腺相关病毒和共聚焦显微镜对器官脑切片胶质细胞器的可视化和实时成像

Neuroscience

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Summary

形成突促进了快速动作电位的传播和神经元的存活。这里描述的是一个协议的胶质特异表达荧光蛋白在器官脑切片与后续的延时成像。此外, 一个简单的程序, 可视化不髓鞘提出。

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Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

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Abstract

神经元依赖于形成突的电绝缘和营养支持。尽管突的重要性, 目前用于研究神经元的先进工具, 只是部分被胶质研究人员所接受。细胞类型特异性染色的病毒转导是一个有用的方法来研究活体细胞动力学。本文介绍了一种在转录控制下利用腺相关病毒 (AAV) 携带线粒体靶向荧光蛋白的基因对器官脑切片中胶质线粒体进行可视化的协议髓鞘碱性蛋白启动子。包括制作器官冠状小鼠脑切片的协议。一个过程中的线粒体的延时成像, 然后跟随。这些方法可以转移到其他的细胞器, 可能是特别有用的研究细胞在髓鞘。最后, 我们描述了一个现成的技术, 可视化的活体切片不髓鞘的共聚焦反射显微镜 (核心)。核心不需要额外的设备, 并可以用于识别髓鞘鞘在现场成像。

Introduction

大脑的白质是由髓鞘包裹的神经细胞轴突组成的, 这是由突所形成的一种专门的扩展等离子体膜。髓鞘是需要快速和可靠的动作电位传播和长期生存的髓轴突, 并失去髓鞘可能导致神经功能障碍。尽管它们的重要性, 与神经元和星形胶质细胞相比, 突的性质是不为人知的。因此, 为研究突而开发的工具越来越少。

活体成像的细胞器, 如线粒体, endoplasmatic 网 (ER) 或不同的水泡结构, 可以用来研究动态变化, 随着时间的推移。传统上, 生活突的成像已经在单一1,2中执行。然而, 突在单养不显示致密髓鞘, 因此, 器官或急性脑切片可能是一个更好的选择, 在研究的本地化和运动的细胞器。由于髓轴突与周围髓鞘之间的短距离, 髓鞘内的小细胞器和蛋白质的定位可能具有挑战性。因此, 光是显微免疫程序就没有空间分辨率来区分髓鞘内的细胞器和髓轴突的细胞。这可以通过病毒转导与细胞型特异性促进剂驱动的器官靶向荧光蛋白的基因来解决。其优点是细胞特异性和稀疏表达式, 能够准确地评估器官的定位和动态。转基因动物也可以用来实现这样一个以细胞为目标的特定表达式3。然而, 转基因动物的生产和维护费用昂贵, 通常不提供可通过病毒方法实现的稀疏表达。

本文所描述的方法使用的病毒转导突与线粒体靶向荧光蛋白 (dsred 或绿色荧光蛋白, gfp) 驱动的髓鞘碱性蛋白促进剂 (细胞内 dsred 或绿细胞-gfp), 以可视化器官脑切片中的胶质线粒体。此外, 另一种荧光蛋白在细胞质中的表达 (无论是 gfp 与 dsred 或 tdtomato 与美图-gfp 一起使用) 是用来使细胞形态学的可视化, 包括髓鞘鞘的细胞质。该协议包括制作器官脑切片的程序 (由 De Simoni 和 Yu 描述的修改后的协议版本, 20064,5)。然后我们描述了用于研究线粒体运动的延时成像程序。这个过程使用一个直立的共焦显微镜与连续交换成像介质, 设置, 使易于应用的药物或其他媒体的变化, 在成像。延时成像程序可以在任何共聚焦显微镜下进行, 有些额外的设备用于维持活体切片, 如下所述。该协议还包含一些优化成像和减少光的提示。

最后, 本文介绍了一种快速、简便的共焦反射显微镜 (CoRe) 可视化不髓鞘的方法。这可能是有用的, 以确定髓鞘鞘的实时成像。近年来, 一些技术已经发展到图像髓鞘不需要任何染色, 但其中大多数需要特定的设备和专长6,7,8。这里描述的过程使用髓鞘的反射的物产并且是一个简单的 single-excitation 波长版本光谱共焦反射显微镜 (比分, 几 laser 波长被结合形象化髓鞘)9. 核心可以在具有 488 nm 激光和 470-500 nm 带通发射过滤器或可调谐发射过滤器的任何共焦显微镜上进行。

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Protocol

此处所述的程序已得到挪威动物研究局的批准。文件末尾的材料清单中提供了消耗品和其他所需设备的供应商和目录号.

1. 器官切片的制备

注意: 此食谱在产后日 7-9 (p7-9) 使用两只小鼠幼崽, 在两个六良好的培养皿上分别产生24器官切片。除非另有说明, 所有的程序应在无菌罩和 nitril 或乳胶手套使用。只应使用细胞培养级成分.

  1. 高压釜瓶, 解剖工具 (1 大剪刀, 1 小剪刀, 1 大平铲, 1 小圆形和锐削刮刀和1钳, 详见材料清单), 玻璃管, 吸管提示和切片准备用纸巾巾.
  2. 作为一半的玻璃管应与大开口一起使用, 从而打破狭窄的一端.
    1. 用菱形划线笔 (如果可用) 在吸管的周围, 在玻璃开始缩小的位置下方进行评分。然后将吸管的尖头端放到腈手套或类似的地方。在将吸管推到工作台上时, 小心地折断笔尖.
    2. 然后通过摩擦一张砂纸或轻微地在本生燃烧器上熔化来钝断端。破碎的管是用来转移切脑切片与破碎的结束变成橡胶灯泡和大开放的一端接触解决方案/切片.
      注意: 这不是在无菌罩中完成的, 可以提前几天完成.
  3. 准备区域性菜.
    注意: 这可以在切片前的前一天完成, 或者在切片前至少2小时进行。
    1. 对聚四氟乙烯 (PTFE) 膜 (#34; 五彩纸屑和 #34;) 进行消毒。使用两个无菌钳, 从周围的蓝色塑料件中去除单一的纸屑和消毒两次浸泡到一个培养皿含有96% 乙醇 (乙醇)。然后在无菌大的培养皿中放置五彩纸屑晾干.
      注: 五彩纸屑是亲水聚四氟乙烯膜类似的膜在文化插入。使用五彩纸屑有助于实时成像, 因为单片可以很容易地从插入到显微镜设置, 通过举起带钳子的五彩纸屑 (参见 4.8. 详细信息)。或者, 大脑切片可以被培养没有五彩纸屑 (其中切片将直接附着在膜的文化插入)。在这种情况下, 膜插入必须用手术刀切割, 将切片转移到显微镜浴.
    2. 将1毫升培养基 (试剂和 #39 的配方) 添加到六良好的文化菜肴中.
    3. 在每个井中放置一个培养基, 使用无菌钳。避免在插入和培养基之间产生气泡.
      注意: 为了省钱和环境, 可以重用区域性插入。这可以通过在蒸馏的 h 2 o (dH 2 o) 中进行彻底冲洗, 然后在70% 乙醇中进行孵化, 至少为24小时, 直到重新使用。在准备新的文化时, 在紫外线 (UV) 光下的细胞培养板中干燥15-30 分钟的插入物.
    4. 将两个 (灭菌和干燥) 五彩纸屑放在每个区域性插入上。将五彩纸屑放在插入的边缘以获得最小的重叠.
    5. 将板材放在37和 #176 的细胞培养箱中; C 与 5% CO 2 .
  4. 带锰气体 (95% O 2 /5%CO 2 ) 的气泡冷剥离介质 (试剂和 #39; 表)。为使溶液不育, 将管从气瓶连接到无菌注射器过滤器 (0.22 #181; m 孔径大小).
    1. 将注射器过滤器的另一端与无菌玻璃吸管连接的无菌管耦合。将玻璃吸管放在溶液中, 盖上膜, 打开煤气。把解剖介质放在冰上.
  5. 准备解剖/切片区域.
    注意: 理想情况下, 此程序应在无菌罩中完成。如果这是不可能的, vibratome 可以留在工作台上。在这种情况下, 建议使用头发网和口罩。
    1. 使用单刃刀片, 切出一个矩形片 (大约2厘米 x 0.5 厘米) 的琼脂糖凝胶 (配方中的试剂和 #39; 表), 并胶水到 vibratome 阶段, 这样长的一面面对 vibratome 刀片.
    2. 用70% 乙醇清洁所有表面和 vibratome 部件, 并用蒸压纸巾擦拭.
      注意: 重要的是, 所有与脑组织接触的碎片都是完全干燥的, 因为乙醇会损伤细胞.
    3. 将无菌刀片附在 vibratome 上, 并在 vibratome 具有此功能时进行振动检查.
    4. 用蒸压纸巾、四小培养皿、圆边手术刀、2玻璃管和橡胶灯泡、两个开放式玻璃管 (见 pt 1.1) 和超级胶水 (喷乙醇), 将蒸气的解剖工具放在引擎盖上.
    5. 将冒泡的解剖介质倒入 vibratome 的船中, 并放入四小的培养皿中.
      注意: 这一步只应在解剖前立即进行, 因为从这一点上的培养基不起泡或保持在冰上.
  6. 解剖和安装大脑.
    注意: 要获得健康切片, 必须快速准确地完成此步骤。需要一些练习。
    1. 安乐动物 #1 由 neckor 的脱位根据地方指南和然后斩首用大剪刀.
    2. 使用小而锋利的剪刀, 通过从颈部到鼻部进行矢状切口, 并将头骨拉到一旁, 快速去除皮肤。
      1. 沿矢状缝合线切开, 其次是额骨内侧侧切口和 lamboid 缝合 (大脑和小脑之间的边界).
      2. 使用镊子弯曲打开每个侧面的头骨。颅神经通过插入一个圆形的, 锋利的刮刀在大脑的腹侧和轻轻地移动刮刀侧向大脑切断.
    3. 使用单刃刀片使冠状切口侧到小脑.
      注意: 此切口将确定切割切片的角度。因此, 它应该是在一个直的角度.
    4. 将大脑从头骨中翻转出来, 放入含有解剖介质的小培养皿中.
    5. 重复步骤 1.6.1-1.6.4 为动物 #2, 并将此大脑置于第二个培养皿中.
      注意: 动物不是无菌的。在引擎盖的一侧进行解剖, 然后移动到另一个, 干净的一侧, 一旦大脑被从头骨上移除.
    6. 更换手套
    7. 将大脑连接到 vibratome 阶段: 在安装的琼脂糖凝胶前面的舞台上添加一层薄薄的超级胶水。保持脑 #1 与一个大平的刮刀与新鲜切割 (尾) 侧接触刮刀和腹侧面对 (和尽可能接近) 琼脂糖凝胶.
      1. 然后轻轻地将大脑放在胶水上, 用镊子把它从刮刀上推下来。确保留出足够的空间给大脑 #2.
        注意: 重要的是, 大脑是很好的连接到舞台上, 但没有过多的胶水, 因为这可能会阻碍切割.
    8. 在安装完大脑 #1 后立即使用大的刮刀在大脑顶端添加一些解剖培养基。这将保持大脑湿润, 硬化胶水, 防止它粘在大脑的两侧.
    9. 对大脑 #2 重复步骤1.6.7 和 1.6.8.
    10. 将舞台连接到 vibratome 的船上.
  7. 剪切230和 #181; m 厚的冠状片, 振幅为 1-1.5 mm, 频率为85赫兹, 速度为0.2 毫米/秒. 在1.4 毫米侧和2.1 毫米尾管之间收集切片, 以 Bregma.
    1. 在每个切片被使用开放式玻璃管 (pt 1.1) 剪切后收集切片。将切片转移到含有解剖介质的培养皿中。使用圆形手术刀将切片切成两块, 将两个半球分开.
  8. 当剪切所有切片时, 将切片放入区域性菜式中.
    1. 从孵化器中取出培养皿 (一次).
    2. 使用开放式玻璃管, 小心地将一片片移到每个五彩纸屑上.
      注: 切片应平放在中间的五彩纸屑。这需要一些技巧。然而, 如果一些切片是不完美的, 最好离开他们比花时间试图移动他们, 因为它是重要的是尽快把所有的切片到孵化器.
    3. 使用玻璃吸管 (尖端) 轻轻移除多余的介质而不触及切片.
      注意: 在孵化过程中, 切片不应浸入液体中。因此, 过量的培养基必须吸气, 这样切片才会暴露在空气中 (一层介质的薄膜仍会覆盖切片)。保持在液体中的切片通常不健康或死亡 (4 和我们的观察).
    4. 一旦所有的五彩纸屑都有一片, 就把盘子移回孵化器.
    5. 对菜 #2 重复步骤 1.7.8. 1.8.4.
  9. 更改区域性媒体.
    注意: 这应该做切片后的一天 (1 天的体外, DIV1), 然后每2-3 天。
    1. 在水浴或孵化器中预热培养基.
    2. 在无菌罩中, 使用真空吸或有无菌尖端的常规吸管从每口井吸取培养基。这是通过轻轻地把盘子 (大约30度), 并把吸管尖端放置在文化插入边缘.
    3. 删除大约800和 #181; L 从每一个井 (只留下足够的培养基, 以保持底部的插入覆盖在中等)。然后, 使用一个干净的吸管, 增加800和 #181; 我的预热介质对每一个井。然后把盘子放回细胞培养箱里.

2。病毒转导

  1. 购买或使增值与感兴趣的质粒, 如前面所述 10 , 11 。 注: 本议定书描述使用 AAV 血清型 2/8 (AAV 2/8) 携带线粒体靶向 dsred 或 GFP 作为一个记者基因的转录控制下的髓鞘碱性蛋白启动子 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred 或 AAV2/8 MBP_mito_GFP) 可视化胶质线粒体。AAV 2/8 携带 GFP 或 tdtomato 作为报告基因驱动的一般 CAG 启动子 (AAV 2/8 CAG_GFP 或 AAV 2/8 CAG_tdtomato) 是用来可视化胶质细胞质。因此, AAV2/8 MBP_mito_dsred 与 AAV 2/8 CAG_GFP 的结合在突给出了红色的线粒体和绿色的细胞质, 而 AAV2/8 MBP_mito_GFP 和 AAV 2/8 CAG_tdtomato 给出了绿色的线粒体和红色的细胞质。在其他地方 13 中更详细地描述了这些构造.
  2. 在7天的体外 (DIV7), 传感器突与增值.
    注意: 按照安全规定使用增值。确保有适当的培训和生物安全级别的批准要求。以下各点应在第二类生物安全柜中使用手套和实验室大衣进行。这里描述了 AAV 在切片皮层区的应用, 因为这是显示最佳恢复的区域。
    1. 在预热 (37 和 #176; C) 培养基中稀释 AAV。稀释大约2和 #215; 10 9 基因组拷贝/毫升 (GC/毫升), 以获得一个稀疏转导的突, 使影像的单个细胞在切片。但是, 应采用不同的滴进行试验, 以确保转突的密度适合于特定的实验。如果使用两个不同的增值, 则应将它们混合在同一解决方案中并同时添加到切片中.
    2. 添加大约1.3 和 #181; 我把 AAV 稀释到每个切片: 确保吸管尖端的外部是干燥的。吸管1.3 和 #181; L 稀释 AAV, 并保持在皮质上方的吸管, 尽可能接近不接触的切片与吸管尖端 (约1毫米远).
    3. 然后慢慢地把溶液从吸管中推出来。当溶液接触到切片时, 将吸管尖端移到皮质上, 在整个皮层区域传播溶液.
      注意: 此程序应尽可能快地完成, 以避免将切片的长度保持在必要的时间内。做到这一点的时候, 并把第一道菜放回孵化器, 然后开始在菜 #2。在不损伤组织的情况下获得满意的 AAV 分布需要一些练习和稳定的手.
  3. 如果在细胞实验室中有直立荧光显微镜, 则可以通过在显微镜下放置该盘来检查蛋白质表达的时间.
    注: 不应将该盘放在孵化箱外超过 2-5 分钟.

3。延时成像

注意: 只要荧光标记的表达式级别足够并且切片看起来很健康 (通常是 DIV11-14), 就可以进行成像.

  1. 确保正确设置显微镜、灌注和加热, 使气泡成像解决方案加热并可以进入和退出浴缸.
    注: 浴室存在各种解决方案。这里介绍了一个简单的版本。
    1. 通过钝针 (弯曲在〜45和 #176;), 通过蓝光粘性/有趣的粘性连接到浴缸的两侧, 从而使浴缸的 in-and 插座.
    2. 确保油管从一瓶连续起泡的成像解决方案, 通过蠕动泵, 通过加热管的加热器单元, 然后到入口注射器针在浴缸中.
    3. 将另一根管子连接到注射器针头插座。这管然后通过蠕动泵和回到瓶子的成像解决方案 (或一个废物瓶).
  2. 气泡成像解决方案 (试剂和 #39; 表中的配方) 与锰气体.
    注意: 这应该是 started 至少在15分钟前进行成像, 并在整个实验中继续.
  3. 打开蠕动泵和加热器, 并通过浴缸运行解决方案以获得最佳的浴温度 (37 和 #177; 0.5 和 #176; C)。确保连接到温度单位的温度计传感器被浸入浴缸溶液中.
  4. 打开显微镜、萤光灯和合适的激光器.
  5. 为示例设置合适的光照路径.
    注: 这将视显微镜设置和探头而异。关于如何使用共焦显微镜的一般知识是必需的, 不会在这里处理.
  6. 使用适当的放大倍数和数值孔径的水浸泡物镜。我们使用40x 水浸泡计划-色差目标 (1.0).
  7. 打开针孔以实现大约 2-2.5 和 #181 的光学部分; m 用于延时视频。这就减少了在时间推移时线粒体移出焦点的现象.
  8. 将器官切片移至浴缸:
    1. 将一滴成像解决方案或培养基添加到小型塑料培养皿中.
    2. 在无菌罩中, 使用无菌钳将一器官片从膜上插入到下落。镊子只应触摸纸屑而不是片.
    3. 把盖子盖在培养皿上.
    4. 立即将含有其余切片的培养皿放回孵化器中.
    5. 将含有切片的培养皿带到显微镜下.
    6. 将切片转换为显微镜浴时关闭蠕动泵。首先, 用镊子把从培养皿中切片的纸屑搬到浴缸的顶部 (五彩纸屑会漂浮)。然后把镊子的两个小贴士放在五彩纸屑的两边, 这样他们就能触摸到五彩纸屑而不触及切片, 并将纸屑通过溶液推向浴缸的底部。把五彩纸屑放在浴缸中央.
    7. 使用镊子将紧锚 (竖琴) 放在五彩纸屑的顶端, 而不触及切片.
      注: 竖琴是一种马蹄形的铂锚, 用来防止在浴缸中漂浮或漂流的片状。对于急性切片, 细弦从竖琴的一端跑到另一侧 (类似于音乐竖琴)。对于器官片, 竖琴应该 stringless 和适合大小的五彩纸屑, 在这种方式, 它可以躺在上面的五彩纸屑, 而不触及切片.
    8. 将蠕动泵重新打开.
  9. 将目标降低到示例.
  10. 选择图像的单元格和区域.
    注意: 避免过度暴露在激光照射下的细胞, 因为这会引起细胞毒性 (见下面点的提示)。
    1. 使用目镜和荧光灯找到具有正确表达式的健康前瞻胶质。通常, 突有强烈的过度表达的荧光蛋白似乎不健康。不健康的突将具有点外观的过程, 而线粒体会出现碎片。在健康的突, 躯体和过程看起来平滑, 线粒体有不同的长度 (虽然通常比神经元和星形胶质细胞的短得多 13 , 14 , 15 ).
    2. 将感兴趣的单元格置于视图字段的中间.
    3. 使用和 #34; 生活和 #34; 在软件中的功能 (徕卡和蔡司显微镜) 识别屏幕上的单元格并选择感兴趣的区域, 例如, 包含几个主要进程或髓鞘的部分单元格, 或单个进程或髓鞘.
      注意: 要能够尽可能多地图像的过程/鞘, 选择包含在 x-y 方向相对平坦的过程的区域.
    4. 放大感兴趣的字段 (通常生成像素大小为 0.14-0.30 和 #181; m) 的图像.
    5. 使用和 #34; 区域和 #34; 工具, 在区域周围绘制一个矩形, 并选择仅扫描选定区域的选项。扫描时间, 因此激光曝光, 通过只扫描选定区域而减少.
      注意: 由于所需扫描的行数较短, 因此水平矩形区域的扫描速度比垂直区域要快。如果扫描垂直矩形区域, 则可以通过将扫描字段旋转90度 (使用旋转工具) 来减少扫描时间.
  11. 调整激光功率和增益以获得对线粒体的良好看法.
    注: 使用所需的最小激光功率。如果可能, 打开增益而不是增加激光功率。除了造成细胞毒性, 太高的激光功率将漂白的图像对象随着时间的推移, 因此需要进一步增加激光功率或增益扫描期间。所需的激光功率和增益将取决于表达水平和显微镜。用 LSM700 共焦显微镜, 我们使用 555 nm 激光器的功率为20-40 和 #181; w 到图像 dsred 或 tdtomato 和 488 nm 激光用于 20-30 和 #181; w 到图像 GFP (激光功率测量的背面光圈的目标)。增益是设置高的实时成像, 通常在 700-800 的范围内 GFP 和850-980 的 dsred 和 tdtomato。高增益可能会引起更多的背景噪音, 这是通过增加数字偏移量 (偏移值通常放置在0和15之间) 来消除的。在我们的经验中, 使用 MBP_mito_GFP 比 MBP_mito_dsred 提供更好的信噪比.
  12. 选择扫描速度.
    注意: 通过使用快速扫描速度和绘制小扫描区域来最小化扫描时间 (请参见下面的4.10.5 点)。也可以通过执行双向扫描来节省扫描时间。但是, 由于图像质量较差, 建议不要这样做.
  13. 设置定时录制的频率和持续时间, 例如, 在突中每2秒捕获一次图像, 总共20分钟用于线粒体成像.
    注意: 频率和持续时间应根据感兴趣对象的移动性来设定。更高的频率将暴露标本到更多的激光, 但快速移动的对象也需要更短的总持续时间的视频 ( 例如 神经元中的线粒体, 它的移动频率比线粒体在更频繁和更高的速度突, 通常每秒成像2分钟 16 ).
  14. 启动定时录制
    注意: 在记录过程中, 线粒体可能会移出焦点和/或漂移出成像区域。为了最大限度地减少震动和运动, 调整 in-and 插座的浴缸和减少泵的速度, 如果需要的话。焦点的微小变化通常仍然发生。因此, 在成像过程中需要对屏幕进行连续监控, 在录制过程中对焦点进行小的调整.
  15. 捕获整个单元格的 z 堆栈, 以便将来识别单元格和映像进程.
    注: 为了更好的解决, 针孔应复位到1通风单位的 z 栈.
  16. 可选: 可视化不髓鞘.
    注: 在突转与 (细胞质) GFP, 髓鞘通常可以确定为直行细胞质 (细胞质脊) 连接到一个主要进程 (见 图 2 a 和 B)。然而, 如果 GFP 的表达太弱或没有使用细胞质标记, 可以通过共聚焦反射显微镜 (核心) 来对髓鞘进行可视化。
    1. 在软件中设置一个新的光路径, 在 488 nm 处进行激光激发, 并捕获相同波长的发射光, 例如 470-500 nm。
    2. 调整激光功率和增益直到髓鞘可见 (参见强类 =xfig ">> 图 3 )。使用 LSM 510 元显微镜, 我们通常使用7和 #160 的激光功率; 12 和 #181; W (在目标的后孔径测量).
  17. 可选: 准备免疫的切片。
    1. 如果在免疫后必须标识映像单元格, 请捕获该单元格的低放大图像 (10x), 并通过绘制箭头或类似的图标来指示其在图像中的位置。为了帮助检测单元格, 建议还要绘制整个切片的手动映射, 以指示单元格的位置.
    2. 在室温下用4% 甲醛 (粉煤灰) 在振动筛上固定切片1小时.
      注意: 粉煤灰是有害的。使用防护性磨损, 只在通风罩上使用.
    3. 在 PBS 中稀释固定剂 1:10, 并在4和 #176; C 直到开始免疫组化, 如别处所述 17 .
      注意: 虽然切片可以留在稀释固定剂几个星期, 荧光可能褪色。建议在10天内进行免疫组化治疗.

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Representative Results

器官脑切片的培养和转如上所述, 显示了稀疏分布的皮质突表达 mito_dsred 和 GFP。免疫与抗体抗 Olig2 和碱性髓鞘证实, 表达特定于突 (图 1)。

对于活体成像, 转突是公认的几个平行运行的髓鞘鞘的特征形态学 (图 1图 2A)。通过在转突上执行延时成像, 可以监测主要过程和髓鞘 (图 2B-D) 中的线粒体运动。

在低 GFP 表达的细胞中, 髓鞘可以在活成像过程中通过照亮样品在 488 nm 和捕获发光 470-500 nm (图 3A) 中识别。这种共焦反射显微镜 (核心) 技术也工作在粉煤灰固定和 immunostained 组织, 虽然髓鞘出现变暗 (图 3B-C)。通过与抗髓鞘碱性蛋白抗体免疫, 我们发现接近100% 的髓鞘水平到成像平面 (由箭头指示,图 3B-C) 是可见的与核心, 而髓鞘垂直于视图的字段 (由星号表示,图 3B-C) 的位置更少或根本不可见。虽然几乎所有节间都是可视化的, 但许多节间距出现不连续, 鞘的小部分不可见 (图 3A插入)。髓鞘中的这些小的 "间隙" 可以通过三互补波长的成像来填充, so-called 分数为9

Figure 1
图 1:免疫组织化学证实, dsred 在突有选择性表达, 对 Olig2 和碱性髓鞘均具有免疫力。 图像来自培养的小鼠脑切片转与 (AAV2/8) dsred (红色, 线粒体标记) 和 CAG-GFP (绿色, 胞)。切片为髓鞘标记髓鞘碱性蛋白 (immunolabeled, 蓝) 和 Olig2 (胶质谱系细胞核标记, 品红)。(从引用13中修改的图)请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 在突中跟踪线粒体运动的时间推移成像.(A) 投影 z 堆叠 (光学部分10.35 µm) 的胶质转与 MBP_mito_dsred (红色线粒体) 和 CAG_GFP (绿色荧光)。(B) 同一个单元格的单个共焦图像 (光学截面1.04 µm)。正方形表示为时移成像 (C) 选择的区域, 并指示在 (D) 中绘制 kymographs (许姆) 的线。(C) 图像来自在不同时间点拍摄的 a 和 B 中的单元格的延时记录。移动的线粒体被表明 (红色箭头)。(D) 从 (B) 中所示的轨迹 Kymographs。固定的线粒体被视为直线垂直线, 移动的线粒体被视为对角线。正如可以看到在 kymographs, 并在时效图像 (C), 只有线粒体在主要过程中标记 Kymograph 1 (许姆 1) 正在移动。其他三 kymographs 的线粒体在延时记录期间是静止的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 不髓鞘的共聚焦反射显微镜 (核心) 的可视化.(a) 从活体器官脑切片的大脑皮层投射 z 堆叠 (光学切片10.35 µm)。在这里显示的胶质中的 GFP 表达 (绿色细胞体) 太暗淡, 无法识别主要过程和髓鞘。相反, 髓鞘被激发在 488 nm, 捕捉发光光在 470-500 nm (以洋红显示)。一些富含细胞质的 paranodes 的 GFP + 胶质可以看到在髓鞘节间 (箭头) 的提示。插入: 髓鞘的放大部分显示髓鞘形象化与核心出现 "参差不齐" 或不连续 (参见主要文本为细节)。(B-C)共聚焦图像从纹状体 (B) 和海马 CA1 (C) 的层 radiatum 的一个急性小鼠脑切片, 已固定在4% 粉煤灰和 immunostained 髓鞘碱性蛋白 (碱性)。Horisontal 髓鞘 (箭头) 是可见的与核心, 而鞘是垂直于视野 (星号) 是最经常不可见的。请单击此处查看此图的较大版本.

试剂 "表:请单击此处下载此文件.

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Discussion

此处描述的器官区域性的协议是由 De Simoni 和 Yu (2006)5所描述的协议的修改版本18 。下文概述了最重要的变化。培养基中添加了三个缓冲液, 在病毒转导和细胞培养基的变化过程中, 提高了孵化室外的切片成活率。纸屑的灭菌程序也发生了变化。虽然其他协议消毒五彩纸屑由灭菌, 我们不建议这样做, 因为它会导致几个五彩纸屑卷曲。避免使用卷曲的纸屑, 因为在这些片上生长的切片往往不太健康。我们的协议使用小鼠, 而不是老鼠, 并被修改, 以培养皮层而不是海马, 我们发现在更薄的切片 (230 µm vs 300 µm) 很好的工作。当鞘高峰在出生日附近 10-20 在老鼠和老鼠19, 培养由老鼠在 p7-9 (然后培养 11-14 天) 是优选的为研究形成突。在 11-14 天的体外, 文化中含有几个成熟的突与致密髓鞘13。在文化周期结束时, 由较年轻的老鼠组成的培养物将含有较少的成熟突, 而由较年长的老鼠所制作的文化更具挑战性, 以保持健康的20

制作器官切片的过程涉及几个关键步骤。大脑的解剖和安装, 以及把切片放在五彩纸屑上, 必须做得快, 需要一些技巧。通常, 第一次尝试使器官切片的文化是不太成功的, 但2-3 轮的实践应该足以获得技能, 创造健康的文化所需要的。在整个过程中保持无菌环境是很重要的, 以避免对文化的污染。此外, 在使用活细胞时, 必须确保正确的 pH 值和渗透的解决方案, 以保持细胞健康。因此, 这是一个很好的建议, 以检查渗透 (应该是 270-310 mOsm/千克) 和 pH 的所有解决方案, 在切片上使用, 特别是在做实验的第一次。文化和解剖解答为器官文化包含 ph 指示 (酚红色), 但黄色血清在文化媒介能给印象比实际 ph 值低。培养基中含有青霉素、链霉素和制, 以尽量减少感染的几率。因此, 建议在实验室中建立器官切片培养技术时使用这些抗生素和药物, 但在应用专家无菌技术后, 可以避免这种方法。目前的协议使用细胞形态学来评估细胞的生存能力。对于更定量的检查, 切片可以加载碘碘化物或类似的染料在其他地方描述21。然而, 重要的是要知道, 碘碘的发射光谱重叠与 dsred, tdtomato 和其他红色指标。碘碘化物和类似试剂的另一个限制是, 它们不容易进入切片的更深层, 从而限制了对细胞的活性的评估到最上层的单元格5

基因传递的方法多种多样。利用器官切片培养的 AAV 转导来可视化器的主要优点如下: AAV 转导与突转染方法相比, postmitotic 病毒的成功率更高.22。此外, 在器官文化中所有的脑细胞类型都存在, 而突有一个形态学类似于在体内, 包括致密髓鞘13。这是不同的突在单养, 缺乏与轴突的沟通, 从而不做致密髓鞘。成像在体外比较容易与在体内和提供更好的空间分辨率, 这是特别感兴趣的, 当成像小细胞器, 如线粒体。未来的研究将着眼于图像的在体内, 但面临着巨大的挑战, 由脂质丰富的髓鞘引起的光学畸变。此外, AAV 血清型取向和启动子特异性可能在体内体外条件13,23之间有所不同。在这里提出的协议, AAV2/8 MBP_mito_dsred 和 AAV2/8 MBP_mito_GFP 是用来可视化胶质线粒体。AAV 血清型2/1 也测试了 MBP_mito_dsred, 但感染了较低数量的突在器官切片 (没有显示)。AAV2/8 CAG_GFP 和 AAV2/8 CAG_tdtomato 用于可视化胶质细胞质。尽管使用一般 CAG 启动子为此, AAV 2/8 CAG_GFP 和 CAG_tdtomato 选择性感染突, 只有少数的星形胶质细胞和神经元被感染 (这些可以很容易地识别其特征形态)。突的这种选择性可能是由于 AAV 2/8 型血清型24的取向。然而, 对于细胞蛋白靶向表达, 更高的特异性达到了与碱性髓鞘或其他胶质特定的促进剂推荐。其他由我们 CAG_GFP 的血清型 AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, 其中大部分感染主要神经元和星形胶质细胞 (未显示)。

根据结构和实验条件, 需要对细胞转导进行修正。如果转细胞显得太暗淡, 尝试更长的时间在体外转导后增加表达。如果细胞出现明亮但不健康, 减少转导后的时间。如果细胞转很少, AAV 的浓度可以增加。然而, 也有可能是在体外转导时间过长, 转细胞已经死亡。对于这里使用的结构, 表达水平是最佳的 4-6 天后转导。在 7-8 天后转导, 细胞出现不健康, 与点的过程, 和10天后转导, 只有少数转细胞是可见的 (没有显示)。

本协议使用直立显微镜对器官切片进行实时成像。这是不同于大多数单一和 co-cultures, 通常使用倒置显微镜。这是不理想的使用倒置显微镜在这里, 因为切片必须然后用五彩纸屑面对向上, 这想必会导致切片是不太健康。直立显微镜的一个优点是有可能增加电生理的设置。此外, 使用泵改变介质意味着药物解决方案可以很容易地添加和删除在时间推移成像。水泵的缺点是在浴缸中保持振动和电流引起的焦点问题。在显微镜下, 细胞会逐渐变少健康.因此, 我们将切片放在显微镜下最多1小时。影像切片被丢弃 (特殊废料)。为了确保成像条件的最佳, 控制细胞的成像, 其中线粒体运动已经很好的特征, 应该并行运行。例如, 在轴突或树突中的线粒体运动可以通过换切片 AAV 2/1 Syn_mito_dsred (其中 dsred 表达由神经元特异的突启动子) 或 AAV 2/1 CAG_mito_dsred (随后免疫确认单元格标识)。线粒体运动的分析可以使用 ImageJ 中的多 kymograph 工具进行, 如别处所述25

在这里, 我们描述核心的可视化不髓鞘在实时成像。与比分9, 使用三励磁波长, 核心只使用一 (488 毫微米) 并且因而是更加简单的实施。在分数, 三波长每揭示不同的 "片断" 髓鞘并且一起给鞘的一个充分的图象。此外, 评分可用于检测髓鞘结构, 如细胞质袋。随着单波长使用的核心, 一个较不详细的看法和鞘可能出现颗粒状或不连续 (图 3)。然而, 核心可视近100% 的髓鞘, 是横向的视野。因此, 核心是有用的检测髓鞘, 但不是分析髓鞘结构或完整性。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

我们感谢琳达 Hildegard 博格森和 Magnar Bjørås 获得细胞实验室和设备, Janelia 分子生物学共享资源人员的质粒和病毒生产和公园 Vervaeke, 以协助激光功率测量。这项工作由挪威卫生协会资助, 挪威研究理事会和显微镜设备由 Norbrain 资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

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References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

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