Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Myelinating oligodendrocyter främja snabb aktionspotentialens spridning och neuronal överlevnad. Beskrivs här är ett protokoll för oligodendrocyte-specifika uttryck av fluorescerande proteiner i organotypic hjärnan skivor med efterföljande time-lapse imaging. Vidare presenteras en enkel procedur för att visualisera ofärgade myelin.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nervceller är beroende av att elektrisk isolering och trofiska stödja myelinating oligodendrocyter. Trots betydelsen av oligodendrocyter, har de avancerade verktygen som för närvarande används för att studera nervceller, endast delvis tagits av oligodendrocyte forskare. Cell typspecifika färgning av viral transduktion är en användbar metod för att studera levande organell dynamics. Detta dokument beskriver ett protokoll för att visualisera oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjärnan skivor genom transduktion med adeno-associerade virus (AAV) bär gener för mitokondriell riktade fluorescerande proteiner under transkriptionell kontroll myelin grundläggande protein arrangören. Det inkluderar protokollet för att göra organotypic koronalt mus hjärnan skivor. Ett förfarande för time-lapse avbildning av mitokondrier sedan följer. Dessa metoder kan överföras till andra organeller och kan vara särskilt användbart för att studera organeller i myelinskidan. Slutligen beskriver vi en lättillgänglig teknik för visualisering av ofärgade myelin i levande skivor av Confocal reflektans mikroskopi (CoRe). Kärnan kräver ingen extra utrustning och kan vara användbart för att identifiera myelinskidan under levande imaging.

Introduction

Hjärnans vita substansen består av nervcell axoner insvept i myelin, en specialiserad utökade plasmamembranet som bildas av oligodendrocyter. Myelin krävs för snabb och tillförlitlig aktionspotentialens spridning och långsiktiga överlevnad av myeliniserade axoner, och en förlust av myelin kan orsaka neurologisk dysfunktion. Trots sin vikt jämförs egenskaper för oligodendrocyter mindre kända med nervceller och astrocyter. Följaktligen har färre verktyg utvecklats för att studera oligodendrocyter.

Live avbildning av cell organeller som mitokondrier, endoplasmatic Retikulum (ER) eller olika vesikulär strukturer kan vara användbart för att studera dynamiska förändringar i organeller över tid. Avbildning av levande oligodendrocyter har traditionellt utförts i monokulturer1,2. Men oligodendrocyter i monokultur visar inte kompakt myelin och organotypic eller akut hjärnskada skivor kan därför vara ett bättre alternativ när man studerar lokalisering och förflyttning av organeller. Lokalisering av små organeller och proteiner i myelinskidan kan vara utmanande på grund av det korta avståndet mellan myeliniserade axon och den omgivande myelinskidan. Ljus mikroskopiska immunfärgning förfaranden ensam har således inte den rumsliga upplösningen att diskriminera mellan organeller i myelinskidan och i myeliniserade axon. Detta kan lösas genom viral transduktion med gener för organell-riktade fluorescerande proteiner drivs av cell typspecifika initiativtagare. Fördelarna är en cell-specifika och glesa uttryck, som möjliggör exakt bedömning av organell lokalisering och dynamik. Transgena djur kan också användas för att uppnå sådan en organell-riktade-specifika uttryck3. Produktion och underhåll av transgena djur är dock dyra och oftast erbjuder inte det glesa uttryck som kan uppnås genom viral metoder.

Den metod som beskrivs använder här viral transduktion av oligodendrocyter med mitokondrie-riktade fluorescerande proteiner (dsred eller grön fluorescerande proteinet, GFP) drivs av promotorn myelin grundläggande protein (MBP-mito-dsred eller MBP-mito-GFP) för att visualisera oligodendrocyte mitokondrier i organotypic hjärnan skivor. Dessutom används uttrycket av en annan fluorescerande protein i cytoplasman (GFP används tillsammans med mito-dsred eller tdtomato används med mito-GFP) för att aktivera visualisering av cellmorfologi, inklusive de cytoplasmiska fack i myelinskidan. Protokollet omfattar förfarandet för att göra organotypic hjärnan skivor (en modifierad version av protokollet beskrivs av De Simoni och Yu, 20064,5). Sedan beskriver vi time-lapse imaging proceduren för att studera mitokondriell rörelse. Proceduren använder en upprätt confocal Mikroskop med ett kontinuerligt utbyte av imaging medium, en setup som möjliggör enkel applicering av droger eller andra medelstora förändringar under imaging. Time-lapse imaging förfarandet kan utföras på någon confocal Mikroskop, med några extra utrustning för att upprätthålla levande skivor som beskrivs nedan. Protokollet innehåller också flera tips för att optimera imaging och minska fototoxicitet.

Slutligen beskrivs ett snabb och enkelt sätt att visualisera ofärgade myelin av Confocal reflektans mikroskopi (CoRe). Detta kan vara användbart för att identifiera myelinskidan under levande imaging. Under senare år har flera tekniker utvecklats till bild myelin utan någon färgning krävs, men de flesta av dessa kräver särskild utrustning och expertis6,7,8. Proceduren som beskrivs här använder myelinskidan reflekterande egenskaper och är en förenklad singel-magnetiseringen våglängd version av spektral reflektans Confocal microscopy (poäng, där laser flera våglängder kombineras för att visualisera myelin) 9. kärna kan göras på någon confocal Mikroskop som har en 488 nm laser och en 470-500 nm bandpassfilter utsläpp eller ett avstämbara utsläpp filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

de förfaranden som beskrivs här har godkänts av den norska djur forskning myndigheten. Leverantörer och katalognummer för förbrukningsvaror och övriga krävs utrustning är tillgängliga i listan material i slutet av dokumentet.

