ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

Neuroscience

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Summary

このプロトコルが Ca2 +保持能力と Ca2 +を調べる方法を説明することを目的 - トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ ステップ。

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Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

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Abstract

酸化的リン酸化による ATP の生産は、ミトコンドリアの主要な機能です。高等真核生物のミトコンドリアは細胞内 Ca2 +のバッファリングにも参加し、ミトコンドリアで、ATP を生産することができます無料のミトコンドリア内 Ca2 +濃度によって媒介されます。Ca2 +保持能力は、ミトコンドリアのマトリックスでカルシウムを保持するミトコンドリアの機能としてみなすことができます。蓄積された細胞内 Ca2 +の内ミトコンドリア膜透過性につながるでは、ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP)、分子と分子の漏れにつながる重量未満 1.5 kDa の開口部と呼ばれます。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。ここで、Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する 2 つの試金を記述-分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。一定量に Ca2 +が追加されますすべての手順を実行することができます 1 日で完了なりマイクロ プレート リーダーによって記録されました。したがって、これら 2 つのシンプルで効果的なアッセイを採用して、Ca2 +を評価できる-関連するミトコンドリアの機能。

Introduction

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化による哺乳類細胞で使用される ATP の約 95% を生産する主要な細胞器官です。合成 ATP1に ADP をリン酸化して使用できます、ADP と無機リン酸の存在、人里離れたマイクロモル濃度 Ca2 +ミトコンドリアによって報告されます。細胞内 Ca2 +濃度がしきい値を超えると、ミトコンドリアが取り込み Ca2 +急速および流出それゆっくり。したがって、機能しているミトコンドリアは、増加した細胞内 Ca2 +の流入をことができます。無関係酸化的リン酸化に関与する、ミトコンドリア Ca2 +もゾル性細胞質カルシウム信号の部分を取るし、mPTP のミトコンドリアの内側の開口部を誘導することによってミトコンドリアを介したアポトーシスのメカニズムをアクティブにします。膜2。細胞内 Ca2 +の異常上昇が mPTP3を開くことによってミトコンドリアの大規模な腫れを引き起こすことができる広く認識されています。したがって、このプロトコルがミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を定量化することでミトコンドリアの機能を評価することを目的-ミトコンドリアの膨潤が起きるというものです。

Ca2 +保持能力ゾル性細胞質カルシウムを摂取するミトコンドリアの機能の測定であります。ミトコンドリアは細胞内遊離カルシウムをバッファーし、使用頻度の低い沈殿物の形でカルシウム摂取によってカルシウム依存性細胞プロセスを調整できます。障害者 Ca2 +保持能力にエネルギー制限とも神経変性疾患4,5に関連するストレス現象に発生します。ミトコンまたはジギトニン グリセリン細胞 Ca2 +保持能力を識別するために使用できます、追加グルタミン酸とリンゴ酸分離ミトコンドリアによる Ca2 +を蓄積する高い能力は受けない、ミトコンドリアの分離手順6。ジギトニンの滴定された量を使用して、異なる種類の細胞の細胞膜を permeabilize ください。Hexapotassium 塩 Ca2 +-緑色蛍光染料、Ca2 +の結合-敏感な細胞非透過性可視光興奮インジケーターは、広く使用されている7をされています。Ca2 +-(5 分) 刺激8延長バインド緑蛍光染料は低親和性インジケーターで、無料の細胞内 Ca2 +濃度が上昇し続けることを示すために使用します。このメソッドは、放射性フィルター技術よりも敏感だったが、大幅に簡略化します。追加 Ca2 +カルシウム緑色蛍光を高め、ミトコンドリアの Ca2 +吸収がベースラインに蛍光を返します。逐次追加の Ca2 +は、ミトコンドリア吸収 extramitochondrial Ca2 + 9に失敗するまで行われました。蛍光マイクロ プレート リーダーは、継続的にカルシウム緑色蛍光を報告する使用できます。

Ca2 +蓄積の後、ミトコンドリアが脱分極し、中に Ca2 +放出ははれだした。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。電子顕微鏡、Ca2 +の測定に使用に 540 nm の吸光度の減少-ミトコンドリアの膨潤10,11をトリガーします。前方角度光散乱で12、吸光度の減少がミトコンドリアのマトリックスの受動的な腫れを反映ミトコンドリア ボリュームを直接的に確認することができます。

ここで、我々 はミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する方法論を説明-SH SY5Y 細胞から分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。

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Protocol

1. ミトコンドリアの分離

注: すべてのソリューションや機器 0 - 4 ° C に冷却、氷で保たれます。

  1. 10 cm 細胞培養ディッシュあたり種子約 3 x 10 の6 SH SY5Y 細胞。高グルコース ダルベッコの培養細胞の 10% 牛胎児血清ペニシリン (100 U/mL) とイーグル培地、変更された-ストレプトマイシン (100 μ g/mL)。一晩 5% CO2を含むインキュベーターで 37 ° C で維持します。
    注: 少なくとも 1-2 107 SH SY5Y セル x は各分離アッセイに必要な。
  2. メディアを取り出して、3 回約 1 ml の 10 cm 細胞培養皿で氷冷 PBS のセルを洗浄します。
  3. 10 cm 細胞培養皿に氷冷 PBS の新しい 1 mL を追加し、新しい 1.5 mL チューブに付着性のセルをこすり。800 x g で 4 ° C で 10 分間遠心
  4. 、遠心分離中にプロテアーゼ阻害剤在庫の 50 μ L を添加した 5 mL ミトコンドリア分離バッファー (250 mM ショ糖、10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) 1 ピペラジン ethanesulfonic 酸), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA) の準備します。(100 倍の濃度; ddH2O の 500 μ L に溶解し 1 EDTA 無料タブレット) のソリューションです。
  5. 上澄みを除去し、ミトコンドリア分離バッファーの 1 mL にペレットを再懸濁します。30 分間氷の上 1.5 mL チューブを孵化させなさい。
  6. 上下に手動で氷の上ガラス ホモジナイザー (15-25 ストローク) と浮遊細胞を溶解します。
    注: 細胞をホモジナイズ時に気泡がないことを確認します。視覚的に顕微鏡でそのままなセルとむく核をカウントし、ことを確認 > 90% 細胞破砕が発生しました。
  7. 1.5 mL チューブと (核と残りのままなセル) の残骸を削除する 4 ° C で 5 分間 1,000 × g で遠心分離機に磨砕液を転送します。
  8. 新しい 1.5 mL チューブに 1,000 x g で 5 分間遠心上清を転送 4 ° C
  9. 上清を新しいチューブと 14,000 × g で 15 分間遠心するに転送 4 ° C
  10. 上澄みを除去し、ミトコンドリア ミトコンドリア分離バッファーの 1 つの mL を含むペレットを再懸濁します。
  11. 14,000 x g 4 ° C で 15 分のためのソリューションを遠心分離機、ミトコンドリアを沈殿させます。
  12. 結果ミトコンドリア ペレットを氷で冷やして、50-100 お尻の前にペレットの量に応じて KCl メディアを μ L (125 mM KCl、2 ミリメートル K2HPO4、1 mM MgCl2、20 mM HEPES、5 mM グルタミン酸 5 mM マラテと 2 μ M ロテノン、pH 7.4) で再停止される必要があります。そう。
  13. 標準 BCA アッセイ、OD562 を測定によってミトコンドリア蛋白質の集中を測定するミトコンドリア ソリューションの 5 μ L を使用してプレート リーダー13を使用して。

