Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neuroscience

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Summary

Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.

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Kennedy, L. H., Rinholm, J. E. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56237, doi:10.3791/56237 (2017).

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Abstract

Os neurônios dependem a isolação elétrica e suporte trófico de oligodendrócitos microambiental. Apesar da importância de oligodendrócitos, as ferramentas avançadas atualmente utilizadas para estudar os neurônios, apenas parcialmente foram tomadas por pesquisadores do oligodendrocyte. Células específicas do tipo de coloração por transdução viral é uma abordagem útil para estudar a dinâmica de organela ao vivo. Este artigo descreve um protocolo para a visualização de mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro por transdução com vírus adeno-associado (AAV), carregando genes mitochondrial proteínas fluorescentes alvo sob o controle transcricional de o promotor de proteína básica da mielina. Inclui o protocolo para fazer organotypic fatias de cérebro de rato coronal. Segue um procedimento para Time-Lapse de imagem de mitocôndrias em seguida. Esses métodos podem ser transferidos para outras organelas e podem ser particularmente útil para estudar organelas na bainha de mielina. Finalmente, descrevemos uma técnica prontamente disponível para visualização de mielina Imaculada em fatias vivos pela microscopia Confocal reflectância (núcleo). Núcleo não requer nenhum equipamento extra e pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo.

Introduction

Matéria de branco do cérebro é composta de axônios de células nervosas envolvidos em mielina, uma membrana de plasma estendida especializada formada pelos oligodendrócitos. Mielina é necessária para a propagação do potencial de ação rápida e confiável e sobrevivência a longo prazo dos dendritos, e uma perda de mielina pode causar disfunção neurológica. Apesar de sua importância, as propriedades de oligodendrócitos são menos conhecidas em comparação com os neurônios e astrócitos. Consequentemente, menos ferramentas foram desenvolvidas para estudar oligodendrócitos.

Viva de imagem das organelas celulares como mitocôndrias, retículo endoplasmatic (ER) ou diferentes estruturas vesiculares podem ser útil para estudar as mudanças dinâmicas nas organelas ao longo do tempo. Tradicionalmente, imagem latente de oligodendrócitos vivos foi realizada em monoculturas1,2. No entanto, oligodendrócitos em monocultura não exibir o compacto de mielina, e organotypic ou fatias de cérebro aguda podem, portanto, ser uma opção melhor, ao estudar o movimento de organelas e localização. Localização de pequenas organelas e proteínas na bainha de mielina pode ser desafiador devido à curta distância entre o dendritos axônio e a bainha de mielina circundante. Assim, procedimentos de imunocoloração microscópica luz sozinho não têm a resolução espacial para discriminar entre organelas na bainha de mielina e os dendritos axônio. Isso pode ser resolvido por transdução viral com genes para proteínas fluorescentes organela-alvo conduzidos pelos promotores de tipo específico de célula. As vantagens são uma expressão de célula específica e esparsa, que permite a avaliação precisa da localização da organela e dinâmica. Animais transgénicos também podem ser usados para atingir uma organela-alvo específicos de célula expressão3. No entanto, a produção e a manutenção de animais transgénicos é caros e geralmente não oferece a expressão esparsa que pode ser alcançada por métodos virais.

O método descrito aqui usa transdução viral de oligodendrócitos com proteínas fluorescentes mitocondrial-alvo (dsred ou verde proteína fluorescente, GFP) conduzido pelo promotor de proteína básica da mielina (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) para Visualizar mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro. Além disso, a expressão de uma outra proteína fluorescente no citoplasma (GFP usado junto com o mito-dsred ou tdtomato usado com mito-GFP) é usado para permitir a visualização da morfologia celular, incluindo os compartimentos citoplasmáticos da bainha de mielina. O protocolo inclui o procedimento para fazer fatias de cérebro de organotypic (uma versão modificada do protocolo descrito por De Simoni, Yu, 2006,4,5). Em seguida, descrevemos o procedimento da imagem latente lapso de tempo para estudar o movimento mitocondrial. Este procedimento usa um microscópio confocal ereto com uma troca contínua do meio da imagem latente, uma configuração que permite fácil aplicação de drogas ou outras alterações médias durante a imagem latente. O procedimento da imagem latente lapso de tempo pode ser executado em qualquer microscópio confocal, com algum equipamento extra para manter vivas as fatias conforme descrito abaixo. O protocolo também contém várias dicas para otimizar imagens e reduzir a fototoxicidade.

Por último, uma maneira rápida e simples para visualizar a mielina imaculada pela microscopia Confocal reflectância (núcleo) é descrita. Isso pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido desenvolvidas para mielina imagem sem qualquer coloração necessária, mas a maioria destes requerem específico equipamento e conhecimentos6,7,8. O procedimento descrito aqui usa as propriedades reflexivas da bainha de mielina e é uma versão simplificada de comprimento de onda único-excitação de microscopia de reflectância espectral de Confocal (Pontuação, no qual vários comprimentos de onda de laser é combinadas para visualizar mielina) 9. núcleo pode ser feito em qualquer microscópio confocal que tem um laser de 488 nm e um filtro de emissão 470-500 nm bandpass ou um filtro de emissão ajustável.

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Protocol

os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela autoridade norueguesa de pesquisa Animal. Fornecedores e números de catálogo para os consumíveis e outros necessários equipamentos estão disponíveis na lista de materiais no final do documento.

1. preparação de fatias de Organotypic

Nota: esta receita usa dois filhotes de rato no pós-Natal dia 7-9 (p7-9), que rendem 24 fatias de organotypic divididas em dois pratos de seis-poço de cultura. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos devem ser feitos em uma capa de estéril e luvas de nitrilo ou látex devem ser usadas. Devem ser usados apenas ingredientes de grau de cultura celular.