1. förberedelse av Organotypic skivor

Obs: detta recept använder två musungar vid postnatal dag 7-9 (p7-9), som ger 24 organotypic skivor uppdelade på två sex-väl kultur rätter. Om inte annat anges, alla förfaranden bör göras i en steril huva och nitril eller latex handskar bör användas. Endast cell kultur kvalitet ingredienser bör användas.

  1. Autoklav flaskor, dissektion verktyg (1 stor sax, 1 liten sax, 1 stor platt spatel, 1 liten rundad och skärpt spatel och 1 pincett, se material lista för detaljer), glas pipetter, pipettspetsar och vävnad våtservetter för slice beredning.
  2. Som hälften av glas pipetter bör användas med den stora öppningen, bryta av den smala änden.
    1. Poäng med en diamant scriber pennan (om tillgängligt) runt pipetten precis nedanför den punkt där glaset börjar förträngning. Sedan placera den spetsiga änden av pipetten i en nitrilhandske eller liknande. Bryt försiktigt av spetsen genom att böja pipetten samtidigt trycka det mot en arbetsbänk.
    2. Sedan trubbiga trasiga slutet genom att gnugga på en sand papper eller smälta något på en bunsenbrännare. De trasiga pipetterna används överföra skär hjärnan skivor med trasiga slutet förvandlas till gummi lampan och den stora öppna änden röra lösning/skivor.
      Obs: Detta är inte gjort i en steril huva och kan göras flera dagar i förväg.
  3. Förbereda kultur rätter.
    Obs: Detta kan göras dagen före skivning eller minst 2 timmar innan skivning.
    1. Sterilisera polytetrafluoreten (PTFE) membran (" konfetti "). Använd två steril pincett för att ta bort enstaka konfetti från omgivande blå plast bitar och sterilisera genom att doppa två gånger i en petriskål som innehåller 96% etanol (EtOH). Sedan låg konfetti plant i en steril stora petriskål torka.
      Obs: Konfetti är hydrofil PTFE membran liknar membranen i kultur skären. Användning av konfetti aids den levande imaging eftersom enda skivor kan lätt överföras från skäret till Mikroskop setup genom att lyfta konfetti med pincett (se 4.8. för detaljer). Alternativt kan hjärnan skivor vara odlade utan den konfetti (där skivor kommer fäster direkt på membranet i kultur skäret). I det här fallet membran skäret måste skäras med en skalpell överföra segmentet till Mikroskop badet.
    2. Tillsätt 1 mL odlingsmedium (recept i reagenser ' tabell) till varje brunn av de sex-väl kultur rätterna.
    3. Förlägger en kultur infoga i varje brunn med hjälp av steril pincett. Undvika luftbubblor mellan skäret och odlingssubstratet.
      Obs: För att spara pengar och miljö, det är möjligt att återanvända de kultur-skären. Detta kan göras av noggrann sköljning i destillerat H 2 O (dH 2 O) följt av inkubation i 70% EtOH under minst 24 h till återanvändning. När du förbereder för ny kultur, torka skären i en cell kultur plattan under ultraviolett (UV) ljus under 15-30 min.
    4. Placera två (steriliserad och torra) konfetti på varje kultur skären. Placera konfetti mot kanterna av skären att få minimal överlappning.
    5. Sätta plattorna i cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2.
  4. Bubbla kalla dissektion medium (recept i reagenser ' tabell) med bioxide gas (95% O 2 /5%CO 2). För att hålla lösningen steril, Anslut röret från gastuben till en steril spruta filter (0,22 µm porstorlek).
    1. Par i andra änden av sprutan filter till en steril slang ansluten till en steril glas pipett. Placera glas pipetten i lösningen, täck med parafilm och slå på gasen. Hålla dissektion mediet på ice.
  5. Förbereda området dissektion/skivning.
    Obs:, Proceduren bör helst göras i en steril huva. Om detta inte är möjligt, kan vibratome lämnas på en arbetsbänk. I detta fall är det rekommenderat att använda en hårinpackning för net och ansikte.
    1. Med en enda kant rakblad, klipp ut en rektangulär bit (ca 2 cm x 0,5 cm) agarosgel (recept i reagenser ' tabell) och limma detta på vibratome scenen så att långsidan vänd bladet vibratome.
    2. Rengör alla ytor och de vibratome delarna med 70% EtOH och torka med Ånghärdad vävnad våtservetter.
      Obs: Det är viktigt att alla delar som kommer i kontakt med hjärnvävnaden är fullständigt torra eftersom EtOH kan skada cellerna.
    3. Tillmäter vibratome ett sterilt rakblad och utföra vibrationer kontrollera om vibratome har denna funktion.
    4. Plats Ånghärdad dissektion verktyg i huven tillsammans med Ånghärdad vävnad våtservetter, fyra petriskålar av små, runda-kant skalpell, 2 glas pipetter med gummi lökar, två fast glas pipetter (se punkt 1.1) och super lim (besprutas med EtOH).
    5. Häll bubblade dissektion medium i vibratome båten och in i de fyra små Petriskålarna.
