調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

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Developmental Biology
 

Summary

このプロトコルでは透明なゼブラフィッシュ幼虫に蛍光に分類されたt. の原因を注入したし、寄生虫運動は体内光シート蛍光顕微鏡を用いた観察されました。

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Akle, V., Agudelo-Dueñas, N., Molina-Rodriguez, M. A., Kartchner, L. B., Ruth, A. M., González, J. M., et al. Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo. J. Vis. Exp. (127), e56238, doi:10.3791/56238 (2017).

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Abstract

シャーガス病は、寄生感染症のcruzi トリパノソーマの原因、その運動は細胞結合と侵略のためのローカリゼーションのため重要ではないが原因です。T. の原因の調査のため現在の動物モデルは、寄生虫生体内でヒトの感染症の初期の段階で理解の寄生虫の行動のための挑戦を表すの限られた観測を許可します。この原虫はベクトルと哺乳類を宿主のべん毛のステージが、その運動体内を記述する研究がないです。このプロジェクトの目的は、血管系のt. の原因運動を評価する生きている脊椎動物ゼブラフィッシュ モデルを確立するあった。幼虫は蛍光を注入した透明なゼブラフィッシュ trypomastigotes と光シート蛍光顕微鏡 (LSFM)、高光学解像度で生きる生物を可視化する非侵襲的手法を使って観察。このテクニックの共焦点と比較して光損傷の比較的低リスクのため長期間の寄生虫に視覚化できますや落射蛍光顕微鏡。サイズの異なる血管と卵黄で生きたゼブラフィッシュの循環系の旅t. 原因寄生虫が観察されました。彼らはまた心臓の収縮に関連付けられている強い力にもかかわらず房室弁と卵黄嚢の壁に添付で見ることができます。T. の原因の LSFM-接種ゼブラフィッシュ幼虫は寄生虫を循環の視覚化に使用することができます彼らの親和性、移行パターン、および生きている動物の心臓血管系の動的な環境で運動を評価する貴重なメソッド。

Introduction

シャーガス病です原虫の寄生によって引き起こされるt. の原因。世界中の約 6 に 700 万人々 はt. の原因に感染しています。病気は、ラテン アメリカを中心に転送が、アメリカ合衆国、カナダ、多くの欧州と感染した個人1の移行を主因のいくつかの西部の太平洋国で報告されています。シャーガスは主として媒介および hematophagic「キスのバグ」としてよく知られているクロタマゴバチ亜科の昆虫の糞便との接触によって人間に送信されます。しかし、 t. の原因は、輸血、母から子、または寄生虫2と汚染される食糧の摂取の転移垂直を介して送信もできます。急性期感染症は主に無症候性または症候性恒常と 6 から 8 週間まで続くその後免疫系の関与は寄生虫の負荷を制御が3感染症を完全に排除していません。ほとんどの人は、慢性無症候期; を入力します。ただし、約 30% の患者は心臓系・頻度、消化器・神経システムが侵害された4症候性の慢性期を開発します。利用可能なワクチンがないとシャーガスの 2 つだけの有効な薬がありますので、このシナリオ提示病の治療とコントロールのための挑戦: benznidazole とニフルチモックス。どちらの治療法は長期管理を必要とし、2重篤な副作用があります。

生体内で動作寄生移行、携帯電話の添付ファイル、およびホスト内侵入を判断する鍵は、 t. の原因の動作の理解を増加生体内でモデルの欠如は、新規治療法の開発を制限します。Trypomastigotes の運動性は宿主細胞膜とそれに続く細胞侵入5への連結の重要なt. クルーズトリパノソーマ感染症の生体外で調査は示した。エネルギーの枯渇の影響を受けやすい細胞との共培養で trypomastigotes は細胞侵入6を減らすために示されています。興味深いことに、trypanosomatids の鞭毛運動もとして特徴づけされている寄生虫特異的抗体7に対する回避機構。

べん毛運動されている広く調査体外トリパノソーマ、アフリカ睡眠病8を引き起こす近縁寄生虫で。これらの trypanosomes の運動性のin vitro研究示した寄生虫前進9 の血液や体液、粘度や血液細胞の代表的な障害物の存在などの条件のシミュレーションが大事.としてまだそれされていない寄生虫体内血流の動きを視覚化することが可能。