  1. Garrafas de autoclave, ferramentas de dissecação (1 tesoura grande, 1 pequena tesoura, 1 espátula plana grande, 1 pequena espátula arredondada e afiada e 1 fórceps, Ver os materiais de lista para obter detalhes), vidro pipetas, pontas de pipetas e lenços de tecido usados para a preparação de fatia.
  2. Como metade das pipetas de vidro devem ser usados com grande abertura, romper a extremidade estreita.
    1. Pontuação com um scriber do diamante pen (se disponível) em torno da pipeta apenas abaixo do ponto onde o vidro começa a estreitar. Então coloque a extremidade pontiaguda da pipeta em uma luva de nitrilo ou similar. Cuidadosamente, quebre a ponta dobrando a pipeta enquanto a empurra contra uma bancada de trabalho.
    2. Então sem corte final quebrado, esfregando um pedaço de papel da areia ou derreter ligeiramente em um bico de Bunsen. As pipetas quebradas são usadas para transferir o cérebro corte fatias com extremidade quebrada transformada-se o bulbo de borracha e abre o grande final tocar as solução/fatias.
      Nota: Isto não é feito em uma capa de estéril e pode ser feito de vários dias de antecedência.
  3. Preparar pratos de cultura.
    Nota: Isto pode ser feito no dia antes de cortar ou pelo menos 2 horas antes de cortar.
    1. Membranas de politetrafluoretileno (PTFE) esterilizar (" confetti "). Use duas pinças esterilizadas para retirar as peças de plástico azuis circundantes único confete e esterilizar mergulhando duas vezes em uma placa de Petri contendo 96% de etanol (EtOH). Em seguida, estabelecer confete flat em um prato de Petri estéril grande secar.
      Nota: O confetti são membranas PTFE hidrofílicas semelhantes das membranas nas inserções de cultura. O uso de confetes auxilia a imagem ao vivo porque única fatias podem ser facilmente transferidas da inserção para a configuração do microscópio, levantando o confetti com fórceps (ver 4.8. para obter detalhes). Alternativamente, as fatias do cérebro podem ser cultivadas sem o confetti (em que as fatias irão anexar diretamente para a membrana da inserção da cultura). Neste caso, a inserção da membrana deve ser cortada com um bisturi para transferir a fatia para o banho do microscópio.
    2. Adicionar 1 mL de meio de cultura (receita em reagentes ' tabela) para cada poço dos pratos bem seis cultura.
    3. Cultura de um lugar inserir em cada poço usando Pinças esterilizadas. Evitar bolhas de ar entre a inserção e o meio de cultura.
      Nota: Para economizar dinheiro e o ambiente, é possível reutilizar as inserções de cultura. Isso pode ser feito por lavagem completa em água destilada H 2 O (dH 2 O) seguida de incubação em 70% EtOH durante um período mínimo de 24 h até reutilização. Ao se preparar para uma nova cultura, secar as inserções em uma placa de cultura de células sob radiação ultravioleta (UV) luz de 15-30 min.
    4. Coloque dois confetti (esterilizado e seco) em cada uma das inserções da cultura. Coloque o confete para as bordas das pastilhas para sobreposição mínima.
    5. Colocar as placas na incubadora a 37 ° C com 5% CO 2 cultura celular.
  4. Meio de dissecação frio de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás bioxide (95% O 2 /5%CO 2). Para manter a solução estéril, conectar o tubo do cilindro de gás de um filtro de seringa estéril (tamanho de poros de 0,22 µm). Filtro
    1. par a outra extremidade da seringa a um tubo estéril conectado a uma pipeta de vidro estéril. Colocar a pipeta de vidro na solução, cobrir com parafilm e ligar o gás. Manter o meio de dissecação na Ice.
  5. Preparar a área de dissecação/fatiar.
    Nota: Idealmente, este procedimento deve ser feito em uma capa de estéril. Se isto não for possível, o vibratome pode ser deixada em uma bancada de trabalho. Neste caso, é recomendável usar uma máscara de rede e cara de cabelo.
    1. Usando uma única borda lâmina de barbear, cortar um pedaço retangular (aproximadamente 2 cm x 0,5 cm) de gel de agarose (receita em reagentes ' tabela) e colar isso no palco do vibratome, tal que o lado comprido enfrenta a lâmina vibratome.
    2. Limpe todas as superfícies e as partes vibratome com 70% EtOH e limpe-o com lenços de tecido autoclavados.
      Nota: É importante que todas as peças que estarão em contato com o tecido cerebral são completamente secas desde EtOH pode danificar as células.
    3. Anexar uma lâmina de barbear estéril para o vibratome e executar a verificação de vibração se o vibratome tem essa função.
    4. Ferramentas de dissecação autoclavado lugar no bairro juntamente com tecido autoclavado wipes, quatro pequenos pratos de Petri, um bisturi de ponta redonda, 2 pipetas de vidro com bulbos de borracha, duas pipetas de vidro Open-end (ver pt. 1.1) e super cola (pulverizada com EtOH).
    5. Pour médio borbulhados dissecação para o barco de vibratome e para os quatro pequenos pratos de Petri.