2. ミトコンドリアの Ca2 +の保持容量の決定

  1. KCl メディアを準備し、Ca2 +を追加-実験前に 0.5 μ M の最終的な集中に緑色の蛍光色素を結合します。
  2. 0.5 μ M の Ca2 +を含む KCl メディア分離ミトコンドリア (0.4 mg/mL) の 1 mL を転送-よく各 6 ウェル プレートに緑色の蛍光色素を結合します。
  3. ミトコンドリアと Ca2 +を孵化させなさい-室温 20 mm CaCl2ソリューション (20 mM CaCl2, 127 mM KCl、1 mM MgCl2 1 分追加 4 μ 因数の周囲の光から保護 6 ウェル プレートで緑の蛍光色素を結合、20 mM HEPES、グルタミン酸 5 mM、5 mM のリンゴ酸、pH 7.4) 各 6 ウェル プレートに自動を使用してよく分配設定 200 nmol Ca2 +/mg ミトコンドリア蛋白質を紹介します。
  4. 蛍光分析装置を使用するには、すべて 3 蛍光の変化を監視して s 励起波長 506 の 2 分を nm、発光波長 531 nm。プレートは 3 の 600 rpm で揺れ装備ソフトウェア (図 1) によって制御の測定値間の s。
  5. 各ウェルに 20 mM CaCl2ソリューションの追加 4 μ 因数を追加し、すべての 3 の蛍光の変化を監視 2 分の s は、蛍光性は時間とともに増加するまでこの手順を繰り返します。
    注: ミトコンドリアと追加された Ca2 +増加記録蛍光によって示される挑戦されています。MPTP が開いたら、蛍光性は時間とともに増加します。
  6. Ca2 +追加 Ca2 +保持能力として、mPTP が開くまでの総額を解釈します。

3. Ca 2 +の定量-ミトコンドリアの膨潤を誘発

  1. 実験前に KCl メディアを準備します。
    1. KCl メディアでの分離ミトコンドリア (0.4 mg/mL) の 1 つの mL を各 6 ウェル プレートにも転送します。
  2. ミトコンドリアの膨潤をトリガーするミトコンドリアのタンパク質に 10 μ L の 20 mM CaCl2水溶液 (500 nmol/mg ミトコンドリア蛋白質) を追加します。
  3. 540 で吸光度の減少を記録 nm 毎の 3 10 分 (図 2) のためのソフトウェアによって制御されるマイクロ プレート リーダーの s。蛍光変化は、ミトコンドリアの内膜に溶質の流入によって引き起こされます。
    注: 540 で吸光度の低下腫れミトコンドリアに対応する nm。読者は、吸光度の減少を観察しない長い間隔を読書や読書の時間が適用できます。

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Representative Results

Ca2 +保持能力の代表の結果:
結果は、蛍光値として表現されました。Ca2 + (200 nmols/mg ミトコンドリア蛋白質)、mPTP 開口基準上増蛍光付加パルス。5 μ M Bongkrekate (BKA)、Ca2 +の阻害剤-mPTP が開いたり、1 μ M atractyloside (ATR)、Ca2 +の活性化を誘導-mPTP オープニングを誘発、ミトコン ドリアにしました。合計追加 Ca2 +ベースライン蛍光上ダブルの増加によって示される mPTP オープニングまでの量は、Ca2 +保持能力と解釈されました。我々 のデータあったミトコンドリア Ca2 +保持容量 BKA 治療で ATR グループよりもはるかに高かった。これらのデータは、ミトコンドリア Ca2 +保持能力 (図 3) の適当な測定を確認しました。

Ca2 +の代表結果-誘発ミトコンドリアの膨潤。
結果は 540 で吸光度の変動率として表された CaCl2の添加後 10 分の期間の間に初期の吸光度と nm。Ca2 + (500 nmol/mg ミトコンドリア蛋白質)、540 で監視吸光度低下の添加によるトリガー nm にミトコンドリアの腫れが示されています。BKA や ATR の治療、較正曲線 BKA できます ATR mPTP (図 4) を開くを容易にすることができます中に開く mPTP を抑制することを示す初期の吸光度と比較してわずかなあるいは急激な減少を示した。

Figure 1
図 1: ミトコンドリアの Ca2 +の保持の能力分析のソフトウェア設定しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ミトコンドリア Ca2 +ソフトウェアの設定-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガーしますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: Ca2 +保持能力の測定。余分なミトコンドリア Ca2 +分離ミトコンドリアのクマリンを用いて測定した Ca2 +-5 μ M bongkrekate (BKA)、1 μ M atractyloside (ATR)、または空白のコントロール (コン) の存在下で緑の蛍光色素を結合します。BKA、ATR、コンと分離ミトコンドリアによる Ca2 +保持の痕跡を測定した 506 nm (Ex) と 531 nm (Em) マイクロ プレート リーダーに。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: Ca2 +の測定-ミトコンドリアの膨潤を誘起します。Ca2 +-誘導ミトコンドリアの膨潤 SH SY5Y 5 μ M bongkrekate (BKA)、1 μ M atractyloside (ATR)、または空白のコントロール (コン) の存在下では 540 で初期の吸光度の比率低下較正曲線として表現された nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

