Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

Chemistry

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Summary

Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

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Li, Y., Zhang, Y., Wei, Y., Tao, L. Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (127), e56253, doi:10.3791/56253 (2017).

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Abstract

Das Protokoll stellt eine einfache, effiziente und vielseitige Methode um Chitosan-basierte Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie vorzubereiten. Das Hydrogel wird durch das Mischen von Lösungen von Glykol Chitosan mit einem synthetisierten Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel vorbereitet und Hydrogele werden effizient in einigen Minuten bei Raumtemperatur erhalten. Durch unterschiedliche Verhältnisse zwischen Glykol Chitosan, Polymer Geliermittel und Wassergehalten ergeben sich vielseitige Hydrogele mit verschiedenen Gelierung Zeiten und Steifigkeit. Wenn beschädigt, kann das Hydrogel seine Auftritte und e-Modul durch die Reversibilität der dynamischen Imin Anleihen als Crosslinkages wiederherstellen. Diese selbst heilbar Eigenschaft ermöglicht das Hydrogel zu injizierbaren sein, da es nach dem Spritzvorgang selbst geheilt aus gepressten Stücke zu einer integralen Bulk-Hydrogel. Das Hydrogel ist auch Multi-reagiert auf viele bioaktive Reize durch unterschiedliche Gleichgewichtherstellung Status der dynamischen Imin Anleihen. Dieses Hydrogel wurde als biokompatibel, bestätigt und L929 Maus-Fibroblasten-Zellen waren eingebettete folgende standard-Verfahren und die Zellproliferation wurde leicht durch eine 3D Zellprozess Anbau beurteilt. Hydrogel bieten eine verstellbare Plattform für verschiedene Forschung, wo eine physiologische Imitation einer 3D-Umgebung für Zellen profitiert wird. Zusammen mit seiner Multi-reagieren, selbst heilbar und injizierbaren Eigenschaften kann die Hydrogele potenziell als mehrere Träger für Medikamente und Zellen in zukünftigen biomedizinischen Anwendungen angewendet werden.

Introduction

Hydrogele sind vernetzte Polymerwerkstoffe mit großen Mengen an Wasser und weichen mechanischen Eigenschaften, und sie haben in vielen Bio-medizinischen Anwendungen1,2benutzt worden. Hydrogele bieten eine weiche und feuchte Umgebung, die sehr zu den physiologischen Umgebung für Zellen in Vivo ähnlich. Hydrogele sind daher eines der beliebtesten Gerüste für 3D Zelle Kultur3,4geworden. Im Vergleich zu 2D Petrischale Zellkultur, hat 3D Zellkultur schnell avancierte um zu bieten, dass eine extrazelluläre Matrix (ECM) ahmte Mikroumgebung für Zellen zu kontaktieren und für Proliferation und Differenzierung Zwecke5montieren. Darüber hinaus könnte Hydrogele, enthält natürliche Polymere bieten ein Umfeld, biokompatibel und Förderung für Zellen zu vermehren und3unterscheiden. Hydrogele aus synthetischen Polymeren abgeleitet werden bevorzugt für ihre einfachen und klaren Komponenten, die komplexen Einflüsse wie Proteine tierischen Ursprungs oder Viren auszuschließen. Unter all den Hydrogel-Kandidaten für 3D Zellkultur werden Hydrogele, die sind einfach vorbereitet und verfügen über eine einheitliche Eigenschaft immer bevorzugt. Die Anlage der Hydrogel Eigenschaften verschiedenen Anforderungen anpassen anpassen ist wichtig wie gut6.

Hier stellen wir eine einfache Vorbereitung ein Glykol Chitosan basierenden Hydrogel mit dynamischen Imin-Chemie, die eine vielseitige Hydrogel-Plattform für 3D Zelle Kultur7wird. Bei dieser Methode bekannte biokompatible Glykol Chitosan werden verwendet, um Bilder der Hydrogel-Netzwerke zu etablieren. Die Aminogruppen werden als Polymer Geliermittel, dynamische Imin Anleihen als Crosslinkages Hydrogele8zu bilden mit einem Benzaldehyd beendet Polyethylenglykol reagiert. Dynamische Imin Anleihen können bilden und zersetzen reversibel und entgegenkommend, Umgebung, stiften die Hydrogele mit mechanisch verstellbaren querverbunden Netzwerke9,10,11. Aufgrund seiner hohen Wassergehalten, biokompatible Materialien und einstellbare mechanische Festigkeiten wird das Hydrogel als Gerüst für L929 Zellen in 3D Zelle Kultur12,13erfolgreich eingesetzt. Das Protokoll hier beschreibt die Verfahren, einschließlich der Polymersynthese Geliermittel, Hydrogel Vorbereitung Zelle einbetten und 3D Zelle zu züchten.

Das Hydrogel zeigt auch einige andere Funktionen aufgrund seiner dynamischen Imin-Crosslinkages, einschließlich seiner Multi-reagieren auf verschiedene Bio-Reize (Säure/pH, Derivative Vitamin B6 Pyridoxal, Protein Papain, etc.), darauf hinweist, dass das Hydrogel sein könnte unter physiologischen Bedingungen8zersetzen induziert. Das Hydrogel ist auch selbst heilbar und injizierbare, was bedeutet das Hydrogel könnte über eine minimal invasive Injektion Methode verwaltet werden und einen Vorteil in der Drogen- und Zelle Lieferungen14,15. Indem funktionelle Additive oder bestimmte vordefinierte Polymer Gelatoren Hydrogel ist kompatibel zur Gewinnung von spezifischen Eigenschaften wie magnetisch, Temperatur, pH-Wert reagieren, etc.16,17, die zu erfüllen, könnte ein breite Palette von Forschungsbedarf. Diese Eigenschaften zeigen das Hydrogel potentielle Fähigkeit, eine injizierbare werden mehrere Träger für Medikamente und Zellen in Vitro und in Vivo biomedizinische Forschung und Anwendungen.

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Protocol

Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen beim Chemie-Experimente, einschließlich der Verwendung einer Dampfhaube und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzhandschuhe, Laborkittel, etc.) durchführen. Das Protokoll erfordert Standardzelle Umgang mit Techniken (Sterilisation, Zelle Erholung, Zelle Passagierung, Zelle Einfrieren, Zelle Färbung, etc.).

1. Vorbereitung der Hydrogele

    1. vor Austrocknung der PEG Synthese von Benzaldehyd beendet di funktionalisiert Polyethylenglykol (PEG DF) Polymer
      1. wiegen 4,00 g PEG (4.000 MW, 1,00 Mmol), übertragen sie in ein Rundboden-Flasche (250 mL), und fügen Sie Toluol (100 mL).
        Hinweis: Andere Heringe mit Molekülmassen können für die Hydrogel-Bildung arbeiten aber führt zu unterschiedlicher Steifigkeit.
      2. Heizen die Lösung mit einer Heißluftpistole (oder einer heißen Platte ca. 40 ° C) mild, die Polymere lösen zu helfen. Nachdem alle Polymere zu lösen, verwenden Sie einen Verdampfer, um die Lösungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diese auflösen und Trockenverfahren zweimal um die getrockneten PEG Polymere,.
        Achtung: Dies sollte in einer Abzugshaube mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden. Toluol ist brennbar.
    2. Benzaldehyd Kündigung Reaktion von PEG
      1. fügen Sie ein Magnetrührer und Tetrahydrofuran (THF, 100 mL) in den Kolben und PEG mit einem Rührer zu lösen. 4-Carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 Mmol) und hinzufügen 4-Dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 Mmol) nacheinander die Lösungen für alle Körper vollständig aufzulösen.
      2. Add N, N '-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 Mmol) zur Lösung, und fügen Sie eine Trocknung Rohr, das wasserfreie CaCl 2 bis die Flasche voll ist. Halten Sie die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) für ca. 12 Std.
    3. Post-Reaktionsvorgangs
      1. herausfiltern der weißen Feststoff in die Lösung durch ein Vakuum erzeugt, nachdem die Reaktion beendet ist. Gießen Sie die Lösung in kalten Diethylether (500 mL) unter Rühren zu der weißen Feststoff ausgefällt. Die weißen Feststoffe durch Filter sammeln und Trocknen der Feststoffe in einer Dampfhaube.
      2. Der weißen Feststoff in THF wieder auflösen, unlöslichen weißen Feststoff herausfiltern, Gießen Sie die Lösung in frischem kalten Diethylether der weißen Feststoff ausgefällt und trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei-bis dreimal, und legen Sie dann den weißen Feststoff in eine Vakuumtrocknung Ofen (20 ° C, 0,1 Mbar), um sie vollständig zu trocknen. Das weiße Pulver wie das fertige Produkt zu sammeln: Benzaldehyd beendet DF PEG.
  1. Vorbereitung der Hydrogele
    1. wiegen unterschiedliche Mengen an DF PEG (0,11 g, 0,028 Mmol 0,22 g, 0,055 Mmol; 0,44 g, 0.110 Mmol) in einem Rohr (10 mL), deionisiertes Wasser (5,0 mL) hinzufügen und verwenden ein Wirbel oder Magnetrührer Das Polymer auflösen.
    2. Glykol Chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 -3 Mmol) in entionisiertem Wasser (15,0 mL) in einem Rohr (50 mL) auflösen und einen Strudel für ein paar Minuten zu verwenden, um die Chitosan-Lösung (3 Gew.-%) homogenisieren.
    3. Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) und DF PEG Lösungen (0,2 mL) nacheinander in einer Röhre (2,0 mL) dazugeben. Verwenden Sie einen Wirbel um die Lösungen homogen zu Form Hydrogele in einigen Minuten mischen. Befolgen Sie die Verhältnisse in Tabelle 1 Hydrogele der unterschiedlichen Festigkeiten machen.
      Hinweis: Verwenden Sie die Röhre invertierenden Methode um festzustellen, ob das Hydrogel schon gebildet hat.
  2. Rheologie Analysen
    1. Rheologie Analysen auf eine rotierende Rheometer mit einer parallelen Stahlplatte durchführen (Durchmesser: 20 mm). Verteilen Sie für die Gelierung Test Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) auf eine untere Platte. Dann fügen Sie DF PEG wässrige Lösungen (0,2 mL, 2 Gew.-%) gleichmäßig tropfenweise auf die Chitosan-Lösung-Oberfläche und mischen mit einer Pipette schnell. Tiefer unten die obere Platte und beginnen zu Test
    2. Für Hydrogel ' s Steifigkeit Test, schneiden ein Hydrogel in einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und Messen Sie die Speicher-Modul (G ') Werte im Vergleich zu Frequenzanalysen bei 1 % Dehnung. Typische G ' Werte bei 6,3 rad s − 1 in Tabelle 1 aufgeführt sind.
      Hinweis: Analysen durchführen, die Rheologie Hydrogel 0,5 h nach der Hydrogel-Bildung um dynamische Bindung Stabilisierung der Hydrogel sicherzustellen.
    3. Für das Hydrogel ' s selbst heilbar-Eigenschaft zu testen, ein Hydrogel in Stücke schneiden und die Stücke zu heilen, ein integraler Teil versammeln. Dann schneiden Sie das Hydrogel Stück zu einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und legen Sie es auf dem Rheometer, die Rheologie-Analyse durchführen.

2. 3D Zellkultivierung in Hydrogele

  1. Herstellung von Hydrogel Gelierung Lösungen
    1. wiegen DF PEG (0,44 g, 0,11 Mmol) in ein steriles Röhrchen (4,0 mL), in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 2.0 hinzufügen (mL), und verwenden ein Wirbel oder Rührer Auflösen des Polymers um die Polymerlösung (20 Gew.-%) zu erhalten. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und dann indem man es durch einen Bakterien-remanent Mikron-Filter (0,22 µm) zu sterilisieren.
    2. Wiegen der Glykol-Chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 -3 Mmol) in ein steriles Röhrchen (15,0 mL), fügen Sie in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 4,0 mL) und Wirbel zu helfen, das Polymer zu Glykol-Chitosan-Lösung (4,0 Gew.-%) auflösen. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und mit einem Bakterien remanent 0,22 µm-Filter filtern.
  2. Zellkultivierung in Hydrogele
    Vorsicht: führen Sie alle entsprechenden Verfahren in einer Gewebekultur Kapuze Zelle. Grundkenntnisse in steriler Technik wird erwartet.
    1. Vorbereitung der Zellsuspension
      1. Kultur L929 Zellen RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 5 % Penicillin (10 mL) in ein Petri-Schale (Durchmesser 10 cm), und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO 2. Jeden Tag vor Gebrauch das Medium wechseln.
      2. Ernten die L929 Zellen mit PBS mit Trypsin (0,025 w/V %) und EDTA (0,01 % w/V), anschließend Zentrifugieren (70 X g, 5 min) und wieder auszusetzen, die Zellen im RPMI-1640 Medium (1,0 mL). Führen Sie die Zellzählung mit standard Operation Blut zählen Board. Wieder aussetzen die Zellen, um die Zellkonzentration zu justieren ~ 3,75 × 10 6 Zellen/mL.
    2. Zelle Kapselung in Hydrogele
      1. L929 Zellsuspensionen (0,4 mL, 3,75 x 10 6 Zellen mL -1) mit Glykol-Chitosan-Lösung (0,4 mL) in einem Rohr (4,0 mL) von Vortex mischen. Pipette L929/Glykol-Chitosan-Lösung (0,8 mL) in die Mitte einer konfokalen Petrischale (Durchmesser 2,0 cm). Pipette die DF PEG-Lösung (0,2 mL) in das gleiche Gericht und pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung zu induzieren Hydrogel Bildung.
        Hinweis: Bewerten die Hydrogel-Bildung durch Kippen der Petrischale.
      2. Für direkte Zellkultur hinzufügen zusätzliche Mengen von RPMI-1640 Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel. Legen Sie die Zelle eingebettet Hydrogele (1,0 mL, 4,0 Gew.-% DF PEG, 1,5 Gew.-% % Glykol Chitosan 1,5 × 10 6 Zellen mL -1) in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) und verändern Sie das Medium jeden Tag. Bereiten Sie für die Zelle Bildgebung am Tag 1, 3, 5 und 7 nach Zelle Kapselung.
    3. Vorbereitung der 3D Post-Zellkultur in Hydrogele nach Injektion, Zelle geladen Hydrogel (1,0 mL, siehe Punkt 2.2.2) in einer Spritze (10,0 mL, 48 G-Nadel). Nach der Hydrogel-Formen Hydrogel langsam in eine Petrischale für die konfokale Bildgebung zu injizieren. Fügen Sie einen zusätzlichen Betrag von Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel und ändern Sie es jeden Tag. Setzen der Petrischale in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2) und bereiten sich für danach imaging.
      Achtung: Bitte überprüfen Sie und das Sicherheitsprotokoll Betrieb einer Spritze zu folgen.
  3. Lebensfähigkeit Zellanalyse
    1. konfokale Beobachtung
      1. Spülen die Hydrogele mit PBS (1,0 mL) zwei Mal. Färben Sie die Hydrogele mit Fluorescein-Diacetat (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) und Propidium Jodid (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) Lösungen für 15 Minuten. Nach dem Färben, entfernen Sie alle Lösungsmittel.
      2. Beobachten die Hydrogele mit einem konfokalen Mikroskop unter Erregung Wellenlängen von 488 nm und 543 nm live zu visualisieren und toten Zellen, beziehungsweise. Z-Stapel durch jeden 2 µm Tiefe der Hydrogele, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen zu validieren zu nehmen.
        Hinweis: FDA Flecken lebenden Zellen während PI abgestorbene Zellen Flecken.
    2. Degradieren Hydrogel (1,0 mL) mit Essigsäure (HAc, 3 V %, 1,0 mL) für 5 min und Pipette in ein Rohr (4,0 mL). Sammeln Sie Zellen durch Zentrifuge (70 X g, 5 min) zu und wieder auszusetzen Sie, die Zellen im Zellkulturmedium RPMI-1640 (1,0 mL). Zellzählung mit einem Blut zählen Board durchführen.

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Representative Results

Eine schematische Darstellung dieses Protokolls auf Hydrogel Vorbereitung und seine Verwendung als 3D Zellkultur wird in Abbildung 1angeboten. Informationen der Hydrogel Inhalte und Kennzahlen mit unterschiedlichen Festigkeiten vorbereitet werden in Tabelle 1zusammengefasst. Das Hydrogel ist selbst heilbar und Rheologie-Eigenschaft stellt die Hydrogel Steifigkeit durch Speicher-Modul gegen frequenztest in Abbildung 2. Die Zelle konfokale Bilder und Zellzahlen mit Tagen der Kultur in Hydrogele sind in Abbildung 3, Bestätigung der Zellviabilität und Zellproliferation über 3D Zellkultur vorgestellt. Abbildung 4 stellt Mikroskopie, konfokale Bilder und Analyse der Zelle Verbreitung Tarife für Zellen eingebettet in Hydrogele, die Injektion und Post-Kultur gelitten. Hohen Zellviabilität und Zellproliferation zeigen, dass die Zellen eingebettet in das Hydrogel keine zerstörerischen Schaden erlitten und konnte von der Post-Kultur zeigt das Hydrogel Injectability erholen.

Figure 1
Abbildung 1 : Erstellung von Hydrogel und seine Verwendung als 3D Zellkultur. (A) Hydrogel Vorbereitung; (B) Handy-Aufhängung Vorbereitung; (C) 3D Zellkultur in Hydrogele mit oder ohne Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Hydrogel Steifigkeit. Speicher Modul G' versus Frequenz von (A) original und (B) selbst geheilt Hydrogele. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : 3D Zellkultur in das Hydrogel. (A) konfokale 3D-Bilder von L929 Zellen eingebettet in steifen Stärke Hydrogel (grün: Leben Zellen; Rot: Tote Zellen); (B) Zelle Zählergebnisse L929 Zellen eingebettet in das Hydrogel nach Zelle Kapselung zur angegebenen Zeit. Maßstabsleiste = 300 µm. Angaben als Mittelwert ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : 3D Zellkultur in Hydrogel nach Injektion nach. (A) A schematische Bild von Einspritzung und Post-Kultur eine Zelle geladen Hydrogel. Einfügen: Mikroskopie Aufnahmen von Zellen eingebettet in Hydrogele vor Injektion (links) und nach Post-Zellkultur für 7 Tage (Mitte und rechts). Maßstabsleiste = 100 µm; (B) konfokale Bilder von L929 Zellen eingebettet in eine steife Stärke Hydrogel und Post-kultiviert nach Injektion (grün: Leben Zellen; Rot: Tote Zellen), Maßstabsleiste = 300 µm; (C) A Vergleich der die Proliferationsrate der Zellen in Hydrogele mit oder ohne Injektion nach Kapselung kultiviert. Angaben als Mittelwert ± SD (Adapted von Referenz-12; Copyright © 2017 Elsevier). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hydrogel Steifigkeit Weiche Medium Steif
Glykol-Chitosan (mg) 6.6 6.6 6.6
DF-PEG (mg) 4.4 8.8 17.6
Polymer Geliermittel Inhalt (Gew.-%) 1 2 4
Entionisiertem Wasser (mL) 0,4 0,4 0,4
Gelaion Zeit (min) 7.5 5 3.5
G' (Pa)* 900 2100 4700
* unter Frequenz 6,3 rad s-1getestet, Stamm 1 % mit einem parallelen Teller (Durchmesser 20 mm) auf eine rotierende Rheometer.

Tabelle 1: Informationen der Hydrogele mit unterschiedlichen Festigkeiten vorbereitet.

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Discussion

Das Hydrogel präsentiert in diesem Protokoll (Abbildung 1) besteht aus zwei Hauptkomponenten: natürliches Polymer Glykol Chitosan und synthetischen Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel DF PEG, die beide biokompatible Werkstoffe sind. Synthese von DF PEG wird vorgestellt mit einer einstufigen Modifikation Reaktion. PEG Molekulargewicht 4.000 wurde dieses Protokoll in Belange der Löslichkeit, Änderung Effizienz sowie Hydrogel Steifigkeit gewählt. Eine Reihe von Hydrogele mit unterschiedlichen Festigkeiten wurden mit verschiedenen feste Inhalte und Kennzahlen von Glykol Chitosan und DF PEG zubereitet. Homogene Hydrogele schnell in Minuten bildeten sich durch das Mischen von Gelierung Lösungen unter Raumtemperatur, obwohl die Geschwindigkeit der Gelbildung von verdünnten Lösungen auch verlangsamen könnte. Rheologie-Test wurde eingesetzt, um die Festigkeiten der verschiedenen Hydrogele zu bewerten. Die Lagerung Moduli (G') der diese Hydrogele wurden gefunden, um ungefähr 900 abweichen Pa (weich), 2.100 Pa (Mittel) bis 4.700 Pa (steif) (Tabelle 1 und Abb. 2A). Dies ist auf die höheren Vernetzungsgrad Dichte trug, durch Zugabe von mehr Polymer Gelatoren in das Hydrogel-Netzwerk, was zu höheren Speicher Modul (höhere Steifigkeit). Die selbst heilbar Eigenschaft bestätigt auch Erholung von der Hydrogel Elastizitätsmodul (Abb. 2 b). Es ist bekannt, dass ECM Steifigkeit unterscheidet sich für verschiedene Gewebe, so Hydrogel bieten verstellbare mechanische Signale und verschiedenen Anforderungen konnte durch abwechslungsreiche Verhältnisse zwischen Glykol Chitosan und DF PEG Polymer Gelatoren18.

L929 Zellen, eine typische Maus Fibroblasten-Zell-Linie mit in Vivo Umwelt Gewebe Steifigkeit von ~ 5.600 Pa19, diente als ein Handy-Modell in der Hydrogel eingebettet werden. Nach der Zelle Kapselung in Hydrogele, kann leicht festgestellt werden, dass die Zellen in die Hydrogele extrem hohe Rentabilität zeigte (> 99 %) während der gesamten Kultur bestätigt die ausgezeichnete Biokompatibilität von Chitosan basierenden Hydrogel. Eine beträchtliche Zunahme der Zelldichte in das Hydrogel angedeutet, dass dieses Hydrogel Proliferation der L929 Zellen auch ohne Extra hinzugefügt Wachstumsfaktoren (Abbildung 3A) unterstützen könnte. Nach 7 Tagen in der Kultur in der Hydrogel erhöht die Anzahl von Zellen 300 % (Abb. 3 b). Es wird berichtet, dass Zellen kultiviert in Gerüste unterscheiden könnte folgende mechanische Signale20,21, die weitere Forschung mit dieser 3D Hydrogel-Kultur-Methode mit sich bringen könnte.

Implantation von Zellen mit injizierbaren Hydrogele sammelte unvergleichliche Vorteile um die Transporteffizienz und Lebensfähigkeit der implantierten Zellen14erheblich verbessern. Innerhalb eines dynamischen Imin-vernetzt-Netzwerks konnte das Hydrogel heilen nach der Injektion. Die selbst heilbar-Eigenschaft können das Hydrogel zu injizierbaren, woraus Anwendungsmöglichkeiten für die Hydrogele als injizierbare mehrere Träger. Um dieses Hydrogel als eine injizierbare Zellträger weiter zu bewerten, wurde eine Injektion imitiert und Post-Kultivierung Experiment durchgeführt. Die Zelle eingebettet Hydrogel wurde geladen in einer Spritze und durch eine 48 G-Nadel in eine Petrischale, gefolgt von einer 7-tägigen Post-Kultivierung Prozess mit Zelle überleben und Verbreitung Rate studierte ausgepresst.

Wie Abbildung 4Azeigt, könnte die gequetscht Hydrogel Stücke Self-heal um eine integrierte Hydrogel ca. 1 h nach der Injektion zu reformieren, die hilfreich bei der Zelle Lieferung. Für Zellen in das Hydrogel nahm im Vergleich zu das Bild kurz nach Kapselung (Abbildung 4A, links einfügen), die Zelldichte erhöht drastisch nach 7 Tagen (Abbildung 4A, mittlere einfügen). In der erweiterten Vision, eine detailliertere Zelle-fissional Prozess, in dem einige Zellen befinden sich in zwei aufgeteilt werden (Abbildung 4A, rechts einfügen), direkt durch 3D Zellproliferation in der Hydrogel bestätigt. Abbildung 4 b zeigt die konfokale Bilder von lebenden Toten Zelle Assays nach Injektion und Post-Kultur-Experiment. Die Dichte der injizierten Zellen erhöht natürlich mit einem hohen Zellviabilität (> 99 %), zeigt die erfolgreiche Zellproliferation in der 3D Hydrogel nach der Injektion. Zu erfahren, ob die Injektion die Proliferationsrate der Zelle betroffen, war ein Vergleich der quantitative statistische Analyse für die Zelle Verbreitung Preise in Hydrogele mit oder ohne Injektion durchgeführt (Abbildung 4). Die Proliferationsrate der Zelle nach der Injektion, blieb zwar leicht zurückgegangen, in ein hohes Maß (~ 75 %) und der Zellzahl um 145 % relativ nach 7 Tagen in der Kultur in der Hydrogel, darauf hinweist, dass die Scherkräfte beim Einspritzen ein wahrnehmbares Element kaum negativen Einfluss auf die Zellproliferation.

Wir beschrieben eine typische Vorgehensweise dieser Hydrogel-Anwendung aber Forscher können das Protokoll spezifischen Anforderungen anpassen. Polymer Gelatoren haben beträchtlichen Einfluss auf das Hydrogel und können leicht geändert werden. Beispielsweise könnte die Steifigkeit dieses Hydrogel durch unterschiedliche Verhältnisse von Glykol Chitosan und DF PEG Geliermittel leicht manipuliert werden. Unterdessen konnte die Verwendung DF PEG von anderen Molekulargewichten auch dieses Ziel erfüllen. Wir PEG 4K in diesem Protokoll verwendeten, aber PEG 2K bis 10K kann auch funktionieren. Wenn Sie andere Stifte verwenden, ist es wichtig, speziell die Gelierung Zeit und Steifigkeit zu überwachen. Andere funktionale Polymer Gelatoren können auch funktionieren, wenn die Forscher Synthese Fähigkeiten, bestimmte Benzaldehyd beendet Funktionspolymere17vorzubereiten haben.

Dieses Protokoll hat einige Einschränkungen. Erstens ist aufgrund der dynamischen Struktur, die Steifigkeit dieses Hydrogel begrenzt im Vergleich zu einer kovalenten Bindung querverbunden Hydrogel. Auftreten einer Ausfälle Hydrogele mit Vorbereitung eines Modul-Designs zu hoch. Zweitens ist dieses Hydrogel biologisch abbaubar, wodurch die langfristige Zellkultur innerhalb der Hydrogel. Drittens bietet das Hydrogel eine 3D vernetzt-Anbau-Umgebung, die Diffusion Bedenken hat. Heute basieren die meisten der Bio-Analysen auf 2D Kultur. Die 3D-Struktur könnte weitere Zellen in Vivo Studien im Zusammenhang mit behindern.

Wenn Sie dieses Protokoll verwenden, gibt es einige wichtige Schritte zu folgen. Erstens ist bei der Synthese von Polymeren Geliermittel DF PEG Dehydrierung sehr wichtig. Zweitens, wenn Sie Zelle-Verfahren durchführen, sterile Betrieb ist entscheidend. Drittens sollte die Färbung Zeit gut in die Hydrogele, schöne konfokale Bilder bekommen gesteuert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen stellte das Protokoll eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele, die gelten als Plattform für 3D Zellkultur und einstellbare mechanische Hinweise für verschiedene Forschungen bieten könnte. Es wurde bereits angewendet in den Bereichen bezüglich der Drug-Delivery, Zelltherapie und Tumor-Chemotherapie, die nicht nur ein Beweis für seine Leistung, sondern auch das Potenzial für biomedizinische ap erhöhtZweirad.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der National Science Foundation of China (21474057 und 21604076) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycol chitosan Wako Pure Chemical Industries 39280-86-9 90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 619-66-9 99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 538-75-0 99%
Calcium chloride anhydrous Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 10043-52-4 96%
4-dimethylamiopryidine Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD 1122-58 99%
Polyethyleneglycol Sino-pharm Chemical Reagent 5254-43-7 99%
Tetrahydrofuran Sino-pharm Chemical Reagent 109-99-9 99%
Toluene Sino-pharm Chemical Reagent 108-88-3 99%
Ethyl ether Sino-pharm Chemical Reagent 60-29-7 99%
Acetic acid Sino-pharm Chemical Reagent 64-19-7 99%
Anhydrous CaCl2 Sino-pharm Chemical Reagent 10043-52-4 99%
Fluorescein diacetate Sigma 596-09-8 99%
Propidium iodide  Sigma 25535-16-4 94%
RPMI-1640 culture media Gibco
Fetal bovine serum Gibco
Trypsin-EDTA Gibco 0.25%
PBS Solarbio 0.01 M
Penicillin streptomycin solution Hyclone 10,000 U/mL
Rheometer TA Instrument AR-G2
Confocal microscope Zeiss 710-3channel
L929 Cells ATCC NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator EYELA N-1100
48 guage needle ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD 48-guage
Microscope Leica DM3000 B
Microscope software Imaris
Heat gun Confu KF-5843 
Petri dish NEST

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References

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