      Nota: Este passo só deve ser feito imediatamente antes de dissecação desde médio a partir deste ponto não é borbulhar ou mantido no gelo
  6. Montagem e dissecar cérebros.
    Nota: Para obter fatias de saudáveis, esta etapa deve ser feita rapidamente e com precisão. É necessário alguma prática.
    1. Eutanásia animal #1 pela luxação do neckor de acordo com as diretrizes locais e então decapitar com a tesoura grande.
    2. Usando pequenas, afiadas tesouras, rapidamente retire a pele, fazendo uma incisão sagital do pescoço ao nariz e retirá-para revelar o crânio.
      1. Corte ao longo da sutura sagital, seguida por incisões laterais na parte interior dos ossos frontal e a sutura lamboid (fronteira entre os hemisférios e cerebelo).
      2. Use pinça para dobrar aberto no crânio de cada lado. Os nervos cranianos são cortados do cérebro inserindo uma espátula arredondada, afiada sob o lado ventral do cérebro e suavemente movendo a espátula lateralmente.
    3. Usar uma lâmina única borda para fazer uma coronal corte rostral no cerebelo.
      Nota: Esta corte irá determinar o ângulo em que as fatias são cortadas. É, portanto, conveniente em um ângulo reto.
    4. Flip o cérebro fora do crânio e em um pequeno prato de Petri contendo meio de dissecação.
    5. Repetir passos 1.6.1.-1.6.4. para animal #2 e lugar este cérebro em uma segunda Petri dish.
      Nota: Os animais não são estéreis. Faz a dissecação de um lado da capa e em seguida, mova para o lado oposto, limpo uma vez que o cérebro tem sido retirado do crânio.
    6. Alterar luvas.
    7. Cérebro de anexar
    8. para vibratome fase: adicionar uma camada fina de super bonder no palco em frente do gel do agarose montado. Segure o lado do cérebro #1 com uma simples espátula grande com o recém cortadas (caudal) tocando a espátula e o revestimento do lado ventral (e sendo tão perto quanto possível) o gel de agarose.
      1. Em seguida, Coloque suavemente o cérebro para a cola por estendendo-os a espátula com um conjunto de pinças. Certifique-se de deixar espaço suficiente para o cérebro #2.
        Nota: É importante que o cérebro está bem conectado ao palco, mas sem excessiva colagem, como isto pode obstruir o corte.
    9. Imediatamente após a montagem do cérebro #1, use a espátula grande para adicionar algumas gotas de meio de dissecação em cima do cérebro. Isto manterá o cérebro húmido, endurecer a cola e evitar que grudem para os lados dos cérebros.
    10. Repita etapas 1.6.7 e 1.6.8. para cérebro #2.
    11. Anexar o palco sobre o barco de vibratome.
  7. Corte 230 µm coronal fatias grossas com uma amplitude de 1-1.5 mm, uma frequência de 85 Hz e uma velocidade de 0,2 mm/s. Collect fatias aproximadamente entre 1,4 mm rostral e caudal de Bregma 2,1 mm.
    1. Fatias coletar cortarem cada fatia usando pipetas de vidro Open-end (pt. 1.1). Transfira as fatias para uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Usar um bisturi arredondado para cortar as fatias em dois pedaços, dividindo os dois hemisférios.
  8. Quando todas as fatias são cortadas, coloque as fatias para os pratos de cultura.
    1. Tirar o prato de cultura (um de cada vez) a incubadora.
    2. Cuidadosamente usando as pipetas de vidro Open-end, transferir uma fatia para cada um dos papelinhos.
      Nota: As fatias devem deitado no meio do confete. Isto requer alguma habilidade. No entanto, se algumas fatias não são perfeitas, é melhor deixá-los do to gastar tempo tentando movê-los como é importante entrar todas as fatias da incubadora mais rápido possível.
    3. Usar uma pipeta de vidro (extremidade pontiaguda) para remover suavemente o excesso de meio sem tocar a fatia.
      Nota: Fatias não devem ser mergulhadas em água durante a incubação. Assim, o excesso de meio deve ser aspirado tal que as fatias são expostas ao ar (uma fina película de médio ainda vai cobrir as fatias). Fatias que permanecem imersos no líquido serão geralmente insalubre ou morrer (4 e nossas observações).
    4. Mover o prato de volta na incubadora, uma vez que todos os papelinhos tem uma fatia.
    5. Repita etapas 1.7.8.-1.8.4. prato #2.
  9. Alterar o meio de cultura.
    Nota: Isto deve ser feito no dia seguinte (dia 1 in vitro, DIV1) de corte e em seguida a cada 2-3 dias.
    1. Pré-aqueça o meio de cultura em banho-maria ou incubadora.
    2. Em um capuz estéril, usar sucção à vácuo ou uma pipeta regular com uma ponta estéril para aspirar o meio de cultura de cada poço. Isto é feito delicadamente derrubando o prato (por cerca de 30 graus) e colocando a ponta da pipeta na borda da inserção da cultura.
    3. Remover aproximadamente 800 µ l de cada poço (deixando apenas suficiente médio para manter a parte inferior da inserção da coberta no meio). Em seguida, usando uma pipeta limpa, adicione 800 µ l do meio pré-aquecido a cada poço. Em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora de cultura celular.

2. Transdução viral

  1. compra ou fazer AAVs com um plasmídeo de interesse, conforme descrito anteriormente, 10 , 11.
    Nota: Este protocolo descreve o uso do serótipo AAV 2/8 (AAV 2/8) carregando mitocondrial alvo dsred ou GFP como gene repórter sob o controle transcricional da proteína básica de mielina promotor 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) para visualizar as mitocôndrias oligodendrocyte. AAV 2/8 carregando GFP ou tdtomato como gene repórter conduzido pelo promotor geral CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) é usado para visualizar o citoplasma oligodendrocyte. Assim, a combinação de AAV2/8 MBP_mito_dsred com CAG_GFP de AAV 2/8 dá mitocôndrias vermelhas e verde citoplasma em oligodendrócitos, Considerando que a combinação de AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dá verdes mitocôndrias e citoplasma de vermelha. As construções são descritas em mais detalhe em outro lugar 13.
  2. No dia 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrócitos com os AAVs.
    Cuidado: Siga as normas de segurança para trabalhar com AAVs. Certifique-se de ter a formação adequada e a aprovação de nível de biossegurança exigido. Todos os pontos seguintes devem efectuar-se em um gabinete de segurança biológica classe II usando luvas e avental. Aqui, aplicação do vírus adeno-associados à área das fatias de córtex é descrita, como esta é a área que mostra a melhor recuperação. Meio de cultura de
    1. dilua o AAV no pré-aquecido (37 ° C). Diluições em torno de 2 × 10 9 genoma cópias/mL (GC/mL) são recomendadas para obter uma transdução esparsa de oligodendrócitos, que permite a geração de imagens de células únicas dentro da fatia. No entanto, um piloto usando diferentes títulos deve ser feito para garantir uma densidade de oligodendrócitos transduzidas que é adequada para as experiências específicas. Se forem utilizados dois AAVs diferentes, deveriam ser misturadas na mesma solução e adicionados à auxiliar simultaneamente.
    2. Adicionar cerca de 1,3 µ l diluída AAV para cada fatia: Certifique-se de fora da ponta da pipeta é seca. Pipetar µ l 1.3 diluído AAV e segurar a pipeta acima do córtex, tão próxima quanto possível sem tocar na fatia com a ponta da pipeta (cerca de 1 mm).
    3. Então Empurre lentamente uma solução fora da pipeta. Quando a solução toca a fatia, mova a ponta da pipeta sobre o córtex para espalhar a solução sobre a área do córtex inteiro.
      Nota: Este procedimento deve ser feito tão rapidamente quanto possível para evitar manter as fatias para fora do capô por mais tempo do que o necessário. Fazer isso em um prato ao tempo e o primeiro prato que volta na incubadora antes de começar no prato #2. Para obter uma distribuição satisfatória de AAV, sem danificar o tecido requer alguma prática e uma mão firme.
  3. Se um microscópio de fluorescência vertical está disponível no laboratório de célula, a expressão da proteína pode ser verificado durante o tempo em cultura, colocando o prato sob o microscópio.
    Nota: O prato não deve ser mantido fora da incubadora por mais de 2-5 minutos.

3. Imagem de lapso de tempo

Nota: A imagem pode ser realizada sempre que os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes são suficientes e as fatias com um ar saudáveis (geralmente DIV11-14).