ゼブラフィッシュ幼虫ホスト病原体の相互作用で体内を勉強する強力なモデルであります。小型・安価・ シャーガス病の他の確立された脊椎動物モデルと比較したときに発生する比較的簡単です。ゼブラフィッシュ自然免疫と適応免疫システム、人間に類似したが、適応免疫 4 日ポスト受精 (dpf) で開発を開始しは数週間別の10の成熟していません。初期の開発中にマクロファージのみがある場合即時免疫干渉10なし寄生虫の行動を研究するための大きな窓があります。ただし、病原体の動作を研究するため脊椎動物モデルとしてゼブラフィッシュ幼虫を活用する最大の利点は顕微鏡検査、11の画像に従う義務があるように、彼らの光の透過性にあります。また、遺伝を操作するための複数のツールがあります。たとえば、キャスパーのひずみは色素沈着はなく、完全に透明性と個々 の器官の可視化および挿入されたセル12のリアルタイム追跡のために有効な動物を作るとゼブラフィッシュ変異体ラインです。

生きたゼブラフィッシュを用いた共焦点または落射蛍光顕微鏡の迅速移動寄生虫の縦断的観察の重要な制限は、高速度で良好な画像品質と低溶込み深さイメージングの不可能性光損傷の危険。光シート蛍光 micsroscopy (LSFM) は、これらの観察を許可するようにこれらの制限を克服する新たなイメージング手法です。蛍光検出の目的の焦点面を照らすのみ 2 番目の直交照明目的を検出する目的の 1 つを使用して、それは共焦点顕微鏡と同様に、高解像度光学セクションを取得することが可能大幅削減光損傷、落射蛍光顕微鏡13に関しても。ここで使用される LSFM の手法は、単一平面照明顕微鏡 (SPIM)、光の薄いシートがゼブラフィッシュ幼虫の内で 1 つの平面を点灯と呼ばれます。

この方法論の目的は、 t. の原因運動と体内関連の動作を理解するための実行可能な非感染症モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚を確立することです。これを達成するためには、蛍光に分類された trypomastigotes、人間の感染症担当細胞フォームを透明なゼブラフィッシュ幼虫を注入し、ゼブラフィッシュの心臓血管の循環にt. の原因の動きを識別LSFM を使用しています。

Protocol

次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会のロス アンデス大学 (CICUAL) によって承認されました。バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) ガイドラインは病原体による汚染を防ぐために厳密に従う必要があります t. 原因

注: 動物のケアとメンテナンス: キャスパー ゼブラフィッシュ ゼブラフィッシュの遺伝子組み換え株 (Danio rerio) すべての発達段階で彼らの貴重な光の透過性によりこのプロトコルで使用します。魚を操作するには、最適なケア種 14、14 h 光 10 h 暗いサイクル 28 ± 1 ° C、pH (7.0 7.4) 制御条件多槽循環水システムを使用します。動物はライブ ブラインシュリンプ (アルテミア) の 1 日 2 回を供給され、濃縮食品を飼育します。すべてのプロトコルは、デロス アンデス (C.FUA_14-017) で CICUAL によって承認されました

1 です卵水の準備

  1. 準備 0.6 g/L 水族館塩逆浸透 (RO) または純水 (DI)、0.01 mg/L メチレン ブルーをソリューションに追加します。
    。 注: 測定伝導率 400-500 μ S/cm と pH のレベルでなければなりません 7.2 7.9 に。PH を下げるため、数時間の卵水を通気します

2。Tricaine ストック溶液の調製

97.9 蒸溜水 (ddH 2 O) 400 mg tricaine (MS-222) を溶解することにより
  1. 準備 0.4 %tricaine 原液。粉を完全に溶かし後、2.1 mL 1 M を使用して 7.0 に pH を調整するトリス (pH 9.0) ソリューションを冷蔵と

3。1.0% の低融点アガロース

  1. 卵低溶解点 agarose 粉末が溶解水 1.0% の最終的な集中に。アガロース溶液が均一な表示されるまで連続攪拌にホット プレート、電子レンジでの混合物を熱します
  2. もはや一週間以上のための 4 ° C で因数を格納します

4。アッセイと胚のコレクションとの交配

  1. 3 日注射の前にわれわれのタンクを繁殖の男性と女性の魚の健康的なペアを使用して設定します。ガラス玉や人工植物の濃縮は、産卵を向上させます。交配を午後時を設定し、一晩放置する必要があります
  2. 次の朝、こし器を通ってタンクを流出させると卵水と卵を洗浄によって生み出された卵を収集します。こし器の反転とストレーナーをペトリ皿に卵水を注いで、すべての卵を削除します。胚を健康に保つために、残骸および転送プラスチック ピペットと死胚を削除してその水をきれいします
  3. は、ゼブラフィッシュ ステージング基準 15 によると胚の開発を許可する 28.5 ° C の温度が安定して培養する胚を転送します。一日に二回、胚を調べるし、クラッチを健康に保つために inviable 卵を破棄します

5。胚 Dechorionation

注: 胚の注入の時に孵化したない場合、この手順が必要です。この手順で " 幼虫 " 48 h から、絨毛膜から動物ポスト受精 (hpf) 以降が

  1. 実験の日、解離性万国実体写真の下で健康な胚を含むペトリ皿を配置します
  2. 2 つの鋭い鉗子 (デュモン #5)、絨毛膜の反対の端をつかむし、優しく涙とプルは絨毛膜を開きます。約 5-6 の幼虫は、一度に注入されると通常 3-4 をイメージします
  3. 転送ピペットを使用して水から、絨毛を削除します

6。注入材料を準備する

  1. 準備 1.0 mm 針でガラス管を薄肉とマイクロ ピペットの引き手デバイスを使用して次の設定で: ライトウ エイト 2 + 1 の重量、2 mm トップ プル + 5 mm 下に引っ張り、75.9 ° C (ステップ 1) + 78.2 ° C (ステップ 2)。粘土のストリップにシャーレに針を格納します。理想的な針が必要 t. の原因 としての狭い先端約 20 x 1-3 μ m を測定し、簡単に針が通過。先端の長さが変わることができる: より長いヒントはより深い構造に到達するため便利ですが、短いヒントはより堅いユーザーの注入を容易になります
    。 注: ニードル先端サイズによって異なります使用温度: ステップ 2 の高温が長く、細かいヒント結果します
  2. は、ddH 2 O で 1.5% アガロース溶液を準備し、10 cm シャーレにそれを注ぐ。約 1.0 cm の深さをカバーします
  3. Agarose をプレハブのインジェクション金型を置き、固めることができます
  4. うちプレハブのインジェクション金型を持ち上げ、4 ° C で保存用卵水を追加Agarose を乾燥から防ぐこれ
  5. 4 で 150 mg/l. 店の最終濃度に tricaine 原液を追加卵水 ° C

7。寄生虫の成長のための細胞培養

  1. 寄生虫はバルガス ザンブラーノ で説明したメソッドを使用して人間の星状細胞腫細胞株 (CRL-1718) に保持されます。 16
  2. コート t25 フラスコ培養フラスコにひと細胞の培養を開始 (表面積 = 25 cm 2) 2 x 10 5 または 10% 牛胎児血清 (FCS) の RPMI 1640 培地 4 mL に 4 x 10 5 セルの密度で補われます。2 mM L グルタミン、4.5 G/L グルコース、10 mM HEPES、1 mM ピルビン酸 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと (呼ばれる " メディアを完了 ")。37 ° c 5% CO 2 環境で星状細胞腫文化をインキュベートします
  3. 単層が合流すると、それらの 37 ° c. 視覚的にチェックのための細胞剥離、3 分の孵化によって 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL を使用してセルを外し、15 mL チューブに 10% FCS RPMI 1640 の 3 mL を用いたトリプシン溶液をブロックします
  4. 1,350 x g に 5 分の細胞懸濁液を遠心分離
  5. 15 mL チューブと 22 で 1,350 × g で 5 分間遠心 DMEM 培地の結果細胞ペレットを洗う ° C
  6. ノイバウアー商工会議所と顕微鏡 40 倍の倍率での生存率を確認する手動でのセルをカウントします
  7. 優しく再中断細胞の完全なメディアの 4 mL にペレット、T25 培養用フラスコあたり 2 x 10 の 5 セルを使用して新しい細胞培養の作成に使用します

8 。T. 原因 文化とラベリング

  1. の寄生虫は、もともと感染した人間から得られ、t. の原因 DA 株 (MHOM/株/01/ダ)、として特徴付けられるひずみ遺伝子型離散入力ユニット (DTU) TcI 16。養殖の 3 または 4 日間人間の星状細胞腫細胞の培養上清 1,350 x g. で 5 分間遠心から移動寄生虫を収集後、培地を除去
    。 注: 完全培地に寄生虫は再コート t25 フラスコ培養フラスコで星状細胞腫細胞と 1:1 の比率で文化のため使用できます
  2. 優しく 1,350 x g に 10 mL 滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 0.1% の FCS と 5 分間遠心する x のペレットを再停止
  3. は、上澄みを廃棄し、再 1 mL の PBS で中断します。ノイバウアー チャンバー内で自由遊泳性の寄生虫をカウントするための 10 μ L を取る
  4. (990 μ L) の再懸濁の寄生虫の残りの部分を取るし、Carboxyfluorescein 二酢酸一 Succinimi の 1 μ L を追加dyl エステル (CFSE)、最終濃度 5.0 μ M. 室温で 10 分間加温
    。 注: 5 mm CFSE 株式は避けようと-20 で維持をする必要があります ° C
  5. ペレット寄生虫 (1,350 × g、5 分) です。チューブをフリックすることで寄生虫のペレットを再構成し、PBS-0.1% FCS は続いてそれに続くスピン (1,350 × g、5 分) 1 x の 10 mL で洗うです
  6. 上澄みを廃棄し、優しく再取得についての最終濃度に適切なボリュームの 1x PBS でラベルの付いた寄生虫ペレットを中断注射用 10 20 寄生虫/nL
  7. は、少量を使用 (∼ 10 μ L、約 1 × 10 4-2 x 10 4 寄生虫) 生存率とラベリングを評価する trypomastigotes の。倒立蛍光顕微鏡は、寄生虫の直接可視化に使用できます。透過光モードで寄生虫が移動することを確認します。蛍光モードで寄生虫のラベリングを評価するフルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) フィルターを使用します

9。ゼブラフィッシュ幼虫を注入する

    1. 寄生虫の読み込み
    2. 再懸濁 (100 μ L) から寄生虫の 10 μ L をとり 10 μ microloader のピペット チップを使用して密封されたガラス針にそれらを読み込む
    3. マニピュレーターの針ホルダーにガラス針を挿入、磁気スタンドを使用してし、万国実体写真の隣に配置します
    4. 鈍オープンを作成する針をカット、万国実体写真の下微細鉗子を使用を終了し、1 の注入量を取得するドロップ サイズを測定 nL (これは鉱物油 17 において測定する場合 mm 0.12 0.13 のビード径に相当)。針は構造にアクセスできるように、長く先端が最寄り、組織を損傷することがなく魚の奥深く。このプロトコルでは、鈍針が使用されて、しかし、ベベル針を使用することもできます
  1. マウント
    1. 48 の幼虫を麻酔 hpf 150 mg/L tricaine で。彼らは、タッチに応答しないことを確認、確保心臓が
    2. 側臥位マイクロインジェクション agarose 金型で幼虫を配置します
    3. は、株分け業横針ホルダーを置き、針の先端が視野の中心にはマニピュレーターを調整します。6.4 6.2-の手順で準備して仔魚の卵黄が針の先端に近いペトリ皿を移動します。心臓が鼓動を続けているように幼虫の状態を確認します
    4. マイクロインジェクター値のとおり設定: 注入圧力 9.6 ポンド インチ (psi); 圧力を保持: 20 psi; ゲートの 100 ms の範囲、期間値が 1.9 (10.9 ms に相当)。注入量は約 10-20 寄生虫/nL との 1-3 nL の間する必要があります

10。寄生虫の注入

  1. 注入キュビエのダクトで卵黄の上前の部分の魚。この手順は、投与後動物の生存を確保する練習する必要があります。5-6 幼虫を正常に注入する約 10 分がかかる
  2. コントロールとして同じ車両容積 (1 x PBS) 1 2, 幼虫を投入します
  3. 幼虫を新鮮な卵水にすぐに転送します

11。LSFM マウントの注入幼虫

  1. 空のシャーレに寄生虫を注入した幼虫を転送し、プラスチック ピペットと吸水紙と周囲の水を慎重に取り外します。予熱した 1.0% 低融解点 agarose の 100 μ L をすぐに追加 (アガロース調製の手順 3 を参照)、幼虫をカバーします。Agarose がない 40 歳以上を確認 ° C
  2. は 1.0 mm のガラス管の中の直線を挿入し、垂直位置に幼虫を吸うプランジャーとしてそれを使用します。幼虫上 agarose の少量を残すことを確認します。Agarose (これは数分かかります) 幼虫を公開する前に凝固するまで待機します。必要に応じて、幼虫の下の余分な agarose を押し出すし、オフを切って
  3. 毛細血管顕微鏡サンプル ホルダーに置き、かかっている毛細血管から無料まで、幼虫を含む端をプッシュします。標本室は tricaine ソリューション (150 mg/L) と 28 で設定温度で満たされる必要があります ° C
  4. は、XYZ マイクロマニピュレーター システムを使用して検出の目的の生徒の前で幼虫を配置します。垂直軸を中心として回転、回転ステージを使用します。幼虫の構造を明示する透過光モードで幼虫の位置決めを行う必要があります

12。LSFM イメージングの注入寄生虫

    蛍光
  1. 変更モードと照度と光損傷を減少し、時間分解能を最適化する露光時間を調整します。これらの特定の実験サンプル 2.8 3.0 mW の電力に使用し、6.45 μ m ピクセル検出波長で 〜 70% の量子効率とカメラを使用して 200 ミリ秒の各フレームを公開します。これらの設定は、約 5 フレーム/秒を最も高い可能な開口を使用し客観的に確認で十分に露出した画像になります
  2. は、領域 (ROI) のビデオ集録を開始します。当社の場合、バルブに接続されていると心臓周辺自由に動く寄生虫が観察されます。時間をかけて、1 つの平面のビデオを取るか寄生虫に移動しながら別の平面を集中するマニピュレーターまたはピエゾ ガルバノ システムを使用する勧めします
    。 注: この手順は 2 h までの短いアクイジション時間帯に有用です。長い用語獲得の幼虫は代替方法 20 を使用してマウントする必要があります

13。画像の処理および取得データの解析

注: 2.90 GHz プロセッサ、8.00 GB のメモリ 1.00 GB のメモリとビデオカードとパソコンで画像処理を行いました

。 画像処理の選択のソフトウェアの
  1. オープン、取得したデータセットです。オープン ソフトウェア フィジー LSFM データ処理・分析 21 勧めします
  2. 画像解析ソフトウェアで画像を向上させる明るさとコントラストのレベルを調整します
    。 注: 固定パラメーターはこのケースで使用される、選択、" 自動 " オプションは、初期の強化を取得することができます
  3. は、投資収益率を選択します
    。 注: 個々 の寄生虫を追跡、フィジーが両方手動および自動追跡プラグインを利用します

14。幼虫のイメージを回復する

  1. 削除 agarose を使用してから慎重に幼虫微細鉗子と髪ループ ツール。15 分は 28 ± 0.5 ° C でインキュベーターに幼虫を帰国後、新鮮な卵水と回復のためのチェックに戻って魚を転送
  2. はまた、tricaine の過剰摂取とイメージの幼虫を安楽死させるのに進みます。その後、次亜塩素酸ナトリウムの溶液に幼虫を紹介 (6.15 %naclo) 寄生虫を殺すために 5 分間。機関によると処分 ' s 標準プロトコル

Representative Results

注入のための最適な条件は:

ゼブラフィッシュの幼虫のグループは、24、48、72、96、および 120 で注入した hpf、別の解剖学的サイトで、彼らの生存は毎日 5 日間調べた。24 で胚が注入された後 5 日間はポスト噴射、hpf が 6.25% (2/32) 生存 95% (38/40) 48 で注入された幼虫の hpf を生き延びたに対し。コントロールとしては、車両として 1x PBS で幼虫を投与されました。車両注入・寄生虫注入幼虫、魚の生存率に依存寄生効果がないことを示すの間の生存率の差は認められなかった (p = 0.08)。72 120 hpf 間に注入された幼虫は、一定注入量で 48 hpf 注入幼虫に匹敵する生存率を持っていた。ここで紹介するすべての手順、操作、注射後臓器や明らかに損傷することがなく簡単に不可解の皮膚になったの容易にするため 48 hpf 幼虫が使用されました。

48 で注入された幼虫 hpf が心膜内に注入、尾筋、後脳室、耳胞、脊索、および卵黄嚢のキュビエのダクト。異なる解剖学的サイトで注入された幼虫の生存率の差はありませんでした。しかし、注入する最速および最も簡単な地域はキュビエ管 (図 1映画 1) 卵黄嚢の前部にあります。そのサイトで注射は、重要な構造への損傷のリスクが低いと高いボリュームの導入を許可されます。さらに、24-72 hpf の間この地域は発展途上の血管および心臓11に直接アクセスする最適なサイトです。

寄生虫 LSFM を用いた可視化:

キュビエのダクトにt. の原因の注入に続く 8-10 分以内寄生虫は、CFSE 蛍光信号と幼虫の光透過性のため LSFM を利用したゼブラフィッシュ幼虫で識別されました。接種後どちらかが循環システムまたは血流 (図 2図 3) の方向に旅の周りの壁に付着した寄生虫が観察されました。心臓の収縮、寄生虫の付着の分子機構 (映画 2、映画 3 本の脊椎動物モデルで有効であることを示すと発振寄生虫まま房室弁など、心臓の構造に接続されているとき、補足的な映画 1)。T. の原因では、後で再吸収しゼブラフィッシュ腸22の一部となる構造を (図 2映画 2)、仔魚の卵黄嚢の壁に付着しました。これは心筋や消化器系23,24で寄生虫が感染したヒトの慢性疾患フェーズ中に何が起こるかのようかもしれません。接続されていない (図 3映画 4) 赤血球と同じ方向に血流を介して寄生虫が漂着しました。寄生虫は魚の異なる大型船舶でられなかったが、心膜と血流 (図 2図 3補足ムービー 2) を含む隣接する卵黄地域より多かった。

