Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokollet beskriver i detalj generationen av fotavtryck-fri inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från mänskliga bukspottkörtelns celler i feeder-fria förhållanden, följt av redigering med CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins och karakterisering av de modifierade encelliga kloner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Embryonala och inducerade pluripotenta stamceller kan själv förnya och differentieras till flera celltyper i kroppen. De pluripotenta cellerna är således eftertraktade för forskning inom regenerativ medicin och är för närvarande i kliniska prövningar för ögonsjukdomar, diabetes, hjärtsjukdomar och andra sjukdomar. Potential att differentieras till specialiserade celltyper som tillsammans med de senaste framstegen i genomet redigering teknik inklusive CRISPR Cas systemet har gett ytterligare möjligheter för att skräddarsy genomet av iPSC för varierande applikationer däribland sjukdom modellering, genterapi, och polarisering vägar av differentiering, för att nämna några. Bland de tillgängliga redigering teknikerna, har den CRISPR/Cas9 från Streptococcus pyogenes uppstått som ett verktyg för val för platsspecifika redigering av eukaryota genomet. CRISPRs är lättillgängligt, billig och mycket effektiv i engineering riktade redigeringar. Systemet kräver en Cas9 nuclease och en guide sekvens (20-mer) specifika för genomisk målet abutting 3-nukleotid ”NGG” protospacer-intilliggande-motiv (PAM) för inriktning Cas9 till det önska genomisk locus, tillsammans med universal Cas9 bindande spårämne () RNA tillsammans kallas enda guide RNA eller sgRNA). Här presenterar vi en stegvisa protokoll för effektiv generering av feeder-oberoende och fotavtryck-gratis iPSC och beskriva metoder för editering av iPSC använder de Cas9 ribonukleoprotein (RNP) komplex. Genomet redigering protokoll är effektiv och kan vara enkelt multiplexed av pre-komplexbildande sgRNAs för mer än ett mål med proteinet Cas9 och samtidigt leverera in i cellerna. Slutligen beskriver vi en förenklad strategi för identifiering och karakterisering av iPSCs med önskade redigeringar. Sammantaget förväntas beskrivs strategierna effektivisera produktion och redigering av iPSC för många applikationer.

Introduction

Omprogrammering av mänskliga kroppsceller till pluripotenta staten av överuttryck av omprogrammering faktorer har revolutionerat stamcellsforskning med tillämpningar i sjukdom modellering, regenerativ medicin och läkemedelsutveckling. Flera icke-virala omplanering metoder finns tillgängliga för leverans av omprogrammering faktorer och generera iPSCs, men processen är labor intensiv och inte mycket effektiv1. De virala metoderna, är men effektiva, associerade med problem med virus integrationen och tumorigenicitetsprov2,3,4. I detta manuskript rapportera vi användning av cytoplasmisk Sendai virus för att leverera omprogrammering faktorer och upprätta fotavtryck-fri iPSC rader som saknar integrering av alla virala vektorn sekvenser i deras genomen5. Sendai virus är ett RNA-virus som späds ut ur cellen cytoplasman ~ 10 passager efter infektion och producerar omplanering faktorer i överflöd, vilket leder till snabb och effektiv omprogrammering6,7. Den etablerade iPSCs kan sedan flyttas lätt över till feeder-fri medium att undvika användning av mus embryonala fibroblaster (MEFs) som mataren celler8.

I denna publikation, förutom beskriver Sendai viruset medierad omprogrammering, beskriver vi också ett förbättrat protokoll för redigering iPSCs, som har potential att leverera obegränsad mänskliga celler med önskad genetiska modifieringar för forskning. Vi har använt CRISPR/Cas9-teknik för modifiering av iPSCs, som nu används för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive knock-ins och knockouts, storskalig genomisk borttagningar, poolade bibliotek screening för gen upptäckt, genteknik av talrika modellorganismer och gene therapy9,10,11. Denna teknik innebär bildandet av komplex av Streptococcus pyogenes-härledda Cas9 nuclease och 20-mer guide RNAs som uppnå målet erkännande via base-ihopkoppling med genomiska mål sekvens intill 3' nukleotid protospacer intill motiv (PAM) sekvens. Den Cas9 nuclease inducerar en dubbel icke-återvinningsbara break ~ 3 nukleotider från PAM platsen, som är därefter reparerats huvudsakligen av icke-homolog slutet att gå (NHEJ) väg leder till infogningar och borttagningar i ramen öppen läsning, och därmed funktionell knockout gener12.

Våra förbättrat protokoll innehåller Detaljer för kultur av mänskliga bukspottskörteln celler, deras omprogrammering på mitotiskt inaktiverat mus embryonala fibroblaster (MEFs) för att uppnå högre effektivitet av omprogrammering, efterföljande anpassning till feeder-fri kultur på Matrigel, karakterisering av etablerade iPSCs, guidade CRISPR RNA design och förberedelse, leverans till iPSCs som RNP komplex, enda cell sortering för att generera klonal rader av redigerade iPSCs, enkel screening och identifiering av redigeringar och karakterisering av enstaka cell kloner. Genomisk borttagningar genererades effektivt i denna studie av införandet av Cas9 protein och två CRISPR sgRNA RNP komplex att inducera dubbel strandsatta raster (DSBs) och borttagning av den ingriper segment. Denna metod kapitaliserar på användningen av två guider för att generera borttagningar i ramen öppen läsning, hög effektivitet av NHEJ leder till lågt antal kloner att behovet att präglas och lätt preliminära screening av kloner av automatiserade kapillären elektrofores enhet, fragment analyzer. Dessa effektiva genomet redigering metoder för att generera mänskliga stamceller-baserade sjukdomsmodeller kommer snart att bli en standard och rutinmässiga strategi i ett laboratorium som stamceller. Slutligen, exakt gen editering gör det möjligt att gå bortom stamceller sjukdom modellering och potentiellt kan bidra till att katalysera cellbaserade terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. omprogrammering protokoll

  1. Generation av mänskliga iPSC från primära mänskliga bukspottkörtelns celler
    1. Coat en 6-väl platta med 1,5 mg/mL kall kollagen och låt det gel vid 37 ° C under 1 h.
    2. Tallrik tidig passage människans primära bukspottkörtelns celler i Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 celler) på en kollagen belagd 6-väl plattan på dag -2 att uppnå cirka 2,5 × 10 5 celler eller minst 60% confluency per brunn på dagen för transduktion (dag 0). För den första studien tallrik minst 2-3 brunnar för att få en väl med önskad konfluens dag 0. Använda minst en brunn som en kontroll för att räkna cellerna.
    3. På dagen för transduction (dag 0), värma 1 mL Prigrow III medium i ett vattenbad för varje brunn för att vara sensorik. Skörda cellerna från en kontroll i 1 mL 10% FBS medium med 1 mL av trypsin/EDTA för 5 min eller tills cellerna lossa för att utföra en celltal. För att göra 10% FBS medium, tillsätt DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat och 1% icke-essentiella aminosyror.
    4. Greve och kontrollera livskraft hos de celler som använder räknaren cell och beräkna volymen av varje virus som behövs för att nå målet baserat på cell nummer och virus titern. Använda multiplicity av infektion (MOI) Kos = 5, hc-Myc = 5 och hKlf4 = 3 för bukspottkörtelns celler.
    5. Tina en uppsättning Sendai vektor rör i-80 ° C lagring på isen och tillsätt försiktigt beräknade volymer av varje av de tre Sendai vektor rör 1 ml Prigrow III medium, pre värmas till 37 ° C. pipetten försiktigt för att blanda lösningen. En brunn i en 6-well platta är nog för transducing med Sendai virala vektorer att generera Omstyrda celler.
    6. Aspirera Prigrow III mediet från cellerna och tillsätt långsamt omplanering virus blandningen till brunnarna som innehåller celler. Inkubera cellerna över natten i en 37 ° C inkubator med en fuktad atmosfär av 5% CO 2.
    7. Noggrant kasta virus blandningen på cellerna och ersätta med färsk Prigrow III medium nästa dag, 24 h efter transduktion. Odla cellerna för 5 d och ändra mediet varje varannan dag.
    8. På dag 5, förbereda MEFs på 0,1% gelatin pre belagda 10 cm kultur rätter (1,3 x 10 6 celler/maträtt). Växa MEFs i T175 kolvar till dag 4 och sedan på dag 5, utsätta celler till 6.000 rads från en γ-strålning källa innan sådd den celler 13 eller använda kommersiella MEF källan.
    9. På dag 6, använda 1 mL cell avlossning lösning för 10 min för att lossa transduced cellerna, platta alla av dem på MEF rätter i Prigrow III medium med rock-hämmare (5 mM lager, 10 µM slutlig) och inkubera över natten i en 37 ° C inkubator med en fuktad atmo Re av 5% CO 2.
    10. Ändra Prigrow III mediet till hESC medium nästa dag. För att göra 500 mL hESC medium, lägga till DMEM/F-12, 20% (v/v) knockout serum ersättning (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamin; 100 µM onödiga aminosyror och 100 µM 2-merkaptoetanol. Ändra på medellång försiktigt varje dag nu.
    11. Observera plattorna regelbundet för uppkomsten av cell klumpar eller kolonier vägledande Omstyrda celler. Transformerade cellerna bildar klonal aggregat med kullersten morfologi och stora nucleus och nucleoli. Markera sannoliken ' iPSC ' kolonier och kontrollera dem regelbundet för tillväxt.
    12. Nästan fyra veckor efter transduktion som kolonier är redo för plockning eller överföring, förbereda 24 MEF brunnar av plätering 1,3 x 10 6 celler/gelatin pre belagda platta som tidigare för överföring av enstaka kolonier.
      1. Förbereda matrix membran (t.ex., Matrigel) av alikvotering det baserat på utspädningsfaktorn på analyscertifikatet. Tillsätt en alikvot till 25 mL DMEM/F-12 till pälsen fyra 6-väl plattor (1 mL per brunn) och inkubera vid rumstemperatur (RT) i minst 1 tim före användning. Manuellt välja 12-24 kolonier med hjälp av en steril pipett-spets att aspirera dem och överföra på MEF plattor i 500 µL av hESC medium.
      2. Aspirera media i brunnen för att försiktigt störa eller bryta isär kolonierna. Också plocka 24-48 kolonier på matris 24 brunnar membran belagda. För membran belagda plattorna, Använd mTeSR1 (kompletteras med 10 µM rock-hämmare) för 24 h och ändra varje dag. Inom 6-10 d plocka kolonier, de är redo att överföras till nya 24-väl eller 12-väl membran plattor för klonal expansion.
    13. Om det behövs, ta loss kolonierna på MEFs med 1 mg/mL kollagenas för 20 min, tvätta två gånger med hESC/mTeSR1 och överföring till membran belagda 12 - eller 24 brunnar. Om det finns tillräckligt robust kolonier som växer på matrix membranet från steg 1.1.12, frysa kolonierna på MEFs använda iPSC frysning media enligt tillverkaren ' s riktlinjer.
    14. Lossa robust kolonierna pläterade på membranet i steg 1.1.12 använder 500 µL av dispase i 20 min och plattan igen på matrix membran belagd 12 brunnar. Manuellt skrapa bort eventuella differentierade celler eller kontaminerande MEF feeder celler att berika för pluripotenta kloner på membranet.
    15. Expandera klonerna efter 6-8 d av växer på membran belagda plåtar genom att separera med dispase lösning som innan och plätering småcellig aggregat på färska membran belagda 6 - eller 12-bra platta. Ändra mTeSR1 medium dagligen. Karakterisera de omprogrammerade klonerna av alkaliskt fosfatas färgning, immunfärgning för pluripotens markörer (OCT3/4 och NANOG), FACS analys av pluripotenta yta markörer och differentiering analyser. Växa och kultur klonerna på membran-belagda plattor för alla de analyser som inklusive CRISPR redigering som förklarats ovan andra beläggning lösning specifikt anges.
  2. Karakterisering av mänskliga iPSCs
    1. alkalinfosfatas färgning
      Obs: ett kommersiella kit används här. Se tabellen material.
      1. Platta förmodade mänskliga iPSCs på 24-väl plattan och kulturen för 4-5 d med dagligen media förändring.
      2. Att starta protokollet färgning, aspirera odlingsmediet och tvätta cellerna med 1 mL 1 x PBS med 0,05% Tween 20 (PBST).
      3. Lägg till 0,5 mL lösning i kit på cellerna och inkubera vid RT för 2-5 min. Aspirera fix lösningen och tvätta sedan fast cellerna med PBST. Låt inte brunnarna torka.
      4. Lägg till 0,5 mL nyberedd AP substratlösning per brunn genom att blanda lösningen A, B och C. Inkubera cellerna i mörker (lindade med folie eller i en mörk behållare) vid rumstemperatur för 5 till 15 min.
        Obs: Noga övervaka färgen förändras och stoppa reaktionen när färgen blir ljusa att undvika icke-specifik färgning.
      5. Stoppa reaktionen genom att aspirera AP substratlösningen och Tvätta brunnarna två gånger med 2 mL 1 x PBS.
      6. Observera kolonierna under mikroskopet och fånga bilderna på 4 X eller 10 X förstoring med några ljusa fält Mikroskop med en kamera.
    2. Immunfärgning
      1. platta mänskliga iPSCs i plattan 24 brunnar och kultur för 4-5 d med dagligen media förändring.
      2. Tvätta cellerna en gång kort med PBS och fixa för 20 min med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
      3. Tvätta tre gånger i 10 min (3 x, 10 min) med PBS på RT.
      4. Mätta icke-specifika platser med 10% normalt Get eller åsna serum (NS, beroende på djur sekundära antikroppen höjdes i) i PBS för 40 min på RT. För endast intracellulära epitoper, innehålla 0,3% TX-100 i PBS (TX/PBS) till permeabilize.
      5. Tvätta 3 x 5 min med PBS på RT.
      6. Späda OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 och SOX17 antikroppar i en färsk lösning av 5% NS i PBS och inkubera i 2 h vid RT eller över natten vid 4 ° C.
      7. Tvätta 3 x 5 min med PBS på RT.
      8. Späda lämpliga sekundära Alexa Fluor 488 eller 568 antikroppar i 5% NS/PBS och inkubera cellerna för 1 h på RT.
      9. Tvätta 3 x 5 min på RT.
      10. Inkubera med DAPI i PBS för 10 min och tvätta 2 x 5 min på RT. använda fluorescerande Mikroskop att ta bilder.
    3. Fluorescens-aktiverad Cell sortering (FACS)
      1. plattan mänskliga iPSCs i en 6-väl tallrik och kultur till kolonierna blir 80% konfluenta (minst 10 5 celler /sample) med daglig mTeSR1 medium förändring.
      2. På dagen för experimentet, isolera cellerna och separera till en enda cellsuspension som förklaras ovan i protokollet. Tvätta med 10% FBS medium.
      3. För yta markörer, Återsuspendera i 0,5-1 mL 10% FBS medium och hålla på ice.
      4. För intracellulära markörer kan blandas i 1 mL 4% PFA/PBS och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta med 10% FBS medium. Återsuspendera i 0,1% TX/PBS och inkubera i 15 min på is. Tvätta igen med 10% FBS medium. Återsuspendera i 0,5-1 mL 10% FBS medium och hålla på ice.
      5. Tillsätt 50 µL av cellsuspensionen till 50 µL 10% FBS medium som innehåller rekommenderade mängden TRA-1-60, TRA-1-81 eller SSEA-4 antikroppar och inkubera i 30 min till 1 h.
      6. Tvätta två gånger med 10% FBS.
      7. Återsuspendera i 100 µL 10% FBS medium innehållande fluorescerande sekundära antikroppar och inkubera i 30 min. Tvätta två gånger med 10% FBS och återsuspendera i lämplig volym av 10% FBS. Levande celler kan differentieras från döda celler av propidium jodid dye lade till vid < 1 µg/mL att uppskatta cell apoptos under processen.
    4. Trilinjär differentiering
      1. frö två 6-väl plattor med 1,5-2 x 10 6 iPSCs per brunn i mTeSR1 medium med 10 µM rock hämmare.
      2. Låta cellerna att växa för 2-3 d med dagligen mTeSR1 medium förändring tills brunnarna är 80-90% konfluenta.
      3. För ektoderm induktion, lägga till neurala induktion medium (NIM) enligt tillverkaren ' anvisningar i 2-3 brunnar av 6-väl pläterar.
      4. Ändra mediet till RPMI innehållande 2% B27 supplement minus insulin och 12 µM CHIR99021 för mesoderm induktion i 2-3 brunnar av plattor 14. Lägg bara RPMI innehållande 2% B27 supplement minus insulin för den nästa 24 h. Tillsätt 5 µM IWP4 till RPMI medium med 2% B27 komplettera minus insulin för nästa 24 h. Efter 72 h, ersätta mediet med RPMI innehållande 2% B27 supplement leder till generation av slående hjärtmuskelceller i 2-3 d.
      5. För endoderm induktion, ändra mediet i brunnar i 6-väl plåtarna till MCDB 131 kompletteras med 1,5 g/L natrium bikarbonat, 1 x Glutamax, 10 mM glukos, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 och 5µM av CHIR99021 för 24 h. kultur i samma medium utan CHIR99021 för 2-3 d 15.
      6. Följa protokollet immunfärgning från steg 2 för alla de tre utvecklingslinjerna och kolla av uttryck för relevanta markörer.

2. Genomet redigering av mänskliga iPSC använder CRISPR-Cas9

  1. beredning av Cas9 protein och sgRNA
    1. alikvotens Cas9 protein i mikrocentrifugrör i sterila förhållanden och lagra alikvoter av frysning rören vid -80 ° C.
    2. Design två inriktning guide RNAs per gen baserat på programvaran från MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) eller någon annan CRISPR guide design webtool. Rikta första eller andra exon av genen (baserat på öppen läsning ram) för att generera knockouts. Välj de två guider så att de skär nära varandra (~ 30-100 bp apart) och vi kan enkelt visualisera strykningen använder samma uppsättning screening primers. Välj guider från programvara utdata på grundval av högre kvalitetsresultat och lägre antal off-target platser. Design screening grundfärger med hjälp av den program primer blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Screening primers bör vara minst 100 bp borta från Cas9 skär platser och PCR-Produktstorlek ska helst vara mellan 400-700 bp för enklare förstärkning vid PCR.
    3. Design de två kompletterande sgRNA oligo DNAs (19-22 nukleotider i längd beroende på sekvensen guide) med en Bsa1 skär webbplats i varje ände. Oligo DNAs kan syntetiseras kommersiellt och glödgas för att bilda dubbel-strand DNA. För glödgning, tillsätt 1 µL varje 100 µM guider, 25 µL av glödgning buffert (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) och 23 µL av vatten. Inkubera i en termocykler programmerad att starta vid 95 ° C i 2 min och sedan gradvis nedkylning till 25 ° C över 45 min.
    4. Klon den 2 µL av resulterande fragment till en Bsa1 restriktionsenzym rötas 1 µL in-house T7 promotorn pCR2.1 vektor med en Cas9 bindande webbplats med T4 DNA-ligase enligt tillverkaren ' s protokollet.
    5. Sekvens de klonade DNA-fragment och när trohet är etablerad, in vitro- transkribera kloner med en T7-kit för att generera samma guide RNAs. Rena sgRNAs med en kommersiella kit och eluera i RNase-gratis vatten. Kontrollera den RNA-koncentrationen.
  2. Transfektionsprotokoll av hiPSCs
    1. kultur hiPSCs i mTeSR1 medium som beskrivs ovan tills cellerna är 40-50% konfluenta.
    2. Två timmar innan nucleofection, ersätta mediet med 2 mL av förvärmd mTeSR1 medium innehållande 10 µM rock hämmare.
    3. En timme senare, förbereda destination brunnar för nucleofected celler av utvärderingsenheten membran, beredda som ovan, från 12-well plate och ersätta med förvärmd 1 mL mTeSR1 medium med 10 µM rock-hämmare. Hålla vid 37 ° C för inkubering.
    4. Förbered nucleofection master mix (skala på lämpligt sätt beroende på proverna) för varje prov genom att lägga till 16,4 µL av P3 primär cell tillägg; 3.6 µL komplettera 1 från nucleofector kitet; 0,5 µg Cas9 protein och 0,5 µg av varje sgRNA i 22 µL per reaktionsvolym. pMAX GFP vector var också nucleofected enligt tillverkaren ' s rekommendationer i celler för att grovt uppskatta effektiviteten i iPSC transfection.
    5. Tvätta vart bra med 2 mL RT PBS efter aspirera mediet som innehåller rock-hämmare från iPSC brunnarna. Sedan aspirera PBS, tillsätt 1 mL cell avlossning lösning och inkubera plattan vid 37 ° C i 10 min.
    6. Resuspendera cellerna i 3 mL mTeSR1 medium och Pipettera försiktigt upp och ner för att generera en encellig suspension. Överföring separerade celler till en 15 mL Centrifugera röret innehållande 5 mL mTeSR1 medium.
    7. Räkna celler med cell counter och beräkna totala volym som erfordras för 0,5 x 10 6 celler/transfection. Placera önskad mängd celler i 15 mL centrifugrör, Centrifugera 200 x g för 5 min på RT och sug ut supernatant.
    8. Blandas varje enhet av 0,5 x 10 6 celler i 22 µL transfection huvudmixen bereddes i steg 4. Snabbt överföra celler in i centrala kammaren av en brunn på en nucleocuvette band. Placera remsan i en nucleofector enhet och nucleofect celler med hjälp av programmet CB150.
    9. Efter nucleofection, snabbt lägga till 80 µL av förvärmd mTESR1 medium som innehåller 10 µM rock-hämmare till varje brunn av nucleofected celler. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner.
    10. Försiktigt överföra celler från remsan till brunnar i membran pre belagda 12-väl plattan som innehåller mTeSR1 medium med rock-hämmare som bereddes i steg 3.
    11. Efter 1 d, ändra till färska mTeSR1 medium utan rock-hämmare. Skörden celler 2-3 d efter nucleofection för sortering av encelliga.
  3. Single-Cell isolering av riktade hiPSCs
    1. en dag före sortering, förbereda 96 brunnar MEF plattor genom sådd 2 x 10 6 celler/gelatin-belagd plåt i 10% FBS medium. Cirka 70-80% av klonerna överleva efter nucleofection och 2-3 MEF plattor kan förberedas för varje redigering experiment.
    2. Efter den natten inkubationen, ändra på medellång hESC medium (enligt tidigare) kompletteras med 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (hämmare till media att förbättra enda cellviabilitet), och att främja vidhäftning Fibronektin på 5 mg/mL.
    3. Ersätta mediet på hiPSCs i 12-väl plattan från mTeSR1 till mTeSR1 medium kompletteras med 1 x SMC4 för minst 2 h innan enda cell sorteras.
    4. Sug ut mediet från hiPSCs och tvätta cellerna försiktigt med PBS. Tillsätt 500 µL av cell avlossning lösning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C i ca 10 min efter aspirera PBS. Generera encelliga suspensionen genom att tillsätta 1 mL av mTeSR1 (unsupplemented) i varje brunn och pipettering försiktigt upp och ned flera gånger.
    5. Placera cellsuspension i en 15 mL koniska rör och Centrifugera under 5 minuter vid 200 x g vid RT. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL av mTeSR1.
    6. Sortera cellerna i enstaka celler med en cell sorterare med 100 mm munstycke under sterila förhållanden med en cell i den enskilda väl av 96 brunnar pläterar bereddes i steg 1.
    7. Fyra dagar efter sortering, koloni bildandet bör vara uppenbar, på denna punkt ersätta odlingssubstratet med hESC medium kompletteras med 1 x SMC4.
    8. Åtta dagar efter sortering, ersätta mediet med hESC medium och kultur för 2 d.
    9. Lossa kolonierna med 1 mg/mL kollagenas för 20 min och överföra dem till 24-väl membran belagda plattor i mTeSR1 med rock-hämmare. Låt de encelliga klonerna växa och extrahera deras genomiskt DNA efter duplicera eller utöka dem. Använda gen specifika primers för att förstärka mål-DNA med PCR.
    10. Användning fragment analyzer kit för inledande screening av PCR-förstärkta genomisk målregionen av alla kloner genom att köra dem via gel/färgen blanda enligt tillverkaren ' anvisningar. Uppskatta storleken på resulterande fragment i programvaran PROSize genom att jämföra det med lämpliga stegen, som drivs med prover. Sekvens den förväntade ' redigeras ' kloner och analysera sekvensering data att bekräfta redigering eller borttagningar.
    11. För att skilja monoallelic och biallelic kloner, förstärka den redigerade sekvensen med PCR och klon i pJET1.2 vektor. Skicka minst 8-10 kloner för sekvensering och kontrollera sekvensen för att bekräfta redigering i en eller båda alleler.
    12. När framgångsrikt riktade iPSC kloner har identifierats genom genotypning, undersöka för att bekräfta att de inte har förlorat pluripotency eller vunnit kromosomavvikelser genom processen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den här publikationen har vi följt ett enkelt men effektivt protokoll för generering av iPSC från mänskliga bukspottkörtelns celler använder integration eller fotavtryck-gratis Sendai virusvektorer. Figur 1A visar en schematisk representation av detta omplanering protokoll. Mänskliga bukspottkörtelns celler köptes kommersiellt odlade i Prigrow III medium och sensorik med Sendai virus som förklaras ovan. Sensorik spindeln formade bukspottkörtelns celler visade inte någon morfologiska förändringar i ~ 5 dagar efter Sendai virus transduktion dag 0, men då blir rundad med större nucleus och nucleoli. Några tidiga kolonier sågs efter en vecka efter transduktion men de plockades inte, liksom vår erfarenhet, dessa kolonier snabbt separera och är oftast de 'tidiga delvis omstyrda cellerna' som inte upprättar robust kolonier. Cirka 10-15 dagar efter cellsignalering, små ljusa kolonier observerades och plockades efter tillväxt (figur 1B, överst till höger). Mänskliga iPSC kolonier är kompakta, tätt packad med tydliga kanter (betraktas som 'fullt Omstyrda celler') (figur 1B, dag 23 nedre mitten) och 'delvis Omstyrda celler' är lösa luckor i kolonin (figur 1B, dag 23 nederst till höger). Omprogrammerade bukspottskörteln cell kolonierna växte dag 18 (figur 1Blängst ner till vänster) och var tillräckligt stor för att plockas manuellt av dag 23 (figur 1B, nedre mitten). Kolonierna var klädd på membran-belagda plattor efter plockning att få feeder-fri iPSC av dag 30-40 (figur 2A, till vänster). Några av dessa 'robusta' feeder-fria kolonier utökades och kännetecknas av uttryck för alkalisk fosfatas, pluripotency och yta markörer i feeder-fria förhållanden. Alla kloner testas var positiva för alkaliskt fosfatas som de vände klarröd efter analysen (figur 2A, till höger). Pluripotency markörerna NANOG, TRA-1-60, SSEA4, OCT4 och TRA-1-81 observerades också mycket uttrycks i alla kloner av immunfärgning eller FACS analys (figur 2B och figur 3A).

Dessa resultat visar att mänskliga iPSC kolonierna genereras från bukspottkörtelns celler uttryckt pluripotency markörer i feeder-fria villkor. Pluripotency bedömdes även genom riktad differentiering av mänskliga iPSC till tre groddar lager: ektoderm, mesoderm och endoderm. Kloner på membran kraftigt differentierade TUJ1-positiv nervceller (ektoderm), NKX2-5-positiva slående hjärtmuskelceller (mesoderm) och SOX17-positiv endodermala cellerna (figur 3B).

Efter noggrann karakterisering valdes 3-robust, feeder-fri iPSC klonal linjer för genomet redigering studier. Två guider med BsaI skär platser i ändar var avsedda för varje gen att skära nära varandra (dvs n mindre än ~ 100 bp). Schematiskt av protokollet visas i figur 4. Denna borttagning strategi används för de målgener som tillät oss att enkelt ta bort en del av den första eller andra exon av en gen. Denna strategi var mycket effektiv och vi kunde isolera redigerade kloner i varje försök. Guiderna var klonade in BsaI rötas vektor- och in vitro- transkriberas enligt ovan. Vi nucleofected guider (RNAs) och Cas9 protein som RNP komplex för snabb och effektiv redigering. Vi sorterade också cellerna som enstaka celler på MEFs som återvinning av celler är högre jämfört med de celler som sorterade ensamma på membran-belagda plattor. Genomiskt DNA var isolerad från alla kloner, target portion var förökas med PCR och löst på fragmentet analyzer till skärmen för förändringar i storlekar av målet fragment jämfört med kontrollerna. Fragment storlek jämfördes med stegen kör med prover att upptäcka 'redigerade' kloner (figur 4, botten). Detta gjorde screening av kloner lätt som vi kunde gå igenom > 90 kloner i en platta och resultat erhölls med en noggrannhet av ± 3 bp. De utvalda klonerna var sedan sekvenserade bekräfta vildtyp och muterade kloner. Vildtyp kloner hade ingen borttagning eller tillägg av baser medan muterade kloner hade antingen addition eller deletion i sekvensen jämfört med vildtyp. Klonerna visar borttagning eller tillägg i sekvensering var utökad och klonade in pJET1.2 vector att identifiera monoallelic och biallelic kloner av sekvensering av minst 8-10 kolonier per kloning. Monoallelic kloner hade baser tas bort eller läggas i en allel och den andra var oförändrad och liknar den vildtyp-allelen. Biallelic kloner hade borttagningar i båda allelerna. Ungefär som tre hundra kloner screenades för alla målgener, som identifierat cirka 9 monoallelic radering kloner och 3 biallelic radering kloner i varje fall. Detta motsvarar ungefär en 3-faldig minskning i frekvens av generation av biallelic kloner jämfört med monoallelic kloner. Heterogenitet inom den radering amplikoner återspeglas ofullkomlig och inkonsekventa NHEJ reparation. Uttrycket av genen bekräftades slutligen genom att extrahera RNA från målceller och genom att utföra RT-PCR.

Figure 1
Figur 1: omprogrammering av mänskliga bukspottkörtelns celler till feeder-fri pluripotenta celler (iPSC). (A) A Schematisk protokoll för generering av iPSC från mänskliga bukspottkörtelns celler visas. Bukspottkörtelns celler var odlas på kollagen-belagda plattor och överförs sedan till MEFs efter transduktion med mänskliga Sendai virusvektorer. Helt omprogrammeras kolonierna var sedan överförs till hESC kvalificerade membran och karakteriseras. (B) morfologisk förändringar efter Sendai virus transduktion. Innan transduktion visar bukspottkörtelns celler typiska spindel-liknande morfologi (överst till vänster, dag 0). Små, trånga kolonier visas MEFs som dag 12, som liknar mänskliga pluripotenta celler kolonier. Normalt fullt omprogrammerade mänskliga iPSC kolonierna har mycket tydliga gränser och kan plockas upp av dag 23-30. En dissocierade koloni på dag 23 visas längst ned till höger. Alla bilder fångades på 100 X förstoring (10 X-objektiv och 10 X okular). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av mänskliga iPSC. (A) A typiska fas kontrast bild av en iPSC koloni efter plockning och kultur i feeder-fria villkor (40 X, 4 X-objektiv och 10 X okular; vänster) efter Sendai virus omprogrammering av bukspottkörtelns celler. Alkaliskt fosfatas färgas röd iPSC kolonin är till höger. För alkaliskt fosfatas färgningen, iPSC kolonierna var fixeras och färgas röda efter tillägg av substratlösningen från kit. Bilderna var tagna vid 40 X. (B) immunfärgning för pluripotens markörer NANOG och OCT3/4 i feeder-fri mänskliga bukspottskörteln cell-derived iPSCs. DAPI användes för att färga kärnan blå som en kontroll. Alla bilder togs på 100 X förstoring. Skalstapeln = 100 µm i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3: karakterisering av pluripotency och differentiering potentiella av iPSC. (A), FACS analys av ytmarkörer SSEA4, TRA-1-60 och TRA-1-81 i feeder-fri iPSCs. Cellerna var separerade till enda cellsuspension och färgas för ytmarkörer SSEA-4, TRA-1-60 och TRA-1-81. Den lila toppen innehåller iPSC negativ (antikropp-kontroll) celler och bukspottskörteln iPSC kan visualiseras som en grön topp. (B) Immunofluorescerande avbildning av groddblad markörgener. Uttrycket av markörer TUJ1 ektoderm (grön), NKX2-5 mesoderm (röd) och SOX17 endoderm (röd) i celler efter riktad differentiering av bukspottskörteln iPSC. Motsvarande kontroll nukleära fläcken DAPI är blå. Alla bilder togs på 100 X förstoring. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schematisk av CRISPR/Cas9 radering strategi. Ett sgRNA par var utformade (markerade rött) med BsaI skär platser i slutet (visas som F och R) helst inriktning den första exon, glödgas, klonade i BsaI rötas modifierade vektor (pCR2.1, BsaI webbplats markeras grå), sekvenserade och in vitro- översatt. Understrukna sekvensen av vektor visar den del som tas bort efter BsaI matsmältningen. Positionen för screening primers indikeras i blått. Cas9 och vägleda RNAs var nucleofected i feeder-fri iPSC som ett komplex för genomisk borttagningar. iPSCs var sedan enda cell sorterade på 96 brunnar MEF tallrikar, odlade, överförs till membran, expanderat och screening av fragmentet analyzer. För att köra proverna på analysatorn, var genomisk DNAs av Cas9 och guide transfekterade kloner på membranet utdraget och passerade genom gel/dye mix i analysatorn att välja för potentiella 'redigerade' kloner (längst ner i mitten). De relevanta stege markörer, WT och potentiella redigerade kloner är markerade. Uttrycket av genen bekräftades genom att extrahera RNA och analysera med Q-PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omprogrammering av mänskliga kroppsceller att iPSCs har gett ett stort uppsving i fälten grundläggande biologi forskning, personlig medicin, sjukdom modellering, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin16. Många nuvarande och allmänt använda metoder för mänskliga iPSC generation kräver användning av virus med risk för integrering i den mottagande arvsmassan eller episomal vektorer med låg omprogrammering effektivitet. Här presenterar vi en effektiv metod för att generera feeder-fri iPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med Sendai-virus, vilket leder till 'fotavtryck gratis' och effektiv omprogrammering. De resulterande mänskliga iPSCs är fria från viral transgener, underhålla pluripotency och undvika användning av okända exogena faktorer. Generering av iPSCs feeder-fria förhållanden har låg omplanering effektivitet, så vi omprogrammeras primära bukspottkörtelns celler på mataren celler och flyttade sedan kolonierna till feeder-fri membran för expansion, kultur och karakterisering. Fusion av dessa tekniker ger stabil, pålitlig och effektivare iPSC programmering.

Vi har också genereras iPSCs från mänskliga fibroblaster och andra primära celler med denna metod, vilket tyder på att Sendai-virus kan användas för att programmera många olika celler. Viktiga överväganden är: för optimal konfluens av primära celler behöver omprogrammeras som för få eller för många celler konsekvenser omprogrammering effektivitet. en tidigare passage av primära celler när cellerna delar fortfarande optimalt; noggrann titrering av den virala vektorer som resulterar i minimal cell apoptos och en hög effektivitet leder till lätt plocka upp av robust kolonier; att kontrollera förlusten av Sendai vektor transgenens uttryck av PCR på 10-15 passager att säkerställa att iPSCs 'fotavtryck gratis'; och strikt sterila förhållanden för kultur av iPSC på membran.

Vi använde en bekväm och effektiv metod för CRISPR genomet modifiering för att redigera iPSC genomet. Denna teknik kombinerar Cas9 protein och sgRNA, RNP komplex att erkänna och klyva de kompletterande DNA-sekvenserna. Det kan enkelt anpassas till rikta en genomiska sekvensen genom att helt enkelt ändra den 20 bp guiden RNA. Vår metod ger ett enkelt protokoll för effektiv och reproducerbara redigering av mänskliga iPSCs eftersom de är mer arbetsintensiva, svårt att transduce och dyra att underhålla än andra celler. Vi designar minst två intilliggande men icke-överlappande guider för varje målgenen så att en enda uppsättning screening primers kan användas för screening redigerade klonerna. Dessutom, genererar användning av två guider ~ 30-100 bp apart stora borttagning, som enkelt kan visualiseras under inledande screening och garanterar utarmning av protein. Guiderna kan testas i HEK-293 celler inledningsvis att uppskatta effektivitetsvinster innan analysen i iPSC. Dessutom är det viktigt att fastställa parametrar för rutinmässig transfection reagenser i iPSC. Använda pMAXGFP plasmid, transfection effektivitetsvinsterna av > 80% och gen inriktning/störningar effektivitetsvinsterna av 3-10% i iPSCs uppnås rutinmässigt. Direkt leverans av Cas9 RNP komplex i celler i vårt protokoll ger snabba åtgärder och snabb omsättning och bibehåller höga andelen riktade ändring. Vår strategi sysselsätter enda cell sortering efter nucleofection av guider och Cas9 protein att övervinna ett betydande hinder av genen inriktning i blandat iPSC befolkningen och se till att clonality cellerna. Denna 'Roman' helhetssyn är enkel, lätt att multiplex, tar bara några veckor och kräver inte någon antibiotika urval. Vi inte observera någon förlust i effektivitet genom att sekventiellt borttagningar av CRISPRs i en cellinje eller iPSCs, även om karyotyp analys behöver utföras i sådana fall att säkerställa genomisk stabilitet. Klonerna bör också kontrolleras av uttryck för pluripotens markörer. Även om inte fokus i denna publikation, detta protokoll kan vara adjungerad till inducera exakt genetisk modifiering av inklusive mallen reparation i transfection cocktail17,18.

Slutligen, baserat på vår erfarenhet, viktiga överväganden för iPSC redigering protokoll är: rationell design guider att minimera eller helt undvika off target mutationer särskilt i regionen ”frö” eller nära PAM motivet ändras; optimera nucleofection effektivitet i iPSCs att säkerställa leverans av RNPs; att kontrollera kvaliteten på beredda guider; titrering av guide och Cas9 protein koncentrationer och validera deras aktivitet av in vitro biokemiska klyvning analyser eller som beskrivs i denna artikel i mänskliga cellssuch som HEK celler som är lättare att kultur och transfect; användning av tidig passage iPSCs i loggen fas av tillväxt och nå ~ 50% konfluens; varsam hantering av celler med mild medium förändringar efter enstaka cell sortering för att säkerställa överlevnaden av celler.

Vi anser att protokollet ovan skisserat avgränsas i tillräcklig detalj kommer att utrusta läsarna med en färdplan för att skapa och redigera iPSC på ett reproducerbart sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

BT är en av grundarna av renovera biovetenskaper Inc.

Acknowledgments

Arbete i labbet stöddes av postdoktorsstipendium grant till Dr Anjali Nandal och förberedande bidrag från Maryland Stem Cell Research Fund att BT (TEDCO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit Invitrogen A16517 Thaw on ice; S No: 1
Trypsin EDTA Gibco Life Tech 25300-054 0.05%, 100 ml; S No: 2
Rock inhibitor (Y-27632) Milipore SCM075 Use 10 μM; S No: 3
DMEM/F-12 medium Invitrogen 11330-032 S No: 4
Serum replacement (KSR) Gibco 10828028 S No: 5
DMEM Invitrogen 11960069 1X; S No: 6
Fetal bovine serum Thermo Scientific SH30071.03 Aliquot; S No: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid Thermo Scientific 35050061 1/100; S No: 8
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050 1/100; S No: 9
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers Hausser Scientific 02-671-54 S No: 11
0.1% Gelatin Solution STEMCELL Technologies 7903 Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12
SSEA-4 antibody Santacruz sc-21704 1/100; S No: 13
TRA-1-81 antibody Cell Signaling 4745S 1/200; S No: 14
OCT4 antibody Santa Cruz sc-5279 1/1,000; S No: 15
Collagen I, Rat Tail Life Technologies A10483-01 Keep cold; S No: 16
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) Invitrogen A21202/A10042 1/2,000; S No: 17
DPBS Hyclone SH30028LS 1X; S No: 18
100-mm tissue culture dish Falcon 353003 S No: 20
96-well tissue culture plate Falcon 353078 S No: 21
6-well tissue culture plate Falcon 353046 S No: 22
Dissecting scope  Nikon SMZ745 S No: 23
Picking hood NuAire NU-301 S No: 24
15 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 188271 S No: 25
50 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 227261 S No: 26
Sodium pyruvate Invitrogen 11360 S No: 28
β-mercaptoethanol Sigma M7522 S No: 29
Prigrow III medium ABM TM003 S No: 31
Countess™ Cell Counter Invitrogen C10227 S No: 32
Faxitron X-ray system Faxitron CellRad S No: 33
Accutase Innovative cell Technologies AT-104 S No: 34
Collagenase Life Technologies 17104019 1mg/ml stock; S No: 35
Dispase STEMCELL Technologies 7923 S No: 36
hESC qualified matrigel BD Biosciences 354277 To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37
bFGF R & D 233-FB Stock 10 ug/ml; S No: 38
Paraformaldehyde EMS 15710 4% stock in PBS; S No: 39
TRA-1-60 Santa Cruz sc-21705 1/100; S No: 40
NANOG ReproCELL RCAB0004P-F 1/100; S No: 41
Tween 20 Sigma P9416-100ML S No: 42
Alkaline Phosphatase kit Stemgent 00-0055 S No: 43
Cas9 protein PNA Bio CP01-50 Thaw and aliquot; S No: 44
Goat or donkey serum Sigma D9663/G9023 S No: 45
Triton X-100 Sigma X100-100ML S No: 46
DAPI Thermo Scientific D1306 S No: 47
Tris Sigma 9285-100ML S No: 48
NaCL Sigma S7653-250G S No: 49
EDTA Sigma BP2482-500 S No: 50
T4 DNA ligase NEB M0202T S No: 51
Mega Shortscript T7 kit Thermo Scientific AM1354 S No: 52
Mega Clear kit Thermo Scientific AM1908 S No: 53
SMC4 BD Biosciences 354357 S No: 54
Fibronectin STEMCELL Technologies 7159 S No: 55
CloneJET cloning kit Thermo Scientific K1232 S No: 56
Fragment analyzerTM Advanced Analytical S No: 57
mTeSR1 medium kit STEMCELL Technologies 5850 Warm to room temperature; S No: 58
Freezing medium mFreSR™ STEMCELL Technologies 5855 S No: 59
Freezing medium CryoStor® STEMCELL Technologies 7930 S No: 60
MEFs Globalstem GSC-6301G S No: 61
L-glutamine Invitrogen 25030081 S No: 62
Human pancreatic cells ABM T0159 S No: 63
STEMdiff™ Neural Induction Medium Stemcell Technologies 5835 S No: 64
RPMI Thermofisher 11875-093 S No: 65
2% B27-insulin Thermofisher A1895601 S No: 66
CHIR99021 Stemcell Technologies 72052 S No: 67
IWP4 Stemcell Technologies 72552 S No: 68
2% B27 Thermofisher 17504044 S No: 69
MCDB 131 Life Technologies 10372019 S No: 70
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S8761-100ML S No: 71
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G S No: 72
BSA Proliant 68700 S No: 73
GDF8 Pepro-Tech 120-00 S No: 74
TUJ1 antibody EMD Milipore AB9354 S No: 75
NKX2-5 antibody Santa Cruz Sc-14033 S No: 76
SOX17 antibody R & D systems AF1924 S No: 77
Propidium iodide Thermo Scientific P3566 S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™ Lonza AAF-1002 S No: 79
FACSAria II (cell sorter) BD biosciences SORP UV S No: 80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. 564612 (2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics