मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

Developmental Biology
 

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (RPE) का उत्पादन करने के लिए । विधि विकास कारकों और छोटे अणुओं का एक संयोजन का उपयोग करता है चौदह दिन और परिपक्व, कार्यात्मक RPE तीन महीने के बाद में अपरिपक्व RPE में स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव प्रत्यक्ष ।

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Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (128), e56274, doi:10.3791/56274 (2017).

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Abstract

हम रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (RPE) में pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को निर्देशित करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन. एक विस्तृत और पूरी तरह से प्रोटोकॉल प्रदान करने का उद्देश्य स्पष्ट रूप से प्रत्येक चरण को प्रदर्शित करने के लिए और इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए आसानी से उपलब्ध बनाने के लिए है । इस प्रोटोकॉल के एक समरूप परत में परिणाम ंयूनतम या कोई मैंयुअल विच्छेदन के साथ RPE की जरूरत है । यहां प्रस्तुत विधि को प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रभावी होना दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, हम मध्यवर्ती सेल बैंकों की cryopreservation के लिए विधियों का वर्णन करते है जो दीर्घावधि भंडारण की अनुमति देते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न RPE iPSC रोग में एक डिश मॉडलिंग या नैदानिक आवेदन के लिए उपयोगी हो सकता है.

Introduction

रेटिना वर्णक उपकला photoreceptors के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करता है कि pigmented कोशिकाओं के एक monolayer है. रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (RPE) प्रकाश अवशोषण, पोषक तत्व और आयन परिवहन, रेटिनॉइड सायक्लिंग, photoreceptor बाहरी खंड phagocytosis, और वृद्धि कारक स्राव1सहित दृष्टि में कई कार्यों, है. वहाँ रेटिना dystrophies की एक किस्म है कि RPE के समारोह को प्रभावित और दृष्टि की हानि में परिणाम, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन और रेटनाइटिस पिगमेंटोसा सहित. pluripotent स्टेम सेल से RPE की पीढ़ी के इन नेत्र रोगों को समझने के लिए अनुसंधान की सुविधा हो सकती है, और सेल के उपचारों के लिए RPE के एक असीमित स्रोत प्रदान कर सकते हैं2. वास्तव में, कई नैदानिक परीक्षणों pluripotent स्टेम सेल3से व्युत्पंन RPE का उपयोग कर चल रहे हैं ।

इस भेदभाव प्रोटोकॉल मूलतः Buchholz द्वारा वर्णित किया गया था4 और Clegg से पहले प्रकाशित विधि पर आधारित था5। प्रक्रिया vivo विकासात्मक प्रक्रिया में सामांय इंसुलिन वृद्धि कारकों (IGF) के हेरफेर के माध्यम से एक RPE भाग्य के प्रति विभेदित pluripotent स्टेम सेल प्रत्यक्ष करने के लिए नकल, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (FGF-2; FGF-basic), परिवर्तन वृद्धि कारक बीटा (TGF-β), और WNT रास्ते4,5. प्रोटोकॉल काफी एक WNT मार्ग एगोनिस्ट के अलावा देर प्रोटोकॉल है, जो ९७.७७% ± ०.१% पूर्व melanosome प्रोटीन (PMEL) सकारात्मक कोशिकाओं उपज में सुधार हुआ था, और एक्सो के लिए अनुकूलित किया गया है-मुक्त शर्तों6,7। परिणामस्वरूप RPE के लिए प्रतिलिपि और प्रोटीन के स्तर पर RPE मार्करों एक्सप्रेस दिखाया गया है, उचित ध्रुवीकरण के साथ ज्ञात RPE विकास कारकों को गुप्त, और बाहर photoreceptor बाहरी क्षेत्रों के phagocytosis8ले । इस प्रोटोकॉल और अधिक तेजी से और भेदभाव के "सहज" प्रोटोकॉल है कि बुनियादी fibroblast विकास कारक8के सरल हटाने शामिल विश्वसनीय है । इसके अलावा, आरएनए अनुक्रमण डेटा इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त RPE बहुत अधिक आम सहज दृष्टिकोण8का उपयोग कर प्राप्त करने वालों के समान हैं कि शो । 14 दिन विधि RPE है कि फिट "5 पी" Mazzoni द्वारा उल्लिखित9 (pigmented, ध्रुवीकरण, phagocytic, पोस्ट-mitotic, बहुभुज)9। हालांकि इस प्रक्रिया को कई प्रयोगशालाओं में प्रतिलिपि साबित हो गया है, हम कई अतिरिक्त निर्देशित भेदभाव विधियों कि हाल के वर्षों में प्रकाशित किया गया है स्वीकार करना चाहते है10,11,12 , 13.