  1. Certifique-se que o microscópio, perfusão e aquecimento estão corretamente configuradas para que a solução de imagem borbulhada é aquecida e pode entrar e sair do banho.
    Nota: Existem várias soluções para câmaras de banho. Uma versão simples é apresentada aqui.
    1. Fazer em - e tomadas do banho por agulhas de seringa cega (curvado ~ 45 °) que estão conectados para os lados da banheira por aderência blu-aderência/fun.
    2. Certifique-se de que a tubulação vai de um frasco de solução de imagem borbulhado continuamente, através da bomba peristáltica, através do tubo de aquecimento da caldeira e depois para a agulha da seringa a entrada no banho.
    3. Conectar-se a outro tubo à saída da agulha da seringa. Este tubo depois vai através da bomba peristáltica e volta para o frasco de solução de imagem (ou uma garrafa de resíduos).
  2. Solução de imagem de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás de bioxide.
    Nota: Isto deve ser started pelo menos 15 minutos antes de imagem e continuar durante todo o experimento.
  3. Vez na bomba peristáltica e aquecedor e executar a solução através do banho para obter a temperatura ideal de banho (37 ± 0,5 ° C). Certifique-se de que o sensor do termómetro conectado à unidade de temperatura está submersa na solução banho.
  4. Ligar o microscópio, lâmpada da fluorescência e lasers apropriados.
  5. Caminho de
  6. conjunto acima uma luz adequada para a amostra.
    Nota: Isto pode variar dependendo da configuração do microscópio e sonda. Conhecimento geral de como usar o microscópio confocal é necessário e não será tratado aqui.
  7. Usar um objectivo de imersão de água com o apropriado ampliação e abertura numérica (n.a.). Nós usamos um objectivo de plano-apochromat de imersão de água 40 x (n.a. 1.0).
  8. Open pinhole para alcançar uma secção óptica de aproximadamente 2 a 2,5 µm para o vídeo lapso de tempo. Isso reduz a ocorrência de mitocôndrias, movendo-se fora de foco durante o lapso de tempo.
  9. Fatia de organotypic de transferência para o banho:
    1. Adicionar uma gota de solução de imagem ou de meio de cultura para uma placa de Petri de plástico pequeno.
    2. Em uma capa de estéril, estéril de uso de fórceps para transferir uma fatia de organotypic da membrana inserir para a gota. O fórceps só devem tocar o confete e não a fatia.
    3. Colocar a tampa sobre o prato de Petri.
    4. Imediatamente colocar a placa de cultura contendo o resto das fatias de volta na incubadora.
    5. Trazer placa de Petri contendo fatia para o microscópio.
    6. Desligar a bomba peristáltica enquanto transfere a fatia para banho de microscópio. Primeiro, use fórceps para levantar confetti com fatia de placa de Petri para o topo do banho (o confetti flutuarão). Então coloque as duas pontas da pinça de cada lado do confete para que eles toquem o confete sem tocar a fatia e empurre o confetti através da solução no fundo da banheira. Centralizar o confete no meio do banho.
    7. Uso de fórceps para colocar a âncora de grampo (harpa) em cima do Confeti sem tocar a fatia de
    8. .
      Nota: Uma harpa é uma âncora de platina em forma de ferradura que é usada para evitar que a fatia de flutuante ou à deriva no banho. Para fatias agudas, cordas finas correr de um lado da harpa para o outro (semelhante a uma harpa de música). Para fatias de organotypic, a harpa deve ser stringless e ajustar o tamanho do confetti de tal forma que ele pode pôr em cima do Confeti sem tocar a fatia.
    9. Ligar bomba peristáltica.
  10. Baixar o objectivo para a amostra.
  11. Selecione a célula e região para imagem.
    Nota: Evite a exposição excessiva das células da luz de laser, pois isso pode causar toxicidade celular (veja dicas nos pontos abaixo).
    1. Use as oculares e a lâmpada fluorescente para encontrar um oligodendrocyte aparência saudável com a expressão correta. Tipicamente, oligodendrócitos que têm um forte superexpressão da proteína fluorescente aparecem insalubres. Oligodendrócitos insalubres terão processos com uma aparência sem forma, e as mitocôndrias aparecerá fragmentadas. Oligodendrócitos saudáveis, a soma e processos aparecem lisos e mitocôndrias têm vários comprimentos (embora normalmente muito mais curto do que em neurônios e astrócitos 13 , 14 , 15).
    2. Coloque a célula de interesse no meio do campo de vista.
    3. Uso o " viver " função no software (para microscópios Zeiss e Leica) para identificar a célula na tela e escolha uma área de interesse, por exemplo, uma parte da célula que contém vários processos primários ou bainhas de mielina ou um único processo ou bainha de mielina.
      Nota: Para conseguir o máximo de processos/bainhas de imagem possível, escolher áreas contendo processos que põem relativamente plana na direção x-y.
    4. Ampliar o campo de interesse (normalmente, produzindo uma imagem com tamanho de pixel de 0,14 - 0,30 µm).
    5. Usando o " regiões " tool, desenhe um retângulo ao redor da área e escolha a opção para digitalizar apenas a região selecionada. Varredura de tempo e, portanto, exposição do laser, é reduzida pela verificação somente a região selecionada.
      Nota: Regiões retangulares horizontais serão digitalizadas mais rápido do que o verticais regiões devido ao menor número de linhas digitalizadas necessário. Se uma região retangular vertical é digitalizada, o tempo de digitalização pode ser reduzido, rodando o campo de verificação de 90º (usando a ferramenta de rotação).
  12. Poder de ajuste do laser e ganho para ter uma boa visão sobre mitocôndrias.
    Nota: Use o poder do laser mínimo necessário. Se possível, aumente o ganho ao invés de crescente poder do laser. Além de causar toxicidade celular, poder do laser muito alto irá branquear os objetos imagens ao longo do tempo, exigindo um novo aumento de potência do laser ou ganho durante a verificação. O poder do laser necessária e ganho dependerá do nível de expressão e o microscópio. Com um microscópio confocal LSM700, usamos um 555 nm laser com uma potência de 20-40 µW para imagem dsred ou tdtomato e um 488 nm do laser é usado em 20-30 µW a imagem GFP (medido na abertura traseira do objectivo de poder do laser). Ganho é definido alto para geração de imagens ao vivo, geralmente na faixa de 700-800 para as boas práticas agrícolas e 850-980 para dsred e tdtomato. O alto ganho pode causar algum ruído de fundo mais, que é removido, aumentando o deslocamento digital (deslocamento valores normalmente colocam entre 0 e 15). Em nossa experiência, usando o MBP_mito_GFP dá um melhor sinal-ruído do que MBP_mito_dsred.
  13. Velocidade de digitalização
  14. select.
    Nota: Minimizar o tempo de digitalização usando uma velocidade de digitalização rápida e desenhando-se uma pequena região de digitalização (ver ponto 4.10.5 abaixo). Também é possível salvar a digitalização tempo realizando uma varredura bidirecional. No entanto, isso não é recomendado devido à pior qualidade de imagem.
  15. Conjunto de frequência e duração da gravação de lapso de tempo, por exemplo, captura imagens em 2 segundos para um total de 20 minutos para a imagem latente mitocondrial em oligodendrócitos.
    Nota: A frequência e a duração devem ser definidas de acordo com a mobilidade dos objetos de interesse. Maior frequência irá expor o espécime para mais a luz do laser, mas mais rápido-mover objetos também exigem uma menor duração total de vídeos de lapso de tempo (por exemplo, as mitocôndrias nos neurônios, que se movem com mais frequência e em uma velocidade muito maior do que as mitocôndrias em oligodendrócitos, são tipicamente fotografada a cada segundo por um total de 2 minutos 16).
  16. Iniciar a gravação de lapso de tempo.
    Nota: O mitocôndria pode mover-se fora de foco e/ou deriva da região da imagem durante a gravação. Para minimizar as vibrações e movimento, ajuste em - e saídas de banho e reduzir a velocidade da bomba, se necessário. Pequenas mudanças em foco geralmente ainda ocorrem. Assim, o monitoramento contínuo da tela durante a imagem latente é necessária, com pequenos ajustes do foco durante a gravação.
  17. Captura uma z-pilha da célula inteira para futura identificação de célula e fotografada processo.
    Nota: Para melhor resolução, a pinhole deve ser reposto para 1 unidade arejada para a pilha de z.
  18. Opcional: Visualizar mielina imaculada.
    Nota: Em oligodendrócitos transformados com GFP (citoplasmática), das bainhas de mielina geralmente pode ser identificadas como linhas retas do citoplasma (as cristas citoplasmáticas) ligadas a um processo primário (ver Figura 2 A e B). No entanto, se a expressão de GFP é demasiado fraco ou um marcador citoplasmático não é usado, é possível visualizar a bainha de mielina por microscopia confocal de reflectância (núcleo), como explicado aqui.
    1. Configurar um novo caminho de luz no software com excitação do laser em 488 nm e captura emitida luz em torno do mesmo comprimento de onda, por exemplo, 470-500 nm.
    2. Ajustar poder laser e ganhar até mielina é visível (ver exemplo em < forte classe = "Xfig "> Figura 3). Usando um microscópio de LSM 510 Meta, normalmente usamos um poder do laser de 7-12 µW (medido na abertura traseira do objectivo).
  19. Opcional: elaboração de fatias de imunocoloração.
    1. Se a célula de imagem deve ser identificada após imunocoloração, capturar uma imagem de baixa ampliação (10x) da célula e indique sua localização na imagem desenhando uma seta ou similar. Para auxiliar a deteção da célula, recomenda-se também desenhar um mapa manual da fatia inteira, indicando a localização da célula.
    2. Fix fatia em paraformaldeído 4% (PFA) agitador por 1 hora em temperatura ambiente.
      Atenção: O PFA é prejudicial. Usar protectores e só usar um capuz ventilado.
    3. Diluir o fixador 01:10 em PBS e sai a 4 ° C até começando a imuno-histoquímica conforme descrito em outro lugar 17.
      Nota: Embora as fatias podem ser deixadas no fixador diluído por várias semanas, fluorescência pode desvanecer-se. Realização de imuno-histoquímica no prazo de 10 dias de fixação é recomendada.

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Representative Results

Organotypic fatias de cérebro que foram cultivadas e transfectadas conforme descrito acima mostraram uma distribuição esparsa de oligodendrócitos corticais expressando mito_dsred e GFP. Imunocoloração com anticorpos contra Olig2 e MBP confirmou que a expressão era específica de oligodendrócitos (Figura 1).

Para geração de imagens ao vivo, oligodendrócitos transduzidos foram reconhecidos por sua morfologia característica das bainhas de mielina vários rodando em paralelo (Figura 1 e Figura 2A). Por meio de imagens de lapso de tempo os oligodendrócitos transduzidos, é possível monitorar a movimentação de mitocôndrias em processos primários e bainhas de mielina (Fig. 2B-D).

Em células com baixa expressão de GFP, a bainha de mielina pôde ser identificada durante a imagem latente ao vivo ao iluminar a amostra em 488 nm e captura emitida luz 470-500 nm (Figura 3A). Esta técnica de microscopia (núcleo) de reflectância Confocal também trabalhou em PFA fixada e tecido immunostained, apesar de bainhas de mielina apareceu redutor (Figura 3B-C). Por imunocoloração com anticorpos contra a proteína básica da mielina (MBP), descobrimos que quase 100% das bainhas de mielina que fixa horizontal ao plano de imagem (indicado por setas, Figura 3B-C) são visíveis com núcleo, Considerando que as bainhas de mielina que leigos perpendicular ao campo de visão (indicado por asteriscos, Figura 3B-C) são menos ou nada visível. Embora quase todos os entrenós são visualizados, aparecem muitos entrenós descontínuos, com pequenas partes da bainha não sendo visível (inserirFigura 3A ). Estas pequenas "falhas" na mielina podem ser preenchidas pela imagem com três comprimentos de onda complementares, chamados de Pontuação9.

Figure 1
Figura 1 : Imuno-histoquímica confirma que o MBP-mito-dsred seletivamente é expresso em oligodendrócitos que são imunes positivos para Olig2 e MBP.  Imagens são do neocórtex de fatias de cérebro de rato culta transduzidas com (AAV2/8) MBP-mito-dsred (marcador vermelho, mitocondrial) e CAG-GFP (verde, citosol). As fatias foram immunolabeled para o marcador de mielina, proteína básica da mielina (MBP, azul) e Olig2 (oligodendrocyte linhagem celular nuclear marcador, magenta). (Figura modificada de referência13) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imagem de lapso de tempo para controlar o movimento mitocondrial em oligodendrócitos. (A) projeção de z-pilha (secção óptica 10,35 µm) de oligodendrocyte transfectada com MBP_mito_dsred (mitocôndrias vermelhas) e CAG_GFP (fluorescência verde). (B) confocal imagem única (secção óptica 1,04 µm) da mesma célula. Praça indica a região que foi selecionado para a imagem latente de lapso de tempo (C) e as linhas desenhadas para fazer kymographs (kym) em (D) são indicadas. (C) imagens de gravação de lapso de tempo da célula na e B, tiradas em pontos diferentes do tempo. As mitocôndrias em movimento são indicadas (setas vermelhas). (D) Kymographs partir das trajectórias indicaram em (B). Estacionárias mitocôndrias são vistas como linhas verticais em linha reta e mitocôndrias em movimento são vistas como linhas diagonais. Como pode ser visto nos kymographs e na imagem de tempo-curso em (C), apenas as mitocôndrias no processo primário marcado Kymograph 1 (Kym 1) estão se movendo. As mitocôndrias em outros kymographs os três são fixas durante a gravação de lapso de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Visualização de mielina imaculada pela microscopia Confocal reflectância (CoRe). (A) projeção de z-pilha (secção óptica 10,35 µm) do neocórtex de uma fatia do cérebro organotypic ao vivo. A expressão de GFP no oligodendrocyte mostrado aqui (corpo de célula verde) é muito fraca para identificação dos principais processos e bainhas de mielina. Em vez disso, bainhas de mielina foram visualizadas por excitação em 488 nm e capturando luz emitida em 470-500 nm (mostrado em magenta). Alguns do citoplasma rico paranodes da GFP + oligodendrocyte podem ser visto nas pontas dos entrenós a mielina (setas). Inserção: Parte ampliada da bainha de mielina mostra que a mielina visualizada com núcleo aparece "desiguais" ou descontínuos (ver texto principal para detalhes). (B-C) Confocal imagens do estrato radiatum do hipocampo CA1 striatum (B) e (C) de uma fatia de cérebro de rato aguda que foi fixado em 4% PFA e immunostained para proteína básica da mielina (MBP). Bainhas de mielina Horisontal (setas) são visíveis com núcleo, Considerando que camisinhas que são perpendiculares ao campo de visão (asteriscos) geralmente não são visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela dos reagentes: Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O protocolo para fazer culturas de organotypic descritas aqui é uma versão modificada de18 do protocolo descrito por De Simoni e Yu (2006)5. As mudanças mais importantes foram esboçadas abaixo. Tampão Tris é adicionado ao meio de cultura, o que melhora a sobrevivência das fatias quando fora da incubadora durante a transdução viral e mudança do meio de célula. O procedimento de esterilização para confetti também mudou. Enquanto outros protocolos esterilize confetti em autoclave, não recomendamos isso porque fará com que vários do confete para enrolar. Evite usar confete enrolado como fatias crescidas sobre estes tendem a ser menos saudáveis. Nosso protocolo usa ratos, ratos não e é modificado para cultura o córtex em vez do hipocampo, que encontramos funciona bem com fatias mais finas (230 µm vs 300 µm). Como mielinização picos pós-Natal dia 10-20, em camundongos e ratos19, culturas feitas de ratos no p7-9 (e então cultivadas para 11-14 dias) são ideais para estudar microambiental oligodendrócitos. Em 11-14 dias in vitro, as culturas contêm vários oligodendrócitos maduros com bainhas de mielina compacto13. Culturas de ratos mais jovens irá conter menos oligodendrócitos maduros no final do período de cultura, Considerando que as culturas feitas de ratos mais velhos mostraram-se mais desafiadoras manter saudável20.

O procedimento para fazer fatias organotypic envolve várias etapas críticas. A dissecação e montagem do cérebro, bem como colocando fatias para confetes, deve ser feito rapidamente e exige alguma habilidade. Normalmente, as primeiras tentativas de fazer organotypic fatia de culturas são menos bem sucedidas, mas 2-3 rounds de prática devem ser suficiente para adquirir as habilidades necessárias para fazer culturas saudáveis. É importante manter um ambiente estéril durante todo o procedimento para evitar a contaminação das culturas. Além disso, ao trabalhar com as células vivas, sempre é imperativo para assegurar a correta pH e pressão osmótica das soluções para manter a saúde da célula. É, portanto, um bom conselho para verificar a pressão osmótica (deve ser 270-310 mOsm/kg) e pH de todas as soluções que são usados nas fatias, especialmente quando fazendo o experimento pela primeira vez. As cultura e dissecação soluções para as culturas de organotypic contém um indicador de pH (vermelho de fenol), mas o soro amarelo em meio de cultura pode dar uma impressão de um valor mais baixo do que o pH real. O meio de cultura contém penicilina, estreptomicina e nistatina para minimizar as chances de infecção. Portanto, recomenda-se usar estes antibióticos e antimicóticos quando da criação da técnica de cultura de fatia de organotypic no laboratório, mas mais tarde podem ser evitados quando especialista em técnica asséptica é aplicada. O protocolo atual usa morfologia celular para avaliar a viabilidade celular. Para uma análise mais quantitativa, fatias podem ser carregadas com iodeto de propidium ou corantes semelhantes como descrito em outro lugar21. No entanto, é importante estar ciente de que o espectro de emissão de iodeto de propidium sobrepõe-se com dsred, tdtomato e outros indicadores vermelhos. Outra limitação do iodeto de propidium e reagentes semelhantes é que eles não entram facilmente nas camadas mais profundas da fatia, limitando assim a avaliação da viabilidade celular para a camada superior de células5.

Uma variedade de métodos existe para a entrega do gene. As principais vantagens do uso de transdução vírus adeno-associados do organotypic fatia culturas Visualizar organelas são os seguintes: transdução de AAV tem uma melhor taxa de sucesso para postmitotic oligodendrócitos em comparação com métodos de não-virais de transfeccao22. Além disso, em culturas de organotypic todos os tipos de células do cérebro estão presentes, e oligodendrócitos têm uma morfologia semelhante ao que vi na vivo, incluindo mielina compacto13. Isso é diferente de oligodendrócitos em monocultura, que faltam a comunicação com axônios e, portanto, não faça mielina compacta. Imaging em vitro é mais fácil em comparação com in vivo e oferece uma resolução espacial melhor, que é de particular interesse quando imagens pequenas organelas como mitocôndrias. Futura investigação terá como objectivo a imagem na vivo, mas enfrenta um grande desafio com as aberrações ópticas causadas pela bainha de mielina rica em lipídios. Além disso, especificidade de tropismo e promotor de sorotipo de vírus adeno-associados pode diferir entre in vivo e in vitro condições13,23. No protocolo aqui apresentado, AAV2/8 MBP_mito_dsred e AAV2/8 MBP_mito_GFP é usado para visualizar as mitocôndrias oligodendrocyte. Sorotipo AAV 1/2 também foi testado com MBP_mito_dsred mas infectado um menor número de oligodendrócitos nas fatias de organotypic (não mostrados). AAV2/8 CAG_GFP e CAG_tdtomato de AAV2/8 foi usado para visualizar o citoplasma oligodendrocyte. Apesar de usar o promotor geral do CAG para isto, AAV 2/8 CAG_GFP e CAG_tdtomato seletivamente infectado oligodendrócitos, com apenas um pequeno número de astrócitos e neurônios estarem infectados (estas podem ser facilmente identificadas pela sua morfologia característica). Esta seletividade para oligodendrócitos é presumivelmente devido o tropismo do vírus adeno-associados sorotipo 2/824. No entanto, para expressão organela-alvo, a célula maior especificidade alcançado com o MBP - ou outros promotores oligodendrocyte específico é recomendado. Outros serotipos testados com CAG_GFP por nós foram AAV 1/2, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, mais do que infectados principalmente neurônios e astrócitos (não mostrados).

Dependendo da construção e das condições experimentais, modificação de transdução da célula serão necessários. Se as células transduzidas aparecerem muito fraca, tente um longo tempo em vitro após transdução para aumentar a expressão. Se as células aparecem brilhantes mas insalubres, reduza o tempo depois de transdução. Se muito poucas células são transfectadas, a concentração de vírus adeno-associados pode ser aumentada. No entanto, também é possível que o tempo in vitro após transdução é muito longo e que células transduzidas tem morrido. Para as construções usadas aqui, níveis de expressão foram ideais 4-6 dias após transdução. 7-8 dias após transdução, células apareceram menos saudáveis, com processos sem forma, e 10 dias depois de transdução, apenas algumas células transduzidas eram visíveis (não mostrado).

Este protocolo utiliza um microscópio vertical para a geração de imagens ao vivo de organotypic fatias. Isso é diferente de mais mono- e co culturas que normalmente usam um microscópio invertido. É suboptimal usar um microscópio invertido aqui porque as fatias então devem ser ligadas com o confete virada para cima, que presumivelmente faz com que as fatias ser menos saudável. Uma vantagem do microscópio vertical é a possibilidade de adicionar eletrofisiologia para a instalação. Além disso, o uso de uma bomba para alterar médio significa que soluções de droga facilmente podem ser adicionadas e removidas durante a lapso de tempo de imagem. Uma desvantagem com a bomba é problemas mantendo foco causado por vibrações e correntes no banho. Sob o microscópio, as células gradualmente se tornará menossaudável. Portanto, mantemos fatias sob o microscópio para um máximo de 1 hora. Fatias de imagens são jogadas fora (resíduos especiais). Para assegurar que as condições de imagem são os melhores, geração de imagens de células de controle, em que o movimento mitocondrial é já bem caracterizado, deve ser executada em paralelo. Por exemplo, o movimento mitocondrial em axônios ou dendritos pode ser fotografada por transducing fatias com AAV Syn_mito_dsred 2/1 (no qual dsred expressão é conduzido pelo promotor synapsin neurônio-específica) ou AAV CAG_mito_dsred 2/1 (seguido de imunocoloração para Confirme a identidade da célula). Análise de movimento mitocondrial pode ser feito usando a ferramenta de kymograph múltiplas no ImageJ conforme descrito em outro lugar25.

Aqui descrevemos o núcleo para visualização de mielina imaculada durante a geração de imagens ao vivo. Comparado com Pontuação9, que usa três comprimentos de onda de excitação, núcleo utiliza apenas um (488 nm) e, portanto, é mais simples de implementar. Na partitura, os três comprimentos de onda cada revelam diferentes "peças" da bainha de mielina e juntos dar uma imagem completa da bainha. Além disso, a pontuação pode ser usada para detectar estruturas de bainha de mielina como bolsos citoplasmáticas. Com o comprimento de onda único usado no núcleo, é dada uma visão menos detalhada e bainhas podem aparecer granulado ou descontínuo (Fig. 3). Não obstante, núcleo visualiza perto de 100% das bainhas de mielina que são o campo de visão na horizontal. Assim, o núcleo é útil para a deteção das bainhas de mielina, mas não para análise de estruturas de mielina ou integridade.

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Acknowledgements

Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås para acesso à célula de laboratório e equipamentos, pessoal de Janelia Biologia Molecular compartilhada recursos para a produção de vírus e do plasmídeo e Koen Vervaeke para obter assistência com medições de potência do laser. Este trabalho foi financiado pela Associação Norueguesa de saúde, Conselho Norueguês de pesquisa e os equipamentos de microscopia foi financiado pelo Norbrain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose  Sigma  A9539
BD Microlance 19G BD 301500 Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas AGA 105701
Brand pipette bulbs Sigma-Aldrich Z615927 Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner) VWR 89038-530
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments 64-0106  Temperature controller - thermometer part
CaCl2 Fluka 21100
CO2  AGA 100309 CO2 for incubator
Cover glass, square Corning Thermo  Fischer Scientific 13206778 To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Delicate forceps Finescience 11063-07 For dissection
Diamond scriber pen Ted Pella Inc. 54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm VWR 612-1702 Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade Electron Microscopy Sciences #7200 Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco-Invitrogen 24010-043
Filter paper circles Schleicher & Schuell 300,220 Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack Loctite 1270884 Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2 Katrin 344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber, Warner Instruments  64-1418 Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3 Sigma H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2 Heto-Holten 96004000M Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated Gibco-Invitrogen 26050-088
KCl Sigma P9541
LCR Membrane, PTFE,  Millipore FHLC0130 Confetti 
Leica VT1200 Leica 14048142065 Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES Thermo  Fischer Scientific 42360024
MgCl2 R.P. Normapur 25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B Electron Microscopy Sciences 62411-B Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit Millipore SLGPM33RA Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm Millipore PICM03050 Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module GILSON F155001 Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaHCO3 Fluka 71628
Nunclon Delta Surface Thermo  Fischer Scientific 140675 Culture plate
Nystatin Suspension Sigma-Aldrich N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC  Zeiss 441452-9900-000  Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm VWR 291-1211
Paraformaldehyde, granular Electron Microscopy Sciences #19208
PC-R perfusion chamber SiSkiYou  15280000E Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15070-063
Petri dish 140 mm  Heger 1075 Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm  Sarstedt  82.1473 Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mm VWR 391-0868 Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417 PBS tablets
R2 Two Channel Head  GILSON F117800 Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel VWR 82027-528 Large spatula for dissection
Sand paper VWR MMMA63119 Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm Finescience 14130-17 Large scissors for dissection
Scissors, 8,5  Finescience 14084-08 Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade Electron Microscopy Sciences #71972 Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm Millipore SCGPT05RE Filter to sterilize solutions
Super glue precision Loctite 1577386
Surgical scalpel blade no. 22 Swann Morton Ltd. 209 Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B Warner Instruments 64-0100 Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base Sigma  T1503
Trizma HCl Sigma T3253
Water jacketed incubator series II Forma Scientific 78653-2882 Incubator

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References

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