RGB- en spectrale Root Imaging voor Plant fenotypering en fysiologisch onderzoek: experimentele opzet en Imaging protocollen

Environment
 

Summary

Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor de beoordeling van de grond gekweekte plant wortelstelsel met RGB- en Hyperspectrale beeldvorming. Combinatie van RGB-afbeelding tijd serie met chemometric informatie van hyperspectrale scant optimaliseert inzichten in plant wortel dynamiek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. J. Vis. Exp. (126), e56251, doi:10.3791/56251 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beter begrip van de plant wortel dynamiek is essentieel voor de verbetering van de hulpbronnenefficiëntie gebruik van landbouwsystemen en verhogen de weerstand van gewas cultivars tegen milieu benadrukt. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor RGB- en Hyperspectrale beeldvorming van het wortelstelsel. De benadering wordt rhizoboxes gebruikt waar de planten groeien in natuurlijke grond over een langere tijd te observeren volledig ontwikkelde wortelstelsel. Experimentele instellingen zijn geïllustreerd voor het beoordelen van rhizobox planten onder waterstress en bestuderen van de rol van de wortels. Een RGB-imaging installatie is beschreven voor goedkope en snelle kwantificering van wortel ontwikkeling na verloop van tijd. Hyperspectrale beeldvorming verbetert de segmentering van de wortel van de achtergrond van de bodem in vergelijking met de RGB-kleur gebaseerd drempelmethode. De bijzondere kracht van Hyperspectrale beeldvorming is de overname van chemometric informatie over het systeem van de root-bodem voor functioneel begrip. Dit is aangetoond met hoge resolutie water inhoud mapping. Spectrale imaging is echter complexer in Beeldacquisitie, verwerking en analyse in vergelijking met de RGB-aanpak. Een combinatie van beide methoden kan een veelomvattende beoordeling gegeven van het wortelsysteem optimaliseren. Toepassingsvoorbeelden integratie van wortel en bovengrondse eigenschappen worden gegeven voor de context van plant fenotypering en planten fysiologisch onderzoek. Verdere verbetering van de beeldvorming van de wortel kan worden verkregen door het optimaliseren van de kwaliteit van de afbeelding RGB met betere verlichting met behulp van verschillende lichtbronnen en door uitbreiding van afbeelding analysemethoden op root zone-eigenschappen uit de spectrale gegevens afleiden.

Introduction

Wortels voorzien planten zoals opslag van verschillende essentiële functies assimileert, ankerplaats van terrestrische planten uit de bodem, en de opname en het transport van water en voedingsstoffen1. Vanuit een evolutionair oogpunt, de vorming van wortel assen wordt beschouwd als een fundamentele voorwaarde voor het ontstaan van land planten2. Ondanks deze belangrijke rol, hebben historisch wortels bezet slechts een marginale positie in biologisch onderzoek. In recentere tijden, echter er is steeds meer wetenschappelijke belangstelling in plant wortelstelsel zoals blijkt uit Figuur 1.

Figure 1
Figuur 1: Relevantie van wortel studies in Plantenwetenschappen.
Aantal wortel gerelateerde studies als een percentage van alle gepubliceerde plant studies in SCI tijdschriften in de afgelopen decennia. Zoekresultaat van Scopus met behulp van de trefwoorden "plant" en "plant en root". Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Twee belangrijke redenen kunnen worden veronderstelde om ten grondslag liggen aan de recente vooruitgang in het onderzoek van de wortel. Eerste, terrestrische vegetatie wordt blootgesteld aan vaker milieu benadrukt als gevolg van veranderingen in het aardsysteem3. In het kader van landbouwgewassen productie geschat wordt dat wereldwijd ongeveer 30% van het landbouwareaal wordt beperkt door water en fosfor4,5. Stress reductie van gewasopbrengst zijn een hoofdoorzaak van significante opbrengst leemtes die wereldwijd worden geschat op lagere 50% van de potentiële productiviteit voor neerslag agro-ecosystemen6. Naast lage resourcebeschikbaarheid, is dit ook gerelateerd aan arme gebruik efficiënt beheer van hulpbronnen, d.w.z. onvoldoende capaciteit van een installatie te benutten van de beschikbare middelen7. Dit resulteert in verlies van mobiele bronnen zoals nitraat die negatief van invloed kan zijn op de andere ecosystemen. De huidige wereldwijde stikstof gebruik efficiëntie wordt bijvoorbeeld geschat op 47%8. Betere resource gebruik efficiëntie via verbeterde managementmethoden en cultivars is daarom van groot belang voor zowel duurzame groei landbouwprodukten alsook wat betreft de duurzaamheid van het milieu. In deze context fabriek wortels worden beschouwd als een kerndoel voor verbeterde gewassen en bijsnijden systemen9,10.