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. प्रोटोकॉल के दिन के लिए 0 दिन के लिए रिएजेंट की तैयारी

  1. निम्न मध्यम घटक तैयार करें:
    1. रेटिना विभेदक मध्यम (RDM) के १०० मिलीलीटर 100x N2 पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़कर बनाने के लिए, के 2 मिलीलीटर 50x B27 अनुपूरक, और 1 मिलीलीटर की 100x गैर-आवश्यक अमीनो अम्ल (NEAA) से ९६ मिलीलीटर की Dulbecco & #39; s संशोधित आवश्यक माध्यम/पोषक तत्व मिश्रण f12 9 (DMEM/f12).
    2. 1 एम nicotinamide (एनआईसी) के 10 मिलीलीटर बाँझ पानी की 8 मिलीलीटर में एनआईसी के १.२२१ जी भंग करके, भंवर, और बाँझ पानी के साथ 10 मिलीलीटर की मात्रा लाने के लिए बनाते हैं । हल बाँझ फ़िल्टर.
  2. निम्नलिखित विकास कारकों और छोटे अणुओं को तैयार करें:
    1. पुनर्गठन संयोजक माउस नोगिन, मानव dickkopf WNT संकेतन मार्ग अवरोधक 1 (DKK-1), और IGF-1 से १०० & #181; g/एमएल प्रत्येक में ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) फॉस्फेट-बफ़र्ड समाधान (पंजाब) में । आवश्यकतानुसार Aliquot और स्टोर पर-20 & #176; ग 3 माह तक के लिए ।
    2. पुनर्गठन FGF-basic to 10 & #181; जी/एमएल और संयोजक मानव/चूहे Activin A to १०० & #181; g/एमएल प्रत्येक में ०.१% BSA में पंजाब । Aliquot के रूप में आवश्यकतानुसार और स्टोर पर-८० & #176; ग 1 वर्ष तक के लिए ।
    3. पुनर्गठन र ५४०२ (FGF रिसेप्टर-विशिष्ट tyrosine कळेनासे अवरोधक) और CHIR99021 (ग्लाइकोजन सिंथेस कळेनासे 3, जीएसके-3 & #946;, अवरोधक) से 10 मिमी प्रत्येक में dimethyl sulfoxide (DMSO) । Aliquot और स्टोर at-20 & #176; C 1 वर्ष या 6 माह तक के लिए, क्रमशः ।
  3. दिन 0 और/या दिन के लिए निंनलिखित प्राप्त करें: 1x ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) समाधान (०.२ ग्राम EDTA प्रति 1 L पंजाब), 1x पंजाबस-/(कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना पंजाब, पीएच ७.४), 1x trypsin जैसे पृथक्करण एंजाइम (TDE), DPBS (Dulbecco & #39; s पंजाब), RPE संल मध्यम (आरएसएम), और Y-२७६३२ dihydrochloride (प्रयोग पर 10 & #181; M).
< p class = "jove_title" > 2. दिन 0: Pluripotent के दिन विभेद के लिए स्टेम सेल मार्ग

  1. विकसित स्टेम सेल कालोनियों में फीडर-नि: शुल्क, सीरम मुक्त स्थितियों के लिए लगभग ८०% संगम से पहले passaging.
    नोट: इस चरण के अनुकूलन पर विवरण के लिए चर्चा देखें ।
  2. कोट एक 12 extracellular मैट्रिक्स के साथ अच्छी तरह से प्लेट-आधारित hydrogel (ECMH) निर्माता की सिफारिशों के अनुसार । कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए सेट करने की अनुमति दें या रात 4 & #176; C.
  3. Aliquot की मात्रा RDM और पंजाब-/दिन के लिए आवश्यक 0 और एक जल स्नान में गर्म करने के लिए ३७ & #176; C वृद्धि कारकों को जोड़ने से पहले. कमरे के तापमान के लिए EDTA लाओ ।
  4. 10 मिमी एनआईसी, ५० एनजी/एमएल नोगिन, 10 एनजी/एमएल DKK-1 के साथ गर्म RDM को दिन 0 के लिए आवश्यक वृद्धि कारकों जोड़ें, और 10 एनजी/ चरण १.२ में बताए गए स्टॉक्स से, add १०० & #181; NIC के l, 5 & #181; l के नोगिन, 1 & #181; l के DKK-1, और 1 & #181; l की IGF-1 से 10 मिलीलीटर की RDM.
  5. के लिए स्टेम सेल है कि विभेद के लिए पारित किया जाएगा से आकृति विज्ञान के आधार पर सभी विभेदित कालोनियों को दूर करने के लिए उठाओ । विभेदित कक्षों को मैन्युअल रूप से निकालने के लिए P10 प्लास्टिक टिप का उपयोग करें.
    नोट: कालोनियों के भीतर अपारदर्शी कोशिकाओं के साथ ही कालोनियों के बीच Fibroblastic कोशिकाओं को हटाया जा करने के लिए विभेदित कोशिकाओं से संकेत मिलता है । विभेदित कक्षों के बारे में विवरण के लिए चर्चा देखें ।
  6. एक 12-अच्छी तरह से थाली के 4 कुओं में एक 6 अच्छी तरह से थाली की एक भी अच्छी तरह से गद्यांश (1:4) ।
    नोट: इस स्तर पर passaging स्टेम कोशिकाओं पर विवरण के लिए चर्चा देखें ।
    1. स्टेम कोशिकाओं से स्टेम सेल मध्यम महाप्राण और पूर्व गर्म पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार कुओं धो-/
    2. महाप्राण पंजाब-/-और कुल्ला एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी प्लेट के प्रति EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार ।
    3. धीरे से प्लेट को झुकाएं और EDTA को महाप्राण । कोशिकाओं को समय से पहले उठाने से बचने के लिए थाली को किसी भी तरह से उत्तेजित न करें ।
    4. तीसरे धोने के बाद, 3-5 मिनट के लिए हुड में कमरे के तापमान पर EDTA और गर्मी की 1 मिलीलीटर जोड़ें । इस मशीन के दौरान थाली परेशान मत करो ।
    5. महाप्राण EDTA और RDM के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर है कि अतिरिक्त माध्यम के ०.५ मिलीलीटर के साथ वरीयता प्राप्त हो जाएगा जोड़ें । उदाहरण के लिए, एक 12-अच्छी तरह से थाली के 4 कुओं पर थाली के लिए RDM की ४.५ मिलीलीटर के साथ एक 6 अच्छी तरह थाली के 1 अच्छी तरह धो लें ।
    6. एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए धीरे कोशिकाओं अलग । एक शंकु ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा RDM में कोशिकाओं triturate । अलग कोशिकाओं के बड़े झुरमुट, लेकिन एक सेल निलंबन करने के लिए triturate नहीं है । प्लास्टिक में समान रूप से कक्षों को वितरित करें । इस चरण को जल्दी से पूरा करने के लिए प्लेट में पुनर्आसक्ति को रोकने के ।
    7. बीज कोशिकाओं पर ECM-लेपित 12-अच्छी तरह से प्लेटें (प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन की 1 मिलीलीटर).
    8. प्लेट आगे पीछे झुकाव को समान रूप से कुओं भर में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए । धीरे ३७ & #176 पर एक सेल संस्कृति मशीन में जगह है, और 5% सह अगले मध्यम परिवर्तन तक 2
    9. सही समय पर ध्यान दें । प्रत्येक दिन एक ही समय में मध्यम बदलें ।
< p class = "jove_title" > 3. दिन 1 से 14: वृद्धि कारकों के अलावा

  1. day 1: सभी कुओं पर मध्यम बदलें (प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर) 0 दिन के लिए वृद्धि कारक संरचना के साथ RDM का उपयोग (२.४ कदम देखें) ।
  2. दिवस 2: RDM का उपयोग कर मध्यम बदलें (1 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) 10 मिमी एनआईसी, 5 एनजी/एमएल FGF-बेसिक, 10 एनजी/एमएल नोगिन, 10 एनजी/एमएल DKK-1, और 10 एनजी/एमएल IGF-1 के साथ । चरण १.२ में बताए गए स्टॉक्स से, add १०० & #181; NIC के l, 5 & #181; l के FGF-basic, 1 & #181; l का नोगिन, 1 & #181; l of DKK1, और 1 & #181; l का IGF1 10 एमएल के RDM.
  3. दिवस 4: RDM का उपयोग कर मध्यम बदलें (1 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) के साथ १०० एनजी/एमएल activin एक, 10 एनजी/एमएल DKK-1, और 10 एनजी/ चरण १.२ में वर्णित स्टॉक्स से, जोड़ें 10 & #181; l के activin A, 1 & #181; l के DKK1, और 1 & #181; l की IGF-1 से 10 मिलीलीटर की RDM.
    ध्यान दें: निरीक्षण है कि कोशिकाओं को इस स्तर पर धाराप्रवाह रहे हैं ।
  4. Day 6: RDM (1 मिलीलीटर प्रति well) के साथ १०० एनजी/एमएल activin A और 10 & #181; एम एसयू ५४०२ का प्रयोग कर मध्यम बदलें । स्टेप १.२ में बताए गए स्टॉक्स से जोड़ें 10 & #181; l की activin A और 10 & #181; l के र ५४०२ से 10 एमएल के RDM.
  5. दिन 8, 10, और 12: RDM का उपयोग कर मध्यम बदलें (1 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) के साथ १०० एनजी/एमएल activin A, 10 & #181; m र ५४०२, र 3 & #181; m CHIR99021. चरण १.२ में बताए गए स्टॉक्स से, add 10 & #181; l के activin A, 10 & #181; l के र ५४०२, और 3 & #181; l के CHIR99021 को 10 एमएल के RDM.
< p class = "jove_title" > 4. संवर्धन के दिन RPE

  1. कोट के 0 पारित करने के लिए विकास कारक के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली कम निर्माता सिफारिशों के अनुसार ECMH । कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए सेट करने की अनुमति दें या रात 4 & #176; C.
  2. Aliquot DPBS की मात्रा की जरूरत है और RDM के प्रति अच्छी तरह से संवर्धन और एक पानी के स्नान में गर्म करने के लिए 1 मिलीलीटर ३७ & #176; ग. TDE के कमरे के तापमान और गर्म आवश्यक मात्रा आरएसएम के लिए लाओ, रोगाणुरोधी रिएजेंट, और Y-२७६३२ ३७ & #176; C.
  3. जोड़ने के लिए रोगाणुरोधी रिएजेंट और वाई-२७६३२ प्राप्त 0.5 x और 10 & #181; मी रचनाएं क्रमशः आरएसएम करने के लिए । लगाव सुधारने के लिए पहले 4-7 दिनों तक इस माध्यम का प्रयोग करें ।
  4. महाप्राण सभी कुओं से मध्यम खर्च और पूर्व गर्म RDM (कोई वृद्धि कारकों की आवश्यकता) के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, मैन्युअल रूप से टुकड़े और एक P10 प्लास्टिक टिप का उपयोग कर सभी गैर-RPE कोशिकाओं को दूर परिमार्जन.
    नोट: उदाहरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें.
  6. विच्छेदन के बाद
  7. , महाप्राण RDM और सभी कोशिका का मलबा । अच्छी तरह से प्रति पूर्व गर्म DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें ।
  8. TDE के प्रति अच्छी तरह से एक 12-खैर प्लेट और मशीन के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ३७ & #176; C के लिए 5 min. एक सेल खुरचनी का प्रयोग धीरे प्लेट से कोशिकाओं को दूर करने के लिए । एक P1000 प्लास्टिक का उपयोग धीरे triturate करने के लिए सेल/TDE सस्पेंशन द्वारा pipetting अप और डाउन 3-4 बार एक वर्दी सस्पेंशन बनाने के लिए ।
  9. /TDE निलंबन 1:10 पूर्व उष्ण आरएसएम में, बिना Y-२७६३२ । केंद्रापसारक कक्ष तापमान पर 5 मिनट के लिए १७३ x g पर सेल निलंबन ।
  10. महाप्राण सेल गोली से मध्यम और आरएसएम में कोशिकाओं को reसस्पैंड 10 & #181 के साथ; एम वाई-२७६३२ (अच्छी तरह से समृद्ध प्रति 1 मिलीलीटर).
  11. ४० & #181 के साथ एक नायलॉन जाल सेल छलनी का उपयोग कोशिकाओं तनाव; मी pores । किसी निर्दिष्ट खंड में कक्षों की संख्या की गणना किसी hemocytometer का उपयोग करके और तनावपूर्ण समाधान में कक्षों की एकाग्रता की गणना करें ।
  12. बीज कोशिकाओं पर वृद्धि कारक कम ECM-लेपित प्लेटों पर 1 x 10 5 कोशिकाओं/सेमी 2 में 4 एमएल आरएसएम के साथ 10 & #181; एम वाई-२७६३२.
  13. की जगह आरएसएम को 10 & #181; M Y-२७६३२ ४८ ज सेल सीडिंग के बाद और मीडिया हर 3-4 दिन की जगह जारी रखने के लिए ( उदा सोमवार और गुरुवार को ) । 10 & की जगह मत #181; M Y-२७६३२ के बाद 4-7 दिन ।
  14. के लिए कोशिकाओं को परिपक्व होने की अनुमति दें 28 से ३५ दिन के लिए ३७ & #176; ग र 5% सह 2 । आरएसएम हर 3-4 दिन (सोमवार और गुरुवार को जैसे ) को प्रतिस्थापित करने के लिए जारी रखें.
< p class = "jove_title" > 5. परिपक्वता: गद्यांश 1 और 2 of RPE

< p class = "jove_content" > नोट: खंड में 1 अच्छी तरह से एक 6-well प्लेट या एक T75 कुप्पी के रूप में कोष्ठकों द्वारा संकेत के लिए संकेत दिया जाता है ।

28 दिन के बीच
  1. 0 बीतने के ३५ के लिए, कोट एक 6 अच्छी तरह से प्लेट (T75 कुप्पी) निर्माता सिफारिशों के अनुसार ECMH के साथ ।
  2. Aliquot DPBS और आरएसएम की मात्रा को एक जल स्नान में जरूरत और गर्म करने के लिए ३७ & #176; ग. कमरे के तापमान के लिए TDE लाओ ।
  3. महाप्राण कुओं से मध्यम खर्च और एक अच्छी तरह से दो बार धो 2 मिलीलीटर (10 मिलीलीटर) पूर्व गर्म DPBS के साथ ।
    नोट: 10 & #181 का उपयोग न करें; M Y-२७६३२.
  4. महाप्राण DPBS और TDE के 1 मिलीलीटर (5 एमएल) जोड़ें । ३७ & #176 पर मशीन में प्लेस; सी और 5% सह 2 5 मिनट के लिए । मशीन के बाद, एक औंधा माइक्रोस्कोप पर देखने के लिए कोशिकाओं को अनुबंध और अलग कर रहे हैं की पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं.
  5. एक उचित आकार के सेल खुरचनी का उपयोग कर, धीरे से अच्छी तरह से या कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं को हटा दें ।
  6. एक P1000 टिप (10 mL सीरम प्लास्टिक) का उपयोग धीरे triturate करने के लिए सेल/TDE सस्पेंशन अप और डाउन 3-4 बार एक वर्दी सस्पेंशन बनाने के लिए ।
  7. पतला सेल सस्पेंशन 1:10 आरएसएम में । आरक्षित 2 मिलीलीटर (5 मिलीलीटर) आरएसएम की अच्छी तरह से कुल्ला करने के लिए और पतला सेल निलंबन करने के लिए जोड़ें ।
    नोट: एंजाइम जोखिम समय 25 min.
  8. से अधिक करने की अनुमति नहीं
  9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १७३ x g पर सेल का निलंबन केंद्रापसारक ।
  10. महाप्राण सेल गोली से मध्यम और आरएसएम
  11. के 1 मिलीलीटर (5 मिलीलीटर) में कोशिकाओं reसस्पेंड
  12. ४० & #181 के साथ एक नायलॉन जाल सेल छलनी का