ここでは、我々 はミトコンドリアの Ca2 +の保持の能力分析と Ca2 +のシンプルで効果的なプロトコルを記述した-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガーされます。

ミトコンドリアの分離セルを均質化する場合は特にすべての材料およびチューブは氷の上が存在することを確認します。0.25% トリプシン-EDTA は、37 ° C で 5 分間料理から細胞を切り離す場合にも使用できます。15 25 ストローク後観察顕微鏡の下でそのまま細胞膜とミトコンドリア膜の破損を避けるために必要です。しかし、我々 が得られる分離ミトコンドリア粗ミトコンドリアと精製ミトコンドリアは、1.0 M を得ることができる/1.5M 蔗糖不連続密度勾配。生きている細胞内のミトコンドリアの生物学的特性は、ミトコンドリアを囲む培地成分の濃度のためそれら体内より分離ミトコンドリアのような詳細です。ミトコンドリアの Ca2 +の保持容量または Ca2 +-誘発ミトコンドリア膨潤試験通電条件下で決定されました。機能しているミトコンドリアの定量、5 mM コハク酸はグルタミン酸とリンゴ酸の6の代わりに呼吸基質として追加できます。

Ca2 +-緑の蛍光色素をバインド (バインド Ca2 + 4.29 ± の親和性を持つ 0.67 mM)、Ca2 + fura 2 7などより高い親和性染料よりマイクロモル濃度の測定に適しています。Ca2 +の付加の後で-緑の蛍光色素を結合孵化は 1-3 分間隔で注入された Ca2 + (25-200 nmol から変化) 未満 240 s. 連続する追加する必要があります。検量線は、ミトコンドリアの Ca2 +パルス取り込みを示すミトコンドリアが、隔離することができる Ca2 +の濃度を示します。そうしないと、Ca2 +-蛍光染料もカルシウム シグナル伝達、細胞内 Ca2 +濃度測定、次の Ca2 +流入やリリースでは、多光子励起などの調査に使用された緑のバインドCa2 +生体組織のイメージング。

Ca2 +の定量-ミトコンドリアの膨潤による腫れを 200 mM ATR、CaCl2添加による誘導もことができます。コントロールとしてミトコンドリアは 1 mm CsA を開く mPTP を抑制測定前に、5 分間インキュベートでした。までの研究は、ミトコンドリアの膨潤14の割合の関数として吸光度の較正曲線を示した。それは 1 mM 0.1 mM ルテニウム赤、CsA を報告され、腫れが完了したときは、反応で新鮮なミトコンドリア (0.5 mg/mL) の等量を追加ことができます。CsA とルテニウム赤たて追加ミトコンドリアで開く mPTP を抑制することができます、検量線は腫れてミトコンドリアとミトコンドリアの膨潤以外15の両方を示します。Ca2 +過負荷時にミトコンドリアの膨潤のプロトコルはまた Ca2 +の効果的かつ直接測定-mPTP オープニングを誘発します。

以上 50 年前に Ca2 +哺乳類ミトコンドリアによっておよび他の高等脊椎動物の輸送の発見以来のメカニズムとミトコンドリアのカルシウム流出と流入の機能に多くの調査がずっとあります。ミトコンドリアの Ca2 +細胞、高速モードまたは RaM、およびリアノジン受容体 (mRyR)16ミトコンドリアの Ca2 +吸収メカニズムが含まれています。我々 は、することができます上記の試金は評価 Ca2 +-単にかつ効果的にミトコンドリアの機能を関連します。

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Disclosures

X. 太陽監督実験です。魏の李は、実験を行った。陳張及び X 太陽を書いた紙。

Acknowledgements

本研究は、山東省卓越した科学者 (JQ201421) と NSFC (81371226) からの助成金の助成金からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

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References

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