Een tweede belangrijk achtergrond voor de recente belangstelling voor plantenwortels is technologische vooruitgang in meetmethoden. Root methoden hebben lang zijn beperkt door twee belangrijke uitdagingen: voor meting van de wortels van planten die groeien in de bodem worden geïsoleerd voor kwantificering moesten, meestal door het wassen van11, gevolg daarvan verstoringen ondergaat de architecturale rangschikking van wortel assen. In-situ wortel observatie met behulp van de opgraving methoden, waardoor het behoud van de natuurlijke ligging van de wortels in de bodem, voor Botanische beschrijving12zijn gebruikt. Nog steeds zijn zeer tijdrovend en dus niet voldoen aan de eisen van de doorvoer van vergelijkende structurele-functionele wortelsysteem analyse. Aan de andere kant werden hoge gegevensdoorvoer methoden voor root het platform meting meestal gedaan op kunstmatige media en voor seedling planten13 waar de extrapolatie naar de omgeving van de natuurlijke groei van planten is twijfelachtig14.

De recente boom van wortel onderzoek is nauw verbonden met het voorschot in imaging methoden15. Imaging benaderingen in wortel studies kan ruwweg worden ingedeeld in drie typen. Ten eerste zijn er hoge resolutie 3D methoden zoals CT en MRI16. Deze methoden zijn meest geschikt om interactie processen van plantenwortels met grond, te bestuderen, zoals droogte veroorzaakte xylem longembolie17. Meestal worden ze toegepast op relatief kleine steekproeven waar zij gedetailleerde opmerkingen maken. Een vergelijking van CT en MRI voor verschillend formaat potten en fijne wortel imaging is beschikbaar in18. Ten tweede, zijn er high-throughput beeldvormende methoden19,20. Deze methoden zijn meestal op basis van gemeenschappelijke 2D RGB beeldvorming van wortels groeien op kunstmatige media (gel, kiemkracht papier) waar hoog contrast kan relatief eenvoudig dissectie tussen wortels en achtergrond. Ze zijn geschikt voor hoge doorvoer vergelijking tussen zaailing wortel eigenschappen van verschillende gewas genotypen onder gestandaardiseerde kunstmatige groeiende voorwaarden13. Tussen deze twee benaderingen zijn rhizobox methoden: ze gebruiken 2D beeldvorming van wortels groeien in de bodem over langere periode en hebben middellange doorvoer21,22. Een recente uitdaging aan (2D) wortel imaging is te vangen ook indicatoren van wortel functionaliteit naast de beschrijving van de structuur23.

In het huidige document presenteren we de experimentele protocollen voor imaging-rhizobox root-systemen die gebruikmaken van (i) een goedkope en eenvoudige op maat gemaakte RGB imaging setup en (ii) een complexere NIR imaging setup gegroeid. Voorbeeld van de resultaten van deze twee opstellingen worden getoond en besproken in het kader van de plant fenotypering en de fysiologische plantenonderzoek.

Discussion

De protocollen bieden twee complementaire benaderingen voor grond gekweekte wortelsysteem imaging. Een cruciale stap voor betrouwbare experimentele resultaten is het invullen van de rhizoboxes die moet zorgen voor een zelfs en homogene substraat laag op het front glas bieden strakke wortel-bodem contactpersoon bij het kijkvenster en voorkomen van de luchtspleet. Dit is de belangrijkste reden voor het gebruik relatief fijne gezeefde bodem van < 2 mm: grotere aggregaten resulteren in hogere oppervlakte morfologie bij het kijkvenster met leegtes tussen aggregaten. Naast een hoger risico van wortel tip uitdroging vereist dit ook complexere afbeelding verwerkingstechnieken voor water toewijzing31.

Wijzigingen van het protocol is daarom gericht op verbeterde en snel vullen van rhizoboxes. Momenteel vullen tijd is ongeveer 30 minuten per doos. Bovendien gebruik van rhizoboxes met twee glazen ramen voor beeldvorming van de beide zijden en wijzigingen aan het optimaliseren van de homogeniteit van de verlichting voor betere RGB-afbeeldingen worden getest. Verdere uitbreiding van de hardware zou ook integratie van vlakke optodes32 , alsmede precisiecapaciteit imaging33 in het rhizobox-systeem kunnen overwegen. Dit valt echter buiten de huidige upgraden activiteiten.