注射後 10 分で、血管およびすぐ画面異なる解剖学的サイトへ (40 倍の倍率で LSFM の限られた視野のための魚のことができないに沿って分布による寄生虫のスポットの単一の形態により困難だった).ポスト噴射 (hpi) 24 h 後、CFSE 信号開始開発腸 (補足図 1) 付近に蓄積します。

Figure 1
図 1:最適な注射部位。(A) 画像の幼虫 48 hpf 正規万国実体写真を使用してキュビエ (黄色の矢印) のダクトに最適な注入サイトを表示します。(B) 拡大鏡はキュビエ (黄色の矢印) のダクトを表示する、ボックスの表示します。スケール バー = 200 μ m (A)、(B) 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:48 hpf 幼虫で静的な寄生虫の LSFM イメージT. 原因寄生虫 (黄色の矢印) のまま時間経過シーケンス中の卵黄嚢の壁に付着 (7.2 17.2 s s、および 27.2 s)、寄生虫注射後約 〜 15 分。少なくとも 30 の取得期間中に寄生虫の位置の変更は認められなかったは、アトリウム; s.v、心室。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:LSFM を用いた膜空間の旅寄生虫の軌跡。漂流中に心嚢スペース (PS)、血流 (赤で示されているトラック) の方向に続くt. 原因寄生虫を追跡ことができます寄生虫注射後約 〜 15 分。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Movie 1
映画 1: 48 幼虫で卵黄の血液循環谷 hpf 。幼虫 48 の映画 hpf 血液循環谷やキュビエ正規万国実体写真を使用してのダクトを示します。さまざまな地域は、ダクト全体循環赤血球を表示するビデオの間に焦点を当てています。黄色の矢印は、最適な注射部位を示しています。ムービーが記録された寄生虫注射後約 10-15 分。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Movie 2
映画 2: t. 原因寄生虫は、卵黄嚢の壁に添付します。寄生虫注射後t. 原因寄生虫まま卵黄嚢約 10-15 分に付着する幼虫 48 hpf 表示の LSFM 映画。少なくとも 30 の取得期間中に寄生虫の位置の変更が認められず、アトリウム; s.v、心室。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Movie 3
映画 3: 心の壁にt. 原因寄生虫添付します。幼虫 48 の LSFM 映画、 t. の原因寄生虫 remai を示す hpfn は強い心臓の収縮にもかかわらず、心臓血管の壁に付着した寄生虫注射後約 10-15 分。赤血球は、黒い丸い影として観察することができます。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Movie 4
映画 4: 寄生虫心嚢のスペースに移動します。心膜宇宙を漂流幼虫 48 hpf を示すt. 原因寄生虫の LSFM 映画。同様の軌跡を以下 2 つ寄生虫は異なる時点 (赤い丸と黄色い丸で ID 2 の ID 1) でたどることができます。ムービーが記録された寄生虫注射後約 10-15 分。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

補足図 1: 卵黄の蓄積の CFSE 蛍光信号します。48 で注入された野生型幼虫の万国実体写真画像キュビエのダクトで hpf。2 日間ポスト噴射 (48 時間) 後、CFSE 蛍光信号は、卵黄に徐々 に蓄積されます。スケール バー = 500 μ m.の図をダウンロードするここをクリックしてください

補足映画 1: 壁や循環器系のバルブに接続されている寄生虫。万国実体写真時系列画像 48 で注入された野生型幼虫の hpf。画像は、房室弁で心臓の筋肉の収縮と同期で移動t. 原因寄生虫をキャプチャ 0.2 秒間隔で撮影されます。映画は、寄生虫の注射後約 30 分を記録しました。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

補足映画 2: 脳室周囲空間と卵黄で移動、付着寄生虫。LSFM 映画、幼虫 48 hpf の示すt. 原因寄生虫漂流または心膜または卵黄に付着します。透過光のビューも認めた最初の 5 s。5.2 25.8 s から蛍光表示を認めた。ムービーが記録された寄生虫注射後約 10-15 分。ビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください

Discussion

本研究は、病原体挙動調査生体内で動物モデルとしてのゼブラフィッシュの利点を強調表示します。特に、本研究は、その自然環境のt. の原因病原体を可視化する手法を提案する: 血液循環。魚の循環微小環境の環境は哺乳類のそれに匹敵する、trypanosomatids は旅行、免疫系を回避、その環境25感染細胞へのアタッチのメカニズムを展開させた。このプロトコルでは、ひと細胞でのt. の原因の文化および蛍光標識べん毛の形のそれに続く分離の最適な手順の説明を提供しています。それは、寄生虫の後でマウントおよび LSFM を用いた可視化用透明ゼブラフィッシュ注入成功に対する適切な設定を示しています。最後に、このプロトコルは、寄生虫の場所と LSFM を用いた循環運動の効率的かつ効果的な生体内イメージングのための提案を提供しています。

Trypanosomes の鞭毛が細胞体から流れる後方地域から出てくるし、ハング無料生物26の前部で。T. の原因は寄生虫の体全体が起伏体前鞭毛を振ることによってそれ自身を推進します。鞭毛運動はt. グリコシルホスファチジルイノシトール27 (アフリカ睡眠病の病原) の場合のように、寄生虫の運動に不可欠なだけでなくがt. の原因5 で実証されているよう細胞感染を使用されても ,28。ゼブラフィッシュはt. の原因の自然宿主ではないが、ここで説明されているプロトコルを使用して開発心臓血管の循環システムで寄生虫の運動を学ぶことができます。また、コイ、ゼブラフィッシュ、 t. carassii t. borreli25.などのクラスに感染する trypanosomes 種があります。これらの寄生虫の種は動きとこれらの trypanosomatids; の付着機構をリアルタイムで勉強するされる可能性があります。このような研究は、哺乳類の細胞感染プロセスに洞察力を貸すことができます。

本研究では運動のt. の原因を注入した寄生虫が接種魚の心臓血管の循環を介して観測旅行、不透明な赤血球とともに移動および血管壁の構造に付着します。我々 は長作動距離 10 X 無彩色で家造られた LSFM を使用空気の目的 (17.6 mm) 0.25 の開口を有する照明アーム。X の 0.8 の開口と 3.5 mm の作動距離アポクロマート水浸対物レンズ 40 は、検出アームに使われました。検出の目的は、商工会議所外照明目的は試料室に浸っていた。商工会議所、coverslip で密封とロレンツォで表した照明ビームが部屋を入力許可光学接着剤内のポート18照明を使用しました 50 mW DPSS レーザー 488 nm 音響光学波長可変フィルター変調したそのパワー。検出パスは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) または FITC と互換性のあるフィルターを使用します。(自動回転) で理想的な毛細管試料ホルダー、試料室の温度制御を搭載した光シート顕微鏡は、このアプリケーションに適してする必要があります。顕微鏡を揃え、必要であればメーカーの指示または取得前、にユーザーの実験室の標準的なプロトコルに従って校正されて必要があります。このプロトコルでは、スピム ソフトウェア19を使用して顕微鏡を制御しました。

ゼブラフィッシュの循環、幼虫寄生添付ファイルが有効であることに注意してくださいすることが重要です。枢機卿の静脈では、寄生虫のいくつかの分までがくっついたままで中心部に彼らは弁と心臓の収縮と振動壁に開催。T. の原因は血流の方向にドリフトを流れる赤血球と対話するかどうかを明らかにするためにさらなる研究が残っています。以前の in vitro研究固体構造 (すなわち、血液細胞) の存在または体外血液を模倣する液体の粘度上昇を示すが、運動と寄生虫の速度に大きな影響を及ぼします9

Amastigotes エスケープ貪食細胞、当初感染細胞型29後人間のt. の原因の感染のコースについて多くの質問があります。たとえばの方法に彼らは彼らの標的器官に到着?最寄りの臓器、心臓、消化器、中枢神経系などに親和性のメカニズムは何ですか。興味深いことに、この研究では寄生虫最初をイメージしました中心に寄生虫の最高密度のサイトだったので。ただし、注射後 7 日で、CFSE 信号は発展途上の腸でその後蓄積。魚や哺乳類の解剖学は異なるが、この研究の結果を示す親和性、寄生虫展示個体の違いにもかかわらず知られている推奨されるターゲット臓器への親和性を捉えた。この研究の重要な制限が 1 つの実験で使用される温度にかかわる。ゼブラフィッシュの幼虫は、全体の手順中に約 28 °C を保管すべき。この温度はベクトル ホスト (クロタマゴバチ亜科の昆虫) に類似しているかもしれません、しかし最終的なホスト (およそ 37 ° C) を構成する温血の哺乳類からはかなり異なるです。T. の原因は両方のホストのべん毛の生活形態を持っている知られています。しかし、この要因が動物の生体内での挙動の影響を必要があることを念頭に重要です。

Fish´s 適応免疫系は 4 週間ポスト受精までが成熟した、生得の免疫組織は開発の10の早い段階でアクティブ。48 または 96 hpf 早くも trypanosomes (データは示されていない) というラベルの付いたことを巻き込んだ貪食細胞を認めた.これは、寄生虫の可視化のための時間のウィンドウが制限されます。ただし、研究 fish´s 免疫応答の評価に焦点を当てる場合は、後の段階で注入を推奨可能性があります。また、トランスジェニック魚行ラベルのマクロファージに寄生虫の注射や免疫系の他の細胞は寄生虫添付ファイルと考えられるエンドサイトーシス機構の勉強に役に立つすることができます。寄生虫が CFSE 付け、トランスジェニック細胞ラベルに GFP、べきではないスペクトルの黄色または赤の端にマーカーが必要な場合に注意することが重要です。

寄生虫の動きの詳細な方向性を評価するためには、3 次元 (3 D) で彼らの軌跡を追うに便利があります。3 D 可視化とプロセスの再構築、高速システムが必要です。このプロトコルで使用される機器、それは 1 つの平面で寄生虫を視覚化することが可能だけです。この場合、我々 は寄生虫の動きの間に焦点面の安定性を維持し、1 つの平面でその軌跡を記録を優先しました。

ここで提案された方法論は、心血管系の循環で寄生虫の動作をさらに調査に道を開きます。要約すると、ゼブラフィッシュ幼虫の中ライブ蛍光寄生虫をイメージングする本質的なステップがあります。(i) 早く孵化した胚 (24-48 hpf) や幼虫や色素沈着はなくと 72 96 hpf 間動物の使用、透明性とを簡単に挿入。(貪食細胞によって寄生虫クリアランスを避けるために注入後、できるだけ早く画像 ii) 幼虫(iii) (例えば、心嚢領域) に関心のあるサイトで LSFM の集中および焦点を維持します。この小説の手順により、初めて生きている有機体のt. の原因を検討する可能性の提供、自然感染ニッチに匹敵する環境で trypomastigotes の可視化ができます。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

この作品は、 Vicerrectoría デ研究デ ラ ロス ・ アンデス大学、および USAID の研究と技術革新のフェローシップ プログラムからConvocatoria Interfacultadesによって支えられました。魚の維持、支援、フアン ラファエル ブイトラゴと Yeferzon アルジラ川に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-10 μL Micropipette Fisherbrand 21-377-815
Agarose RA Amresco N605 Regular
Agarose SFR Amresco J234 Low Melting point
Aquarium salt Instant ocean SS15-10
Cell Count chamber Boeco Neubauer 
Cell culture flasks Corning 430639
Centrifuge Sorvall Legend RT
CFSE ThermoFisher C34554
Detection objective Nikon 40x 0.8NA  40x CFI APO NIR
DMEM medium Sigma-Aldrich D5648
Dumont #5 fine forceps World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Fetal calf serum (FCS) Eurobio CVFSVF00-01
Filter Chroma ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting Vitrez Medical 160215
Glass capillaries for pulling needles World precision instruments TW100-4
Glucose Gibco A2494001
HEPES Gibco  156300-80
Incubator Thermo Corporation Revco
Larval microinjection mold Adaptive Science Tools I-34
Laser Crystalaser DL488-050
L-glutamine Gibco 250300-81
Methylene blue Albor Químicos 12223
Micromanipulator  Narishige MN-153
Micromanipulator system Sutter Instrument MP-200 For LSFM 
Micropipette puller device  Narishige PC-10
Microscope  Olympus CX31
Microscope (inverted) Olympus CKX41
Multipurpose microscope Nikon AZ100M
Neubauer counting chamber Boeco Germany
Penicillin-streptomycin Gibco  15140-163
Petri dish 94x16 Greiner bio-one 633181
Plastic pasteur pipette Fisherbrand 11577722
Rotation stage Newport CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R4130
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Stereoscope Nikon C-LEDS
Tricaine (MS-222) Sigma-Aldrich 886-86-2
TRIS Amresco M151
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco R-001-100
Tubes 15 ml Corning 05-527-90

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