      Obs: Detta steg bör endast göras omedelbart före dissektion eftersom medium från denna tidpunkt inte är bubblade eller hålls på ice.
  6. Analysera och mount hjärnor.
    Obs: För att få friska skivor, detta steg måste göras snabbt och exakt. Det krävs lite övning.
    1. Avliva djur #1 av luxerad neckor enligt lokala riktlinjer och sedan halshugga med stora saxen.
    2. Med små, vassa saxar, snabbt ta bort huden genom att göra ett sagittalt snitt från halsen till näsan och dra åt sidan att avslöja skallen.
      1. Skär längs sagittal suturen, följt av laterala snitt över inre delen av pannben och lamboid suturen (gränsen mellan storhjärnan och lillhjärnan).
      2. Använd pincett för att böja öppna skallen på varje sida. Kranialnerver är avskurna från hjärnan genom att infoga en rundad, skarpa spatel under den ventrala sidan av hjärnan och försiktigt flytta spateln sidled.
    3. Använda en enda kant rakblad för att göra en koronala rostralt till lillhjärnan.
      Obs: Denna styckningsdel kommer att bestämma vinkeln som skärs i skivor. Det bör därför göras på en rak vinkel.
    4. Flip hjärnan ur skallen och i en liten petriskål innehållande dissektion medium.
    5. Upprepa steg 1.6.1.-1.6.4. för djur #2 och plats denna hjärna i en andra Petri maträtt.
      Obs: Djuren är inte steril. Utföra dissektion på ena sidan av huven och sedan flytta till andra, ren sida när hjärnan har avlägsnats från skallen.
    6. Ändra handskar.
    7. Bifoga hjärnan till vibratome Stadium: lägga till ett tunt lager av superlim på scenen precis framför den monterade agarosgel. Håll hjärnan #1 med en stor platt spatel med det nyklippt (kaudala) sida att röra spateln och den ventrala vänd (och vara så nära som möjligt till) agarosgel.
      1. Sedan försiktigt placera hjärnan på limmet genom att trycka den av spateln med en pincett. Se till att lämna tillräckligt med utrymme för hjärnan #2.
        Obs: Det är viktigt att hjärnan är väl kopplade till scenen, men utan överdriven lim, eftersom detta kan hindra styckning.
    8. Omedelbart efter montering av hjärnan #1, Använd stora spateln för att lägga till några droppar av dissektion medium ovanpå hjärnan. Detta kommer att hålla hjärnan fuktig, härda limmet och förhindra att det fastnar på sidorna av hjärnor.
    9. Upprepa steg 1.6.7 och 1.6.8. för hjärnan #2.
    10. Bifoga scenen på båten vibratome.
  7. Skär 230 µm tjock koronalt skivor med en amplitud av 1-1,5 mm, en frekvens på 85 Hz och en hastighet på 0,2 mm/s. samla skivor ungefär mellan 1,4 mm rostralt och 2,1 mm kaudalt till Bregma.
    1. Samla skivor efter varje skiva har kapats med fast glas pipetter (pt. 1.1). Överföra skivor till en petriskål innehållande dissektion medium. Använda en rundad skalpell skära skivor i två bitar, dela upp de två halvkloten.
  8. När alla skivor är slipade, placera skivor i kultur rätter.
    1. Ta kultur skålen (en i taget) ur ruvmaskinen.
    2. Använda fast glas pipetter, noggrant överföra ett segment till var och en av konfetti.
      Obs: Skivor bör ligga platt i mitten av konfetti. Detta kräver en del skicklighet. Dock om vissa skivor inte är perfekt, det är bättre att lämna dem än att spendera tid att försöka flytta dem eftersom det är viktigt att få alla skivor i inkubatorn så fort som möjligt.
    3. Använda glas pipett (spetsiga änden) att varsamt ta bort överflödig medium utan att vidröra slice.
      Obs: Skivor bör inte vara nedsänkta i vätska under ruvningen. Överskjutande medel måste således vara aspirerade sådan att skivor utsätts för luft (en tunn film av medium kommer fortfarande täcka skivor). Skivor som förblir nedsänkt i vätska kommer vanligtvis vara ohälsosamt eller dö (4 och våra observationer).
    4. Flytta skålen tillbaka i inkubatorn när alla konfetti har en cirkelsektor.
    5. Upprepa steg 1.7.8.-1.8.4. för maträtt #2.
  9. Ändra odlingssubstratet.
    Obs: Detta bör göras dagen efter skivning (dag 1 in vitro DIV1) och sedan varje 2-3 dagar.
    1. Värm odlingsmedium i ett vattenbad eller inkubatorn.
    2. i en steril huva, använda vakuum sug eller en vanlig pipett med en steril spets för att aspirera odlingsmedium från varje brunn. Detta görs genom att försiktigt tipping skålen (av ca 30 grader) och placera pipettspetsen vid kanten av kultur skäret.
    3. Ta bort cirka 800 μl från varje brunn (lämnar bara tillräckligt medium för att hålla botten av skäret omfattas i medium). Sedan, med ren pipett tillsätt 800 µL föruppvärmd mediets till varje brunn. Placera sedan rätterna tillbaka i cell kultur inkubatorn.

2. Viral transduktion

  1. köp eller göra AAVs med en plasmid av intresse, som tidigare beskrivits 10 , 11.
    Obs: Det här protokollet beskriver användningen av AAV serotyp 2/8 (2/8 AAV) bär mitokondriell riktade dsred eller GFP som en reporter gen under transkriptionell kontroll av myelin grundläggande protein arrangören 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred eller AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) att visualisera oligodendrocyte mitokondrier. AAV 2/8 bär GFP eller tdtomato som reporter gen drivs av allmänna CAG arrangören (AAV 2/8 CAG_GFP eller AAV 2/8 CAG_tdtomato) används för att visualisera oligodendrocyte cytoplasman. Således, kombinationen av AAV2/8 MBP_mito_dsred med AAV 2/8 CAG_GFP ger röda mitokondrier och gröna cytoplasman i oligodendrocyter, medan kombinerar AAV2/8 MBP_mito_GFP och AAV 2/8 CAG_tdtomato ger gröna mitokondrier och röda cytoplasman. Konstruktioner beskrivs i mer detalj någon annanstans 13.
  2. Dag 7 in vitro-(DIV7), transduce oligodendrocyter med AAVs.
    Varning: Följ säkerhetsföreskrifterna för att arbeta med AAVs. Se till att ha lämplig utbildning och biosäkerhet nivå godkännande krävs. Följande punkter bör utföras i klass II biosäkerhet skåp med handskar och labbrock. Här beskrivs tillämpningen av AAV till området cortex i skivor, eftersom detta är det område som visar den bästa återhämtningen.
    1. Dilute AAV i förvärmda (37 ° C) odlingsmedium. Spädningar runt 2 × 10 9 genomet kopior/mL (GC/mL) rekommenderas för att få en gles transduktion av oligodendrocyter som möjliggör avbildning av enstaka celler inom segmentet. Dock, en pilot som använder olika antikroppnivåer bör göras för att säkerställa en täthet av sensorik oligodendrocyter som är lämplig för specifika experiment. Om två olika AAVs används, de bör vara blandade i samma lösning och läggas till segmentet samtidigt.
    2. Tillsätt omkring 1.3 µL utspädd AAV till varje segment: Kontrollera utsidan av pipettspetsen är torr. Pipettera 1.3 µL utspädd AAV och Håll pipetten ovanför cortex, så nära som möjligt utan att röra på segmentet med pipettspetsen (ca 1 mm bort).
    3. Tryck sedan långsamt lösning ur pipetten. När lösningen berör segmentet, flytta pipettspetsen över cortex att sprida lösningen över området hela cortex.
      Obs: Detta förfarande bör göras så fort som möjligt för att undvika att hålla skivor av huven längre än nödvändigt. Gör detta på en maträtt vid tidpunkten och sätta den första skålen tillbaka i inkubatorn innan du börjar på maträtt #2. Att få en bra fördelning av AAV utan skada vävnaden kräver lite övning och en stadig hand.
  3. Om ett upprätt fluorescens Mikroskop finns i cell labbet, proteinuttryck kan kontrolleras under tiden i kultur genom att placera skålen under lupp.
    Obs: Skålen inte bör hållas ur inkubatorn för mer än 2-5 minuter.

3. Time-lapse Imaging

Obs: avbildning kan utföras när uttrycksnivåerna av fluorescerande markörer är tillräcklig och skivor ser frisk (vanligtvis DIV11-14).

  1. Se till att den Mikroskop, perfusion och uppvärmning är inställda så att bubblade avbildningslösning värms och kan ange och avsluta badet.
    Obs: Finns olika lösningar för bad chambers. En enkel version presenteras här.
    1. Gör in- och utlopp av badet av trubbiga spruta nålar (böjd vid ~ 45°) som är kopplade till sidorna av badet av blu-tack/kul tack.
    2. Se till att slangen går från en flaska kontinuerligt bubblade tänkbar lösning, via den peristaltiska pumpen, genom värme röret värmare enheten, och sedan till inlopp sprutans nål i badet.
    3. Anslut en annan tube till sprutans nål utlopp. Detta rör sedan går via den peristaltiska pumpen och tillbaka till flaskan av tänkbar lösning (eller en avfallsflaskan).
  2. Bubbla imaging lösning (recept i reagenser ' tabell) med bioxide gas.
    Obs: Detta bör vara staRTed minst 15 minuter innan imaging och fortsätta under hela försöket.
  3. Tur på Peristaltisk pump och värmare och kör lösningen genom badet att erhålla optimala bad temperatur (37 ± 0,5 ° C). Se till att termometern sensorn ansluten till temperaturenheten är nedsänkt i Bad lösningen.
  4. Slå på mikroskopet, fluorescens lampa och lämpliga lasrar.
  5. Uppsättning upp en lämplig ljus väg för provet.
    Obs: Detta kommer att variera beroende på mikroskopet setup och sond. Allmänna kunskaper om hur man använder mikroskopet confocal krävs och kommer inte att behandlas här.
  6. Använda ett vatten nedsänkning mål med lämplig förstoring och numeriska bländaröppningen (na). Vi använder en 40 x vatten nedsänkning plan-apochromat mål (n.a. 1.0).
  7. Öppna hål att uppnå en optisk avsnitt på cirka 2-2,5 µm för time-lapse video. Detta minskar förekomsten av mitokondrier flyttar ur fokus under time-lapse.
  8. Överföring organotypic skiva till badet:
    1. Lägg en droppe av tänkbar lösning eller odlingssubstrat till en liten plast petriskål.
    2. i en steril huva, Använd steril pincett att överföra en organotypic skiva från membranet infoga till droppa. Tången ska endast röra konfetti och inte skiva.
    3. Sätta på locket på petriskål.
    4. Omedelbart sätta kultur skålen som innehåller resten av sektorerna tillbaka i inkubatorn.
    5. Föra petriskål som innehåller segment till mikroskopet.
    6. Stäng av peristaltiska pumpen när du överför skiva till Mikroskop bad. Använd först tången för att lyfta konfetti med skiva från petriskål till toppen av badet (konfetti kommer flyta). Sedan placera två tips på tången på varje sida av konfetti så att de vidrör konfetti utan att vidröra slice och skjut konfetti genom lösningen till botten av badet. Centrera konfetti i mitten badet.
    7. Använd pincett att placera hold-down ankaret (harpa) ovanpå konfetti utan att vidröra slice.
      Obs: En harpa är en hästskoformade platina ankare som används för att förhindra segmentet från flytande eller drivande i badet. För akut skivor köra tunna strängar från ena sidan av harpa till den andra (som liknar en musik harpa). För organotypic skivor, harpa bör vara mindre och passa storleken på konfetti på ett sådant sätt att det kan lägga ovanpå konfetti utan att vidröra slice.
    8. Aktivera peristaltiska pumpen igen.
  9. Sänka målet ner till provet.
  10. Välj cell och regionen bild.
    Obs: Undvik överdriven exponering av celler till laserljus kan orsaka cell toxicitet (se tips i punkterna nedan).
    1. Använd okularen och lysröret för att hitta en frisk oligodendrocyte med det rätta uttrycket. Oligodendrocyter som har en stark överuttryck av fluorescerande protein visas normalt, ohälsosamma. Ohälsosamma oligodendrocyter måste processer med ett blobby utseende, och mitokondrierna visas fragmenterad. I friska oligodendrocyter, de soma och processer visas slät och mitokondrier har olika längder (även om vanligtvis mycket kortare än i nervceller och astrocyter 13 , 14 , 15).
    2. Placera cellen sevärdheter i mitten av synfältet.
    3. Användning av " live " funktion i programvaran (för Mikroskopen Leica och Zeiss) att identifiera cellen på skärmen och välja ett område av intresse, t.ex. en del av cellen som innehåller flera primära processer eller myelin slidor, eller en enda process eller myelinskidan.
      Obs: För att kunna bild så mycket av de processer/slidor som möjligt, välja områden som innehåller processer som låg relativt platta i x-y riktning.
    4. Zooma in på fältet av intresse (vanligtvis producerar en bild med pixelstorlek på 0,14 - 0.30 µm).
    5. Med den " regioner " verktyg, rita en rektangel runt området och väljer att skanna endast den valda regionen. Scanning tid, och därmed laser exponering, minskas genom att bara Skanna den valda regionen.
      Obs: Vågräta rektangulära områden ska genomsökas snabbare än vertikala regioner på grund av kortare antalet skannade rader som behövs. Om en lodrät rektangel region skannas den skanning tid kan minskas genom roterande fältet scan 90 grader (med roteringsverktyget).
  11. Justera laser makt och vinning för att få en bra bild på mitokondrierna.
    Obs: Använd minimal laser kraften som behövs. Om möjligt, Vrid upp vinst i stället för ökande lasereffekt. Förutom att orsaka cell toxicitet, kommer alltför hög lasereffekt blekmedel avbildade objekt över tid, vilket kräver en ytterligare ökning av lasereffekt eller få under avsökningen. Det krävs laser makt och vinning beror på nivån uttryck och mikroskopet. Med en LSM700 confocal Mikroskop, vi använder en 555 nm laser vid en effekt av 20-40 µW till bild dsred eller tdtomato och en 488 nm laser används på 20-30 µW till bild GFP (laser power mätt vid tillbaka bländare av målet). Vinst ligger högt för levande imaging, vanligtvis i intervallet 700-800 för god Jordbrukarsed och 850-980 för dsred och tdtomato. Den hög förstärkningen kan orsaka vissa mer bakgrundsljud, som avlägsnas genom att öka digital offset (offset värden vanligtvis låg mellan 0 och 15). Vår erfarenhet med MBP_mito_GFP ger en bättre signal-brus än MBP_mito_dsred.
  12. Välj scanningshastighet.
    Obs: Minimera skanning tid genom att använda en snabb scanning hastighet och genom att rita en liten skanning region (se punkt 4.10.5 nedan). Det är också möjligt att spara söktiden genom att utföra en dubbelriktad scan. Men detta rekommenderas inte på grund av sämre bildkvalitet.
  13. Set frekvens och varaktighet av time-lapse inspelning, e.g. fånga bilder varannan sekund för sammanlagt 20 minuter för mitokondriell imaging i oligodendrocyter.
    Obs: Frekvens och varaktighet bör fastställas enligt rörlighet anmärker av intresserar. En högre frekvens kommer att utsätta preparatet för att mer laserljus, men snabbare-rörliga objekt kräver också en kortare total duration time-lapse video (t.ex. mitokondrier i nervceller, som flytta oftare och med en mycket högre hastighet än mitokondrier i oligodendrocyter, är normalt avbildas varje sekund för totalt 2 minuter 16).
  14. Starta time-lapse recording.
    Obs: Mitokondrierna kan flytta ur fokus eller glida ur regionen avbildad under inspelningen. För att minimera vibrationer och rörelse, justera in - och utlopp av badet och minska pumphastigheten om det behövs. Små förändringar i fokus oftast fortfarande uppstå. Således, kontinuerlig övervakning av skärmen under imaging krävs, med små justeringar i fokus under inspelningen.
  15. Fånga en z-stack i hela cellen för framtida identifiering av cellen och avbildas processen.
    Obs: För bättre upplösning, pinhole ska återställas till 1 luftiga enhet för z-stack.
  16. Tillval: visualisera ofärgade myelin.
    Obs: I oligodendrocyter sensorik med (Cytoplasmatisk) GFP, de myelin slidor kan oftast identifieras som raka linjer av cytoplasman (cytoplasmiska åsar) ansluten till en primär process (se figur 2 A och B). Dock om GFP uttryck är för svag eller en cytoplasmiska markör används inte, är det möjligt att visualisera myelinskidan confocal reflektans mikroskopi (CoRe) som förklaras här.
    1. Inrätta en ny ljusstrålen i programvaran med laser magnetiseringen på 488 nm och fånga utsänt ljus runt samma våglängd, t.ex. 470-500 nm.
    2. Justera laser power och få tills myelin är synlig (se exempel i < stark klass = ”xfig ”> figur 3). Använder ett LSM 510 Meta-Mikroskop, vi vanligtvis använder en lasereffekt för 7-12 µW (mätt vid öppningens tillbaka målet).
  17. Tillval: beredning av skivor för immunfärgning.
    1. Om cellen avbildad måste identifieras efter immunfärgning, fånga en låg förstoring bild (10 x) av cellen och ange dess plats i bilden genom att rita en pil eller liknande. För att underlätta identifiering av cellen, det rekommenderas att även rita en manuell karta över hela segmentet, som anger cellens.
    2. Fix skiva i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) på shaker för 1 timme i rumstemperatur.
      FÖRSIKTIGHET: PFA är skadligt. Använd skyddskläder och endast Använd i en ventilerad huv.
    3. Späd fixativ 1:10 i PBS och lämna vid 4° C tills start immunohistokemi som beskrivs på andra ställen 17.
      Obs: Även om skivor kan lämnas i utspädda fixativ för flera veckor, fluorescens kan blekna. Utför immunohistokemi inom 10 dagar efter fixering rekommenderas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Organotypic hjärnan skivor som var odlade och sensorik som beskrivits ovan visade en gles fördelning av kortikala oligodendrocyter uttrycka mito_dsred och god Jordbrukarsed. Immunfärgning med antikroppar mot Olig2 och MBP bekräftade att uttrycket var specifika för oligodendrocyter (figur 1).

För levande imaging, kunde sensorik oligodendrocyter identifieras av deras morfologi som är karakteristisk för flera myelin slidor parallellt (figur 1 och figur 2A). Genom att utföra time-lapse imaging på de transduced oligodendrocyter, är det möjligt att övervaka förflyttningar av mitokondrier i primära processer och myelin slidor (figur 2B-D).

I celler med låga GFP uttryck, myelinskidan kunde identifieras under levande imaging av lysande provet vid 488 nm och fånga utsänt ljus 470-500 nm (figur 3A). Denna Confocal reflektans mikroskopi (CoRe) teknik arbetade också på PFA fast och immunostained vävnad, även om myelin pälsar synts dimmer (figur 3B-C). Genom immunfärgning med antikroppar mot myelin grundläggande protein (MBP), fann vi att nästan 100% av myelin slidor om horisontella imaging mittplan (indikeras av pilspetsar, figur 3B-C) är synliga med kärna, medan myelin pälsar det låg vinkelrätt mot synfältet (markeras med asterisker, figur 3B-C) är mindre eller inte alls syns. Även om nästan alla internoder visualiseras, visas många internoder diskontinuerligt, med små delar av skidan inte är synlig (figur 3A infoga). Dessa små ”luckor” i myelin kan fyllas i av imaging med tre kompletterande våglängder, så kallade Poäng9.