Software wijzigingen gericht op automatische beeldregistratie fuse boven en beneden RBG beelden34. Hyperspectrale benadert beeldvorming geavanceerde functie van ongecontroleerde winning28 evenals gevoeliger gecontroleerde doel detectiemethoden zoals SVMs35 worden getest. Waardoor maakt de hyperspectrale gegevens mogelijk voor de beoordeling van meerdere bodem, rhizosfeer en wortel eigenschappen36. Bovendien is bedoeld voor het ontwikkelen van een (semi) geautomatiseerde software voor rhizobox wortel afbeeldingen op basis van een gewijzigde versie van het wortelsysteem Analyzer37 te kwantificeren morfologische (diameter, lengte, oppervlak) en architecturale kenmerken (vertakkende frequentie, vertakking van de hoeken).

De belangrijkste beperking van het protocol in vergelijking met 3D imaging benaderingen is de beperking tot de oppervlakte zichtbaar wortel en de eigenschappen van de rhizosfeer. Toch is gebleken dat de zichtbare wortel trekken een betrouwbare proxy voor de hele root systeem21 zijn. De rhizobox-techniek is gemakkelijk gecombineerd met traditionele destructieve bemonstering (wassen) aan het einde van de dynamische groei imaging om te valideren van de relatie van zichtbare vs. totale wortelsysteem eigenschappen. Zoals deze relatie tussen soorten21 variëren kan, wordt destructieve bemonstering aanbevolen om een betrouwbare afleiding van de zichtbare eigenschappen voor elke nieuwe fenotypering series met een ander gewas soorten.

Het belangrijkste voordeel van het hier gepresenteerde protocol is de combinatie van realistische groeiomstandigheden (bodem), relatief hoge potentiële doorvoer voor stoffelijk opgelost RGB beeldvorming en gevolgtrekking op basis functionaliteit (bijvoorbeeld de opname van water) via de chemometric wortel en rhizosfeer gegevens van Hyperspectrale beeldvorming. Waardoor de methoden overwint gevolgtrekking beperkingen in hoge-doorvoer zaailing en niet-bodem wortel imaging methoden14, terwijl hierdoor gedeeltelijk diepe fenotypering inzicht in functionele processen met minder experimentele complexiteit en hogere doorvoer in vergelijking met geavanceerde 3D methoden15.

In de aankomende experimenten het protocol worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van mycorrhiza wortelsysteem ontwikkeling en functionaliteit van peulvruchten, ook wat betreft fenotypering wortel kenmerken in verband met de bodemstructuur, stikstof en koolstof soorten cover gewas fietsen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen financiering uit de Oostenrijkse wetenschap Fonds FWF via het Project nummer P 25190-B16 (de wortels van de droogte resistentie). Oprichting van de Hyperspectrale beeldvorming infrastructuur werd financieel ondersteund door de federale regering van Neder-Oostenrijk (Niederösterreich Land) via het project K3-F-282/001-2012. Aanvullende financiering voor de suikerbieten experiment van AGRANA onderzoek werd ontvangen & Innovation Center GmbH (ARIC). De auteurs bedanken Craig Jackson voor technische ondersteuning tijdens het experiment en de Engelse correctie van het manuscript. Wij erkennen ook Markus Freudhofmaier die hebben bijgedragen aan de vestiging de RGB-imaging setup en Josef Schodl voor bouw van de montage van de rhizobox.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhizobox Technisches Büro für Bodenkultur Experimental builder
LED Lamps ATUM HORTI 600 Klutronic AHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 Day Juwel Aquarium 86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W Conrad 593384 - 62
Canon EOS 6D Canon Austria GmbH 8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32 Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013 Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR camera Xenics XEN-000105
Spectrograph Imspector N25E Specim
Hyperspectral imaging scanner Carinthian Tech Research AG Experimental builder Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software
Matlab R2106a Mathworks Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning
AP4 Poromoeter Delta-T-Devices
LI-3100C Area Meter LI-COR
BASF Styradur polystyrene sheets Obi Baumarkt 9706318 Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284 (2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9, (10), 105011 (2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442 (2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1 (2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29 (2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679 (2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164, (1), 24-35 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics