Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Neuroscience

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Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

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Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

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Abstract

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca2 + Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca2 + Konzentration vermittelt werden. Ca2 + Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca2 + führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca2 + werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca2 +bewerten-mitochondriale Funktionen.

Introduction

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca2 + von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese1phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca2 + einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca2 + schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca2 +. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca2 + auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-2. Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca2 + mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-3. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-trigged mitochondriale Schwellung.

Ca2 + Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca2 + Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca2 + Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca2 + durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren6. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca2 +-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten7. Ca2 +-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca2 + Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen8verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca2 + Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca2 + Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca2 + wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca2 + 9nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.

Nach Ca2 + Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca2 + in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca2 +Messen-mitochondriale Schwellung10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung12, ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.

Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.

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Protocol

1. Isolation von Mitochondrien

Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 - 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden.

  1. Samen etwa 3 x 106 SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht behalten.
    Hinweis: mindestens 1-2 x 107 SH-SY5Y Zellen für jedes Assay Isolierung erforderlich sind.
  2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit etwa 1 mL Eis kaltem PBS in einer Kulturschale 10 cm Zelle 3 Mal zu.
  3. Fügen Sie neue 1 mL Eis kaltem PBS in 10 cm Zelle Kulturschale und kratzen Sie die adhärenten Zellen in eine neue 1,5 mL Tube. Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bei 4 ° C.
  4. Während der Zentrifugation bereiten Sie 5 mL mitochondriale Isolierung Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethanesulfonic Säure), 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) ergänzt mit 50 μL der Protease-Inhibitoren Lager Lösung (100 X Konzentration; 1 EDTA-freie Tablette aufgelöst in 500 µL DdH2O).
  5. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer. Inkubieren der 1,5 mL Tube für 30 min auf Eis.
  6. Lösen Sie die suspendierten Zellen mit einer Glas-Homogenisator (15-25 Schläge) rauf und runter manuell auf Eis.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen, wenn Zellen homogenisiert werden. Zählen die intakte Zellen und entblößten Kerne von Mikroskop optisch und bestätigen, dass > 90 % Zelle Bruch aufgetreten.
  7. Übertragen Sie das Homogenat in einem 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die Ablagerungen (Kerne und verbleibenden intakten Zellen) zu entfernen.
  8. Übertragen den überstand in ein neues 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min 4 ° C.
  9. Den überstand zu übertragen, zu einem neuen Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 15 min 4 ° C.
  10. Entfernen des Überstands und das Pellet mit Mitochondrien mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer Aufschwemmen.
  11. Zentrifugieren Sie die Lösung für 15 min bei 14.000 x g 4 ° C um die Mitochondrien auszufällen.
  12. Das daraus resultierende Mitochondrien Pellet muss ständig auf Eis und Nukleinsäuretablette in 50-100 μl KCl Medien (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM Malate, und 2 μM Rotenon, pH 7,4) entsprechend dem Pellet-Volumen vor jedem Arsch ay.
  13. Verwenden Sie 5 μL der mitochondrialen Lösung zur Messung der mitochondrialen Proteinkonzentration von standard BCA-Test, Messung der OD562 mit einer Platte Leser13.

2. Bestimmung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen

  1. Bereiten Sie die KCl-Medien und fügen Sie die Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, eine Endkonzentration von 0,5 μM vor dem Experiment.
  2. 1 mL der isolierten Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien mit 0,5 μM Ca2 +Transfer-grünen fluoreszierenden Farbstoff in jedem 6-Well-Platte auch verbindlich.
  3. Inkubieren Sie die Mitochondrien und die Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff in der 6-Well-Platte bei Raumtemperatur geschützt vom Umgebungslicht für 1 min. hinzufügen 4 μL Aliquote eines 20 mm CaCl2 -Lösung (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, Glutamat 5 mM, 5 mM-Malat, pH 7,4) zu jedem 6-Well-Platte verzichten nun mit Hilfe den automatischen Einstellung 200 Nmol Ca2 +/mg mitochondrialen Proteins einzuführen.
  4. Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Spektrometer, um die Fluoreszenz-Änderungen zu überwachen alle 3 s 2 min mit einer Wellenlänge von Erregung von 506 nm und einer Emissionswellenlänge von 531 nm. Die Platte ist ausgestattet mit schütteln bei 600 u/min für 3 s zwischen den Lesungen von Software (Abbildung 1) gesteuert.
  5. Fügen Sie eine zusätzliche 4 μL aliquoten 20 mM CaCl2 -Lösung in jede Vertiefung und überwachen den Fluoreszenz Änderungen alle 3 s für 2 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Fluoreszenz mit der Zeit zunimmt.
    Hinweis: Mitochondrien sind mit der zusätzlichen Ca2 + gekennzeichnet durch die erhöhte Aufnahme Fluoreszenz gefordert. Wenn die mPTP geöffnet wird, steigt die Fluoreszenz mit der Zeit.
  6. Interpretieren Sie den Gesamtbetrag von Ca2 + hinzugefügt, bis die mPTP als Ca2 + Rückhaltevermögen öffnet.

3. Ermittlung der Ca 2 +-induzierten mitochondrialen Schwellung

  1. Bereiten Sie die KCl-Medien vor dem Experiment.
    1. Übertragen Sie 1 mL isolierte Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien gut in jedes 6-Well-Platte.
  2. Fügen Sie 10 μl 20 mm CaCl2 wässrige Lösung (500 Nmol/mg mitochondrialen Proteins) in mitochondrialen Proteins mitochondriale Schwellung auslösen.
  3. Aufzeichnen den Rückgang der Extinktion bei 540 nm alle 3 s auf einer Mikrotestplatte Reader Software für 10 min (Abbildung 2) gesteuert. Die Fluoreszenz-Änderungen werden durch den Zuzug von gelösten Stoffen durch die innere mitochondriale Membran verursacht.
    Hinweis: Die verminderte Absorption bei 540 nm entspricht den geschwollenen Mitochondrien. Wenn der Leser keine Abnahme der Absorption beachten, kann eine längere Intervall lesen oder Lesezeit übernommen werden.

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Representative Results

Ca2 + Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis:
Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca2 + (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung, wurden in den isolierten Mitochondrien hinzugefügt. Die Höhe der insgesamt zusätzlichen Ca2 + bis mPTP Öffnung durch eine doppelte Erhöhung oberhalb der Grundlinie Fluoreszenz angezeigt wurde als Ca2 + Rückhaltevermögen interpretiert. Unsere Daten zeigten, dass die mitochondriale Ca2 + Rückhaltevermögen bei BKA Behandlung viel höher als die ATR-Gruppe. Diese Daten bestätigen die geeignete Messung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen (Abbildung 3).

Ergebnisse der Vertreter von Ca2 +-induzierten mitochondrialen Schwellungen:
Ergebnisse wurden als prozentuale Veränderung im Extinktion bei 540 nm im Vergleich zu ersten Absorption während eines Zeitraums von 10 Minuten nach der Zugabe von CaCl2. Ausgelöst durch die Zugabe von Ca2 + (500 Nmol/mg mitochondrialen Proteins), die verminderte Absorption überwacht bei 540 nm angegeben die mitochondriale Schwellungen. Mit der Behandlung des BKA oder ATR zeigte die Eichkurve einen leichten oder starken Rückgang im Vergleich zum ursprünglichen Extinktion, darauf hinweist, dass BKA mPTP öffnen während ATR erleichtern kann, die mPTP öffnen (Abbildung 4) hemmen kann.

Figure 1
Abbildung 1: die Softwareeinstellungen für mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: die Softwareeinstellungen für mitochondriale Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Die Messung von Ca2 + Rückhaltevermögen. Extra-mitochondriale Ca2 + in isolierten Mitochondrien wurde gemessen fluorimetrisch mit Ca2 +-grünen fluoreszierenden Farbstoff in Anwesenheit von 5 μM Bongkrekate (BKA), 1 μM Atractyloside (ATR) oder Blindkontrolle (CON) verbindlich. Spuren von Ca2 + Retention durch isolierte Mitochondrien mit BKA, ATR und CON wurden gemessen bei 506 nm (Ex) und 531 nm (Em) auf einer Mikrotestplatte Leser. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Die Messung von Ca2 +-induzierten mitochondrialen Schwellung. Ca2 +-induzierten mitochondrialen Schwellung der SH-SY5Y in Anwesenheit von 5 μM Bongkrekate (BKA), 1 μM Atractyloside (ATR) oder Blindkontrolle (CON) äußerte sich als ein Prozentsatz verringert Kalibrierkurve des ersten Extinktion bei 540 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.

Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellmembran unter dem Mikroskop zu beobachten und zu vermeiden den Bruch der Mitochondrien-Membran. Jedoch die isolierte Mitochondrien, die wir erhalten sind grobe Mitochondrien und gereinigte Mitochondrien erhalten Sie über 1,0 M / 1.5 diskontinuierliche Saccharose Farbverlauf. Die biologischen Eigenschaften von Mitochondrien in lebenden Zellen sind mehr wie jene in Vivo als in isolierten Mitochondrien wegen der Konzentrationen von der Medium-Komponenten, die die Mitochondrien umgeben. Die mitochondriale Ca2 + Rückhaltevermögen oder Ca2 +-ausgelöste mitochondriale Schwellung Assay wurde erregt Bedingungen bestimmt. Zur Bestimmung der funktionierenden Mitochondrien kann 5 mM Succinat als Atemwege Substrate anstelle von Glutamat und Malat6hinzugefügt werden.

Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff (bindet Ca2 + mit einer Affinität von 4,29 ± 0,67 mM), eignet sich eher mikromolaren Konzentrationen von Ca2 + als höhere Affinität Farbstoffe z. B. Fura-2 7messen. Nach der Zugabe von Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, die Inkubation muss weniger als 240 S. aufeinander folgende Ergänzungen von Ca2 + (variierend von 25-200 Nmol) wurden in 1-3 min Abständen injiziert werden. Die kalibrierungskurven zeigen die Konzentrationen von Ca2 + , die die Mitochondrien nicht absondern, können unter Angabe der mitochondrialen Aufnahme von Impulsen von Ca2 +. Andernfalls die Ca2 +-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff diente auch Kalzium Signalisierung Untersuchungen, wie intrazelluläre freie Ca2 + Konzentrationsmessung, folgenden Ca2 + Zustrom und Release und multiphoton Erregung Imaging von Ca2 + in lebendes Gewebe.

Zur Bestimmung von Ca2 + -induzierten mitochondrialen Schwellung, Schwellung kann auch mit dem Zusatz von 200 mM ATR und CaCl2induziert werden. Als Kontrolle könnte Mitochondrien mit 1 mM CsA für 5 Minuten vor der Messung inkubiert werden, die die mPTP Öffnung gehemmt. Frühere Untersuchungen zeigten Kalibrierkurven der Absorption als Funktion des Prozentsatzes der geschwollenen Mitochondrien14. Es wurde berichtet, dass 1 mM CsA, 0,1 mM Ruthenium rot, und ein gleiches Volumen an frischen Mitochondrien (0,5 mg/mL) kann in der Reaktion hinzugefügt werden, wenn Schwellungen abgeschlossen war. Da CsA und Ruthenium rot die Öffnung in den frisch hinzugefügten Mitochondrien mPTP hemmen können, zeigen die Kalibrierkurven die geschwollenen Mitochondrien und nicht geschwollen Mitochondrien15. Das Protokoll der mitochondrialen Schwellung auf Ca2 + Überlastung ist auch eine effektive und direkte Messung von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung.

Seit der Entdeckung der Transport von Ca2 + von Mitochondrien von Säugetieren und anderen höheren Wirbeltieren vor mehr als 50 Jahren gab es viel Forschung über die Mechanismen und Funktionen der mitochondrialen Kalzium Ausfluss und Zustrom. Die mitochondriale Ca2 + Aufnahme Mechanismen enthalten die mitochondriale Ca2 + Uniporter, der rapid-Modus oder RaM und die Ryanodin-Rezeptor (mRyR)16. Die Assays wir kann beschriebenen bewerten Ca2 +-im Zusammenhang mit mitochondrialen Funktion, einfach und effektiv.

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Disclosures

X. Sonne überwacht die Experimente. Wei Li durchgeführt die Experimente. Chen Zhang und X. Sun schrieb die Zeitung.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Grant der herausragende Wissenschaftler von Shandong (JQ201421) und Zuschuss von NSFC (81371226).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

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References

  1. Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239, (11), 3971-3980 (1964).
  2. Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28, (5-6), 285-296 (2000).
  3. Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
  4. Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60, (9), 575-590 (2008).
  5. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, (5), 335-344 (2009).
  6. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  7. Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162, (1-2), 149-152 (1993).
  8. Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89, (1), 91-100 (1999).
  9. Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38, (1), 43-47 (2006).
  10. Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279, (33), 34682-34690 (2004).
  11. Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426, (2), 297-315 (2000).
  12. Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11, (7), 822-831 (1990).
  13. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175, (1), 231-237 (1988).
  14. Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187, (2), 255-259 (1994).
  15. Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274, (44), 31734-31739 (1999).
  16. Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787, (11), 1291-1308 (2009).

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