Figure 1
Figur 1 : Immunohistokemi bekräftar att MBP-mito-dsred selektivt uttrycks i oligodendrocyter som är immun positiv för Olig2 och MBP.  Bilder är från hjärnbarken av odlade mus hjärnan skivor sensorik med (AAV2/8) MBP-mito-dsred (röd, mitokondriell markör) och CAG-GFP (grön, cytosol). Skivorna var immunolabeled för myelin markör Myelin grundläggande Protein (MBP, blå) och Olig2 (oligodendrocyte härstamning cell nuclear markör, magenta). (Figur modifierad från referens13) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Time-lapse imaging att spåra mitokondrie rörelse i oligodendrocyter. (A) projektion av z-stack (optisk avsnitt 10,35 µm) av oligodendrocyte sensorik med MBP_mito_dsred (röda mitokondrier) och CAG_GFP (grön fluorescens). (B) enda confocal bild (optisk avsnitt 1,04 µm) i samma cell. De linjer för att göra kymographs (kym) i (D) indikeras och torget anger regionen som valdes för time-lapse imaging (C). (C) bilder från time-lapse recording i cellen i A och B som tas vid olika tidpunkter. Rörliga mitokondrierna är indicerat (röda pilar). (D) Kymographs från banor som anges i (B). Stationära mitokondrier ses som raka vertikala linjer och rörliga mitokondrier ses som diagonala linjer. Som kan ses i kymographs och tidsförlopp bilderna i (C), är endast mitokondrierna i den primära behandla markerade Kymograph 1 (Kym 1) rörliga. Mitokondrierna i de andra tre kymographs står still under time-lapse inspelningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Visualisering av ofärgade myelin av Confocal reflektans mikroskopi (CoRe). (A) projektion av z-stack (optisk avsnitt 10,35 µm) från hjärnbarken för en levande organotypic hjärnan slice. Om GFP uttrycket i den oligodendrocyte som visas här (grön cell kropp) är för svagt för att identifiera primära processer och myelin slidor. I stället var myelin slidor visualiserat av magnetiseringen på 488 nm och fånga utsända ljus vid 470-500 nm (visas i magenta). Några av de cytoplasman-rika paranodes av den GFP + oligodendrocyte kan ses på tips av myelin internoder (pilar). Infoga: Förstorade delen av myelinskidan visar att myelin visualiseras med CoRe visas ”fläckvis” eller diskontinuerliga (se huvudtexten för detaljer). (B-C) Confocal bilder från striatum (B) och stratum radiatum av hippocampus CA1 (C) för en slice av akut mus-hjärna som har fastställts i 4% PFA och immunostained för myelin grundläggande protein (MBP). Horisontal myelin slidor (pilspetsar) är synliga med kärna, medan slidor som är vinkelrät mot synfältet (asterisker) syns oftast inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens Tabell: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet för att göra organotypic kulturer beskrivs här är en modifierad version18 i protokollet beskrivs av De Simoni och Yu (2006)5. De viktigaste förändringarna har varit som beskrivs nedan. Tris buffert läggs till odlingsmediet, vilket förbättrar överlevnaden av skivor när utanför inkubatorn under viral transduktion och ändra cellen mediets. Sterilisering förfarandet för konfetti ändras också. Medan andra protokoll sterilisera konfetti i autoklav, rekommenderar vi inte detta eftersom det kommer att orsaka flera av de konfetti att krypa. Undvik att använda böjda konfetti som skivor som odlas på dessa tenderar att vara mindre hälsosamt. Våra protokoll använder möss inte råttor och ändras till kultur cortex istället för hippocampus, som vi tycker fungerar bra med tunnare skivor (230 µm vs 300 µm). Som myelinisering toppar runt postnatal dag 10-20 i möss och råttor19, kulturer gjort från är möss på p7-9 (och sedan odlade i 11-14 dagar) optimala för att studera myelinating oligodendrocyter. 11-14 dagar in vitro-innehåller kulturer flera mogna oligodendrocyter med kompakt myelin slidor13. Kulturer som gjort från yngre möss kommer att innehålla färre mogen oligodendrocyter i slutet av perioden kultur, kulturer gjort från äldre möss har visat mer utmanande att hålla friska20.

Förfarandet för att göra organotypic skivor omfattar flera viktiga steg. Den dissektion och montering av hjärnor, samt att placera skivor på konfetti, måste göras snabbt och kräver en del skicklighet. Vanligtvis de första försöken att göra organotypic skiva kulturer är mindre framgångsrika, men 2-3 rundor av praxis bör vara tillräckligt för att förvärva de färdigheter som behövs för att göra friska kulturer. Det är viktigt att hålla en steril miljö under hela förfarandet för att undvika kontaminering av kulturer. Dessutom när du arbetar med levande celler, är det alltid nödvändigt att säkerställa rätt pH och osmolalitet lösningar att upprätthålla cell hälsa. Det är därför ett bra råd att kontrollera osmolalitet (bör vara 270-310 mOsm/kg) och pH-värdet i alla lösningar som finns på skivor, speciellt när man gör experiment för första gången. De kultur och dissektion lösningarna för organotypic kulturerna innehåller en pH-indikator (fenolrött), men den gula serumen i odlingsmediet kan ge ett intryck av en lägre än den faktiska pH. Odlingssubstratet innehåller Penicillin, Streptomycin och Nystatin för att minimera risken för infektion. Det rekommenderas därför att använda dessa antibiotika och antimykotika när du konfigurerar organotypic skiva kultur tekniken i labbet, men de senare kan undvikas när expert aseptisk teknik tillämpas. Det nuvarande protokollet använder cellmorfologi för att bedöma cellernas viabilitet. För en mer kvantitativ undersökning, kan skivor laddas med propidium jodid eller liknande färgämnen som beskrivs på andra ställen21. Det är dock viktigt att vara medveten om att emissionsspektrum propidium jodid överlappar dsred, tdtomato och andra röda indikatorer. En annan begränsning av propidium jodid och liknande reagenser är att de inte lätt in de djupare skikten av segmentet, vilket begränsar bedömning av cellernas viabilitet till det översta lagret av celler5.

Det finns en mängd metoder för gen leverans. De främsta fördelarna med att använda AAV transduktion organotypic skiva kulturer för att visualisera organeller är som följer: AAV transduktion har en bättre framgång för postmitotic oligodendrocyter jämfört med icke-virala transfection metoder22. Ytterligare, i organotypic kulturer alla hjärnan celltyper är närvarande, och oligodendrocyter har en liknande till att ses i vivo, inklusive kompakta myelinet13morfologi. Detta skiljer sig från oligodendrocyter i monokultur som saknar kommunikationen med axoner, och således gör inte kompakt myelin. Imaging i vitro är lättare som jämförs med i vivo och erbjuder en bättre rumslig upplösning, vilket är av särskilt intresse när imaging små organeller som mitokondrier. Framtida forskning syftar till att bilden i vivo, men ansikten som en stor utmaning med de optiska avvikelser orsakade av lipid-rika myelinskidan. Dessutom AAV serotyp tropism och arrangören specificitet kan skilja sig mellan i vivo och in vitro- villkor13,23. I protokollet presenteras här, används AAV2/8 MBP_mito_dsred och AAV2/8 MBP_mito_GFP för att visualisera oligodendrocyte mitokondrier. AAV serotyp 2/1 testades också med MBP_mito_dsred men infekterade ett lägre antal oligodendrocyter i organotypic skivor (visas inte). AAV2/8 CAG_GFP och AAV2/8 CAG_tdtomato användes för att visualisera oligodendrocyte cytoplasman. Trots att använda allmänna CAG arrangören för detta, AAV 2/8 CAG_GFP och CAG_tdtomato selektivt infektera oligodendrocyter, med endast ett litet antal astrocyter och nervceller smitta (dessa kan lätt identifieras av deras karakteristisk morfologi). Denna selektivitet för oligodendrocyter beror förmodligen på tropism av AAV 2/8 serotyp24. Dock för organell-riktade uttryck, högre cell-specificiteten uppnås med MBP - eller andra oligodendrocyte-specifika initiativtagare rekommenderas. Andra serotyper som testats med CAG_GFP av oss var AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, mest som infekterade främst nervceller och astrocyter (visas inte).

Beroende på konstruktionen och den experimentella förhållanden, kommer modifiering av den cell transduktion att behövas. Om de transduced cellerna visas för svagt, prova en längre tid i vitro efter transduktion att öka uttryck. Om cellerna visas ljusa men ohälsosamma, minska tiden efter transduktion. Om mycket få celler är sensorik, kan koncentrationen av AAV ökas. Det är dock också möjligt att in vitro-efter transduktion tiden är för lång och att sensorik celler har dött. För konstruktioner används här, uttrycksnivåerna var optimal 4-6 dagar efter transduktion. 7-8 dagar efter transduktion, celler verkade mindre friska, med blobby processer, och tio dagar efter transduktion, endast några transduced celler var synliga (visas inte).

Detta protokoll använder en upprätt Mikroskop för den levande avbildning av organotypic skivor. Detta skiljer sig från mest mono- och samtidig kulturer som vanligtvis använder ett inverterat Mikroskop. Det är suboptimalt att använda ett inverterat Mikroskop här eftersom skivor måste sedan omsättas med den konfetti uppåt, vilket förmodligen gör skivor vara mindre friska. En fördel med upprätt Mikroskop är möjligheten att lägga till elektrofysiologi i installationen. Dessutom innebär användning av en pump för att ändra medium att drogen lösningar enkelt kan läggas och bort under time-lapse bildtagning. En nackdel med pumpen är problem med att upprätthålla fokus orsakad av vibrationer och strömmar i badet. Under mikroskopet, cellerna blir gradvis mindrefriska. Vi håller därför skivor under lupp i högst 1 timme. Avbildad skivor slängs (farligt avfall). För att säkerställa imaging villkoren är optimala, bör imaging control cells, där mitokondrie rörelse kännetecknas redan väl, köras parallellt. För exempel, mitokondriell rörelse i axoner eller dendriter kan avbildas av transducing skivor med AAV 2/1 Syn_mito_dsred (som dsred uttryck drivs av neuron-specifika synapsin arrangören) eller AAV 2/1 CAG_mito_dsred (följt av immunfärgning till (bekräfta cellidentiteten). Analys av mitokondrie rörelse kan göras med verktyget flera kymograph i ImageJ som beskrivs på andra ställen25.

Här beskriver vi CoRe för visualisering av ofärgade myelin under levande imaging. Jämfört med betyg9, som använder tre excitation våglängder, CoRe använder endast en (488 nm) och är därmed enklare att genomföra. I Poäng avslöjar de tre våglängderna varje olika ”bitar” av myelinskidan och tillsammans ge en fullständig bild av skidan. Poäng kan dessutom användas för att identifiera myelinskidan strukturer såsom cytoplasmiska fickor. Med den enda våglängd används i CoRe, ges en mindre detaljerad vy och slidor kan visas granulerad eller diskontinuerliga (Fig. 3). Dock visualiserar CoRe nära 100% av myelin slidor övergripande synfältet. CoRe är således användbar för detektion av myelin slidor, men inte för analys av myelin strukturer eller integritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgements

Vi tackar Linda Hildegard Bergersen och Magnar Bjørås för åtkomst till cell lab och utrustning, Janelia molekylärbiologi delade resurs personal för plasmid och virus produktion och Koen Vervaeke för hjälp med laser power mätningar. Detta arbete finansierades av den norska Health Association, det norska forskningsrådet och mikroskopi utrustningen finansierades av Norbrain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11, (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics