides. Incubar o slide de ensaio em uma câmara fechada contendo grânulos de estabilização de umidade de 60% para h. 1 braçadeira do slide de ensaio com uma junta de 16-compartimento e enxaguar o slide 4 vezes usando PBST num agitador a 450 rpm, 5 minutos de cada vez.
  11. Pipeta 80 µ l de soluções contendo 2,5 µ g/mL streptavidin fluoróforo na PBS em cada poço. Incubar durante 20 min em uma coqueteleira a 450 rpm.
  12. Enxaguar o slide 3 vezes com PBST e uma vez com água destilada no agitador a 450 rpm. Remova a gaxeta e seque o slide usando gás nitrogênio.

3. Deslize a verificação e análise de dados

  1. digitalizar o slide de ensaio com um scanner de microarray de fluorescência usando o laser de 635 nm.
  2. Extrair a intensidade líquida de cada ponto, usando uma análise de software (por exemplo, o analisador de matriz-pro) 16.
  3. Calcular o limite de detecção (LOD) de cada proteína usando um software de estatísticas e determinar as concentrações de proteína em amostras de.
    Nota: O LOD é definida como a intercepção de Y da norma cuEva, incrementada por três vezes o desvio padrão de três ensaios independentes.

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Representative Results

O procedimento de ensaio para single e double métodos de transferência é mostrado na Figura 1. Na única transferência, os táxis são vistos diretamente no slide do ensaio e as pinceladas são transferidas para o slide de ensaio mediante a utilização de um padrão de espelho dos táxis (Figura 1a). Procedimento de transferência apenas uma é necessário, mas este método sofre de desalinhamento entre os dois microarrays, causada principalmente pelo desalinhamento angular entre o slide e o pórtico de jato de tinta (Figura 2). Uma abordagem para enfrentar este desafio é para transferir tanto cAbs e pinceladas sequencialmente para o slide de ensaio depois de spotting e consertando os slides no aparelho de pressão devidamente (Figura 1b). Usando esse método, ambos os microarrays são transferidos para a mesma posição exata. Nenhum marcador de sistema ou alinhamento de reconhecimento imagem é necessária para o método de transferência de dupla. O desalinhamento para 98% dos pontos estava dentro de 41 µm, 6-fold melhoria em comparação com o método de transferência única14.

O aparelho de pressão foi projetado para ser fácil de usar, sem qualquer formação e minimizar o risco de desalinhamento de matriz. Os slides são trazidos juntamente com o posicionamento exato graças aos pinos de alinhamento comuns de ensaio e a transferência de slides. O slide de transferência é um pouco menor para caber abaixo o slide de ensaio quando suspensa por pinos o pogo, até o aparelho de pressão está fechado. Um espaçador é incluído no slide transferência mantendo uma lacuna de tamanho micrométrico que permite transferência confiável da gota para a lâmina de vidro. Finalmente, a gaiola e sua aba de fechamento são projetados para aplicar a pressão necessária para transferência eficaz em cada foto para transferência reprodutíveis, alta qualidade. Uma foto do aparato de pressão é mostrada na Figura 3.

Ilustrando os resultados da transferência de reagente em um slide de nitrocelulose e uma lâmina de vidro de imagens representativas são mostradas na Figura 4. 532 Alexa rotulado IgGs foram usados como o primeiro reagente, e Alexa 647 rotulado IgGs foram usados como o segundo reagente. Após a transferência, o slide foi digitalizado com 532 nm e 635 nm de lasers. O resultado mostra que 3136 (para o slide de nitrocelulose) ou 1024 (para a lâmina de vidro) microspots foram transferidos com zero falha sobre as guias de ensaio e nenhuma contaminação foi observada após transferir o segundo reagente. Ao utilizar lâminas de vidro, é possível criar mais hidrofóbico superfície por functionalization, assim reduzindo o tamanho de cada ponto e diminuindo a distância ponto-a-ponto para a transferência de um maior número de pontos. Este trabalho amplia a aplicação da tecnologia de chip snap para substratos de vidro comumente usados.

Curvas padrão um 50-plex imunoensaio direcionamento do cancro da mama relacionados com proteínas são ilustradas na Figura 5, correspondente o maior sanduíche multiplex anticorpo microarray a data sem reactividade cruzada. Método de transferência de dupla foi usado neste ensaio, o slide foi digitalizado e a intensidade de fluorescência foi quantificada para gerar as curvas padrão. 35 de 50 proteínas alcançado LODs em pg/mL (ver tabela 1) e pode ser melhorada através da otimização das condições de ensaio. Colocalization de reagentes facilita o uso de vários pares de anticorpo em um único slide sem reactividade cruzada e permite a otimização de cada par de forma independente, sem nenhuma interferência em outros pares12. Estes resultados indicam que esse chip snap é uma tecnologia escalável que pode ser usada para quantificação da proteína multiplexado.

Figure 1
Figura 1. Esquemática do procedimento de ensaio comparando único (a) e (b) dupla transferência métodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Esquemático mostrando diferenças entre single e double-transferência de. (a) espelhamento dos reagentes transferência amplifica o desalinhamento angular entre o slide e o estágio XY de jato de tinta. (b) transferência de duplo método supera o desalinhamento angular. Adaptado de referência 14 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Foto do aparato snap. (um) dispositivo aberto. (b) dispositivo fechado. (c) do dispositivo em perspectiva. Brevemente, (i) transferir slides são posicionados no suporte do slide e empurrado contra pinos de alinhamento usando o pogopin montado em êmbolos. (ii) os slides de ensaio são colocados em cima da pogopins e empurrados contra os pinos de alinhamento usando um segundo conjunto de êmbolos. (iii) o revestimento superior é posicionado sobre o titular do slide e inserido na gaiola. Uma pressão é aplicada usando a aba de fechamento para comprimir o pogopin e reunir os slides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Transferência coletiva de pontos usando um chip snap. Digitalização de fluorescência usando 532 nm e 633 nm lasers, para demonstrar a transferência de anticorpos para um (a) nitrocelulose slide (adaptado de referência 14 com permissão) e (b) vidro deslize. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. Imagem de fluorescência de um slide de ensaio e curvas padrão de 50 proteínas medido em paralelo usando o método de transferência duplo. (a) imagem de fluorescência de um slide de ensaio para a geração de uma curva padrão. (b) close-up de uma matriz. Barra de escala = 2mm. curvas padrão (c) para 50 proteínas. Barras de erro foram calculadas como desvios-padrão de três experimentos independentes. Adaptado de referência 14 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome de proteína Concentração inicial (ng/ml) LOD (pg/ml) Nome de proteína Concentração inicial (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1,0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4,9 × 103 IL-4 1000 1,5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 × 4,0 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1 Α 50 3.3 FEG 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1 Β 50 12 EGFR 200 1,9 × 102 MMP-3 500 1,0 × 102 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1,0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1.7 × 103 GRO-Α 50 3.0 × 102 Β-NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3,5 × 103 NT-3 200 5,8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1,9 × 103 IL-1 Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL-1ª 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4,6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6um 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

Tabela 1. As concentrações de proteína e LODs no buffer de ensaio de 50-plex. O LOD para CA 15-3 está em U/ml (*). Adaptado de referência 14 com permissão.

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Discussion

Neste trabalho, apresentamos uma tecnologia de chip de pressão que faz com que o livre de cross-reactivity multiplex imunoensaios amplamente disponíveis para os pesquisadores com configuração básica experimental. Diferente da existente Microarrays do anticorpo, nenhum observador microarray é necessária para os usuários finais. Tanto single e double métodos de transferência são demonstrados e transferência dupla oferece precisão de alinhamento superior para ~ 40 μm para manchas de 98%, com o maior desalinhamento de 63 µm14. Um aparelho de pressão romance foi desenvolvido para encaixar convenientemente os dois slides com pressão consistente, tornando esta tecnologia acessível aos pesquisadores. Transferência confiável de reagente é realizada não só nas corrediças revestidas de nitrocelulose, mas também em lâminas de vidro normal, expandindo significativamente a aplicação desta tecnologia sem a necessidade de treinamento extensivo. Para demonstrar a facilidade de utilização do chip snap, um imunoensaio 50-plex foi realizado utilizando slides pre-manchados e armazenados, e 70% das proteínas alcançada LODs na gama de pg/mL14. Em comparação com os imunoensaios multiplex existentes que aplicar pinceladas como uma mistura, um importante benefício de ACM e a tecnologia de chip de snap é que os ensaios em um chip são independentes entre si, permitindo assim adicionar ou remover quaisquer pares de anticorpos sem interferir com quaisquer outros pares. Dezenas a centenas de proteínas podem ser medidas em simultâneo com um chip de snap, encurtando assim o tempo de ensaio, em comparação com outros métodos, como a medição automatizada de serial por incubação sequencial que requer aplicação de série de cada anticorpo 17. Apenas subnanolitros de cada anticorpo é necessária para a fabricação de chip de snap, tornando-o mais económico do que convencional imunoensaios.

As concentrações de anticorpos utilizadas e as etapas de incubação do antígeno são essenciais para alcançar a sensibilidade do ensaio de alta. Na fabricação dos chips de snap, concentração de anticorpo pode ser otimizada dependendo da afinidade de pares de anticorpos e os tipos dos slides do ensaio (nitrocelulose ou não-nitrocelulose). Os volumes de cada ponto de anticorpo podem ser ajustados com base na capacidade do observador e precisão de alinhamento, e o centro--espaçamento entre os pontos pode ser alterado em conformidade. Após a transferência de táxis para o slide de ensaio, nós incubado o slide de ensaio à temperatura ambiente para incubação Overnight de h. 1 a 4 ° C pode dar melhor capacidade de ligação do anticorpo. BSA estabilizador livre soluções (consulte a tabela de materiais) foram usadas aqui para bloquear o slide de ensaio após incubação de táxis. Outros reagentes bloqueio tais como o leite ou soro animal também podem funcionar para esta aplicação.

Nos imunoensaios multiplexados, protocolos de slides não-nitrocelulose com química de superfície diferente podem ser desenvolvidos e otimizados. Um fator de diluição diferente pode ser usado para fazer curvas padrão dependendo as proteínas alvo. Fluorophores diferentes pode ser usado para rotular dAbs, e os slides podem ser digitalizados usando um laser em um comprimento de onda diferente para coleção de sinal.

Atualmente, uma densidade de 625 pontos/cm2 foi conseguida com o método de transferência duplo14. Para melhorar ainda mais a capacidade de multiplexação do chip snap, várias estratégias estão disponíveis. Em primeiro lugar, volumes menores podem ser usados para reduzir o tamanho dos pontos, permitindo assim menor distância de centro a centro entre pontos e aumento de matriz densidade. Em segundo lugar, pode-se escolher um slide de transferência com uma superfície mais hidrofóbico para reduzir o tamanho de ponto. Em terceiro lugar, melhor alinhamento entre os dois microarrays pode ser conseguido realizando o ajuste fino do observador a jato de tinta e otimizando ainda mais os mancha parâmetros tais como a distância entre os bicos e a superfície de slide.

Quanto a todos os imunoensaios baseados em anticorpos, o desempenho do imunoensaio microplaqueta snap é sujeito a disponibilidade e qualidade dos anticorpos. O chip de snap Opera usando um formato de ensaio de sanduíche, que é o formato de ensaio mais amplamente utilizado em ELISA devido à sua alta sensibilidade e especificidade, proporcionada pela ligação dupla, sequencial de um par de anticorpos diferentes epitopos de segmentação, mas é dependente de a disponibilidade de um par de anticorpos compatíveis necessário para captura e detecção da proteína alvo.

O valor da tecnologia de chip de snap é estabelecido para os imunoensaios, e espera-se que pode ser usado para quaisquer reacções químicas e bioquímicas que exigem a aplicação de diferentes reagentes sem Cruz-contaminações18,19 , 20 , 21 , 22. na verdade, o chip de snap fornece uma solução geral para entregar vários reagentes pre-manchados de microarray-para-microarray, assim, dissociar a fabricação do chip com o procedimento de ensaio e portanto ajuda a abordar o " interface do macro ao micro"desafio23. Como exemplo, o chip de snap tem sido usado para o ensaio de inibição da enzima homogênea uma 4-plex para analisar 128 condições com sincronismo preciso e resultados comparáveis para experimentos de grande volume14. Ele também foi aplicado para coloração de tecido multiplexado. Além disso, pode contribuir para aplicações para testar milhares de produtos químicos em diferentes bactérias ou células, para uma única célula análise21,24, ou para testar diferentes condições em química única ou de várias etapa de despistagem de drogas reações.

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Disclosures

McGill University apresentou um pedido de patente sobre alguns aspectos desse trabalho com Huiyan Li e David Juncker como inventores.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Rob Sladek para o uso dos auxiliares do inkjet. Reconhecemos o apoio final dos institutos canadenses para pesquisa de saúde (CIHR), as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC), Instituto de pesquisa canadense de sociedade cancros e a Fundação do Canadá para a inovação (CFI). Obrigado D.J. suporte de uma cadeira de pesquisa do Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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