RGB und spektrale Wurzel Bildgebung für die Pflanze Phänotypisierung und physiologischen Forschung: Versuchsaufbau und Imaging-Protokolle

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Summary

Ein experimentelles Protokoll ist für die Beurteilung der Boden gewachsen Pflanze Wurzelsysteme mit RGB und hyperspektralen Bildgebung vorgestellt. Kombination von RGB Bild Zeit Serie mit chemometrischen Informationen aus hyperspektrale scannt optimiert Einblicke in Werk Wurzel Dynamik.

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Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. J. Vis. Exp. (126), e56251, doi:10.3791/56251 (2017).

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Abstract

Besseres Verständnis der Pflanze Wurzel Dynamik ist wesentlich zur Verbesserung der Ressourceneffizienz Nutzung landwirtschaftlicher Systeme und erhöhen die Widerstandskraft der Ernte Sorten gegen Umweltbelastungen. Ein experimentelles Protokoll ist für RGB und hyperspektralen Bildgebung des Wurzelsystems vorgestellt. Der Ansatz verwendet Rhizoboxes, wo Pflanzen wachsen in natürlichen Böden über einen längeren Zeitraum voll entwickeltes Wurzelsystem zu beobachten. Experimentelle Einstellungen sind beispielhaft für die Bewertung Rhizobox Pflanzen unter Wasserstress und Untersuchung der Rolle von Wurzeln. Eine RGB-Image-Setup wird für günstige und schnelle Quantifizierung der Wurzelentwicklung im Laufe der Zeit beschrieben. Hyperspektrale Bildgebung verbessert die Segmentierung der Wurzel aus dem Boden-Hintergrund im Vergleich zu RGB-Farbe Schwellwerte. Die besondere Stärke der hyperspektralen Bildgebung ist der Erwerb von chemometrischen Informationen über das Wurzel-Boden-System für funktionales Verständnis. Dies wird mit hoher Auflösung Wasser Content Mapping gezeigt. Spektralen Bildgebung ist jedoch viel komplexer in Bilderfassung, Verarbeitung und Analyse im Vergleich zu den RGB-Ansatz. Eine Kombination beider Methoden kann eine umfassende Bewertung des Wurzelsystems optimieren. Anwendungsbeispiele, die Integration von Wurzel und oberirdische Züge sind für den Kontext der Phänotypisierung und Pflanze physiologischen Pflanzenforschung gegeben. Weitere Verbesserung der Wurzel Bildgebung erhalten Sie durch die Optimierung der Bildqualität RGB mit bessere Ausleuchtung mit verschiedenen Lichtquellen und durch Verlängerung der Bildanalyseverfahren auf Wurzel Zoneneigenschaften von spektralen Daten abzuleiten.

Introduction

Wurzeln geben mehrere wesentliche Funktionen für Pflanzen wie Lagerung von in sich aufnimmt, Verankerung der terrestrischen Pflanzen im Boden, und Aufnahme und Transport von Wasser und Nährstoffen1. Aus evolutionärer Sicht gilt die Bildung der Wurzel Achsen eine grundlegende Voraussetzung für die Entstehung von Land Pflanzen2. Trotz dieser wichtigen Rolle haben Wurzeln historisch nur eine marginale Position in der biologischen Forschung besetzt. In neuerer Zeit jedoch steigt wissenschaftliches Interesse an der Pflanze-Wurzel-Systeme wie in Abbildung 1.

Figure 1
Abbildung 1: Relevanz der Wurzel Studien in Pflanzenwissenschaften.
Anzahl der Wurzel Studien im Zusammenhang als Prozentsatz aller veröffentlichten Werk Studien in SCI-Zeitschriften in den letzten Jahrzehnten. Suchergebnis von Scopus mit Schlüsselwörtern "Pflanze" und "Pflanze und Wurzel". Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zwei Hauptgründe können vermutet werden, um die jüngsten Fortschritte in der Wurzel Forschung zugrunde liegen. Erste, terrestrische Vegetation ist häufiger Umweltbelastungen infolge globaler Wandel3ausgesetzt. Im Rahmen der landwirtschaftlichen Pflanzenproduktion wird geschätzt, dass weltweit rund 30 % der landwirtschaftlichen Nutzfläche durch Wasser und Phosphor4,5begrenzt sind. Stressabbau der Ernteerträge sind ein Hauptgrund für erhebliche Ausbeute Lücken, die unteren 50 % der möglichen Produktivität für Rainfed Agrarökosysteme6weltweit geschätzt werden. Neben niedrigen Ressourcenverfügbarkeit ist dies auch schlechte Nutzung Ressourceneffizienz, d.h. ausreichender Kapazität einer Anlage zur verfügbaren Ressourcen7nutzen zusammen. Dies führt zu Verlusten von mobilen Ressourcen wie Nitrat die andere Ökosysteme negativ beeinflussen können. Die aktuelle globale Verwendung Stickstoffeffizienz beläuft sich beispielsweise auf 47 %8. Bessere Ressourcennutzung Effizienz durch verbesserte Managementmethoden und Sorten ist daher von großer Bedeutung sowohl für nachhaltiges Wachstum der landwirtschaftlichen Ausgänge sowie für ökologische Nachhaltigkeit. In diesem Kontext Pflanze Wurzeln gelten eine wichtige Zielgruppe für bessere Ernten und Zuschneiden Systeme9,10.

Ein zweiter wichtiger Hintergrund für das aktuelle Interesse an Pflanzenwurzeln ist technologischer Fortschritt in der Messmethoden. Root-Methoden haben lange von zwei zentralen Herausforderungen eingeschränkt worden: für die Messung der Wurzeln von Pflanzen, die wachsen im Boden isoliert für die Quantifizierung, werden meist durch Waschen11, mussten dabei stören die architektonische Anordnung der Wurzel Achsen. In-Situ -Wurzel-Beobachtung mit Ausgrabung Methoden, dadurch erhalten die natürliche Lage der Wurzeln im Boden, für botanische Beschreibung12verwendet worden. Sie sind sehr zeitaufwendig und somit erfüllen nicht die Anforderungen an den Durchsatz der vergleichende strukturelle funktionelle Wurzelsystem Analyse. Auf der anderen Seite waren Hochdurchsatz-Methoden zur Wurzel Architektur Messung meist erfolgt auf künstliche Medien und für Setzling Pflanzen13 wo die Extrapolation auf die natürlichen Wachstums Umwelt Pflanzen fraglich14.

Der jüngste Boom der Wurzel Forschung ist eng mit der Fortschritt im Bereich der bildgebenden Methoden15verbunden. Imaging-Ansätze in der Wurzel Studien kann grob in drei Typen gruppiert werden. Erstens gibt es hochauflösende 3D Verfahren wie CT und MRT16. Diese Methoden eignen sich Interaktionsprozesse der Pflanzenwurzeln mit dem Boden, zu studieren wie Dürre Xylem Embolie17induziert. In der Regel sind sie vergleichsweise kleine Proben zugewiesen, wo sie detaillierte Beobachtungen erlauben. Ein Vergleich der CT und MRT für unterschiedlich große Töpfe und feinen Wurzel Imaging ist in18vorgesehen. Zweitens gibt es Hochdurchsatz-bildgebenden Methoden19,20. Diese Methoden sind meist basierend auf gemeinsamen 2D RGB Darstellung der Wurzeln wachsen auf künstliche Medien (Gel, Keimung Papier), wo hoher Kontrast ermöglicht vergleichsweise einfache Dissektion zwischen Wurzeln und Hintergrund. Sie eignen sich für hohen Durchsatz Vergleich zwischen Sämling Wurzel Merkmale der verschiedenen Ernte Genotypen unter standardisierten künstlichen wachsenden Bedingungen13. Zwischen diesen beiden Ansätzen werden Rhizobox Methoden: sie verwenden 2D Darstellung der Wurzeln wachsen im Boden über längere Zeit und haben mittleren Durchsatz21,22. Eine aktuelle Herausforderung an (2D) Wurzel Bildgebung soll auch Indikatoren für die Wurzel Funktionalität neben der Beschreibung der Struktur23erfassen.

In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir die experimentelle Protokolle für imaging Rhizobox Wurzelsysteme mit (i) eine günstige und einfache maßgeschneiderte RGB bildgebenden Setup und (Ii) ein komplexeres NIR bildgebenden Setup gewachsen. Beispielergebnisse aus diesen zwei Setups werden gezeigt und diskutiert im Zusammenhang mit der Anlage Phänotypisierung und physiologischen Pflanzenforschung.

Discussion

Die Protokolle bieten zwei komplementäre Ansätze für Boden gewachsen Wurzelsystem Bildgebung. Ein entscheidender Schritt für die zuverlässige experimentelle Ergebnisse ist von der Rhizoboxes Füllung, die eine gleichmäßige und homogene Substratschicht an der Frontscheibe zu engen Wurzel-Bodenschluss an das Beobachtungsfenster und vermeiden Luftspalte zu gewährleisten. Dies ist der Hauptgrund für die vergleichsweise gut gesiebten Boden verwenden < 2 mm: höhere Oberflächenmorphologie am Sichtfenster mit Hohlräumen zwischen den Aggregaten führen zu größere Aggregaten. Neben ein höheres Risiko der Wurzel Tipp Dehydrierung erfordert dies auch komplexere Bildverarbeitungstechniken für Wasser Abbildung31.

Änderungen des Protokolls konzentrieren sich deshalb auf verbesserte und schnelle Befüllung des Rhizoboxes. Derzeit Füllzeit ist ca. 30 Minuten pro Box. Des weiteren Verwendung von Rhizoboxes mit zwei Glasfenster für die Bildgebung von beiden Seiten und Änderungen an Homogenität der Ausleuchtung für bessere RGB-Bilder optimieren werden getestet. Weitere Hardware-Erweiterung sollten auch Integration von planaren Optodes32 sowie Kapazität imaging33 in das Rhizobox-System. Dies ist jedoch darüber hinaus aktuelle Upgrade Aktivitäten.

Softwareänderungen konzentrieren sich auf automatische Bild-Registrierung zur Sicherung oben und unten RBG Bilder34. Bildgebendes erweiterte unbeaufsichtigt Merkmalsextraktion Ansätze für hyperspektrale28 sowie empfindlicher betreute Ziel Nachweismethoden, wie z. B. SVMs35 getestet. Dabei erlauben die hyperspektrale Daten möglicherweise für die Bewertung von mehreren Boden, Rhizosphäre und Wurzel Eigenschaften36. Außerdem soll es eine (Semi) entwickeln automatisierte Software für Rhizobox Wurzel Bilder basierend auf einer modifizierten Version des Root-System Analyzer37 , morphologische zu quantifizieren (Länge, Durchmesser, Fläche) sowie architektonische Merkmale (Verzweigung Frequenz, Verzweigung Winkel).

Die wichtigste Einschränkung des Protokolls im Vergleich zu 3D imaging Ansätzen ist die Beschränkung auf die Oberfläche sichtbare Wurzel und Rhizosphäre Eigenschaften. Jedoch wurde nachgewiesen, dass die sichtbare Wurzel Züge einen zuverlässigen Proxy für das gesamte Wurzelsystem21sind. Die Rhizobox Technik ist leicht mit traditionellen destruktive Probenahme (waschen) am Ende der Wachstumsdynamik imaging um das Verhältnis von sichtbaren vs. total Wurzelsystem Züge zu validieren kombiniert. Da diese Beziehung unter den Arten21variieren könnten, empfiehlt destruktive Probenahme zuverlässige Ableitung von sichtbaren Merkmale für jede neue Phänotypisierung Serie mit verschiedenen Kulturarten zu gewährleisten.

Der entscheidende Vorteil des hier vorgestellten Protokolls ist die Kombination von realistischen Wachstumsbedingungen (Boden), relativ hohen möglichen Durchsatz für die zeitlich aufgelöste RGB Bildgebung und Rückschlüsse auf die Wurzel Funktionalität (z.B. Wasseraufnahme) über die chemometrischen Wurzel und Rhizosphäre Daten aus hyperspektralen Bildgebung. Dabei überwindet die Methoden Inferenz Einschränkungen im Hochdurchsatz Sämling und nicht Boden Wurzel bildgebende Methoden14, während es teilweise tiefen Phänotypisierung Einblicke in funktionale Prozesse mit weniger experimentell Komplexität und höheren Durchsatz im Vergleich zu modernen 3D Methoden15ermöglicht.

In kommenden Experimenten das Protokoll wird verwendet, um die Wirkung der Mykorrhiza auf Root-Systementwicklung und Funktionalität von Leguminosen sowie für Phänotypisierung Wurzel Merkmale der Zwischenfrucht Arten in Bezug auf die Bodenstruktur, Stickstoff und Kohlenstoff zu studieren Radfahren.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen Mittel aus der Wissenschaftsfonds FWF über das Projekt Nummer P 25190-B16 (die Wurzeln der Dürreresistenz). Errichtung der hyperspektralen Bildgebung Infrastruktur wurde von der föderalen Regierung von Niederösterreich (Land Niederösterreich) über das Projekt K3-F-282/001-2012 finanziell unterstützt. Zusätzliche Mittel für die Zuckerrüben-Experiment von AGRANA Forschung empfangen wurde & Innovation Center GmbH (ARIC). Die Autoren danken Craig Jackson für den technischen Support während des Experiments und Englisch Korrektur des Manuskripts. Wir erkennen auch Markus Freudhofmaier, die zur Einrichtung der RGB Bildgebende Einrichtung beigetragen und Josef Schodl für den Bau der Rhizobox Montage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhizobox Technisches Büro für Bodenkultur Experimental builder
LED Lamps ATUM HORTI 600 Klutronic AHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 Day Juwel Aquarium 86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W Conrad 593384 - 62
Canon EOS 6D Canon Austria GmbH 8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32 Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013 Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR camera Xenics XEN-000105
Spectrograph Imspector N25E Specim
Hyperspectral imaging scanner Carinthian Tech Research AG Experimental builder Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software
Matlab R2106a Mathworks Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning
AP4 Poromoeter Delta-T-Devices
LI-3100C Area Meter LI-COR
BASF Styradur polystyrene sheets Obi Baumarkt 9706318 Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used

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References

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284 (2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9, (10), 105011 (2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442 (2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1 (2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1 (2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29 (2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679 (2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164, (1), 24-35 (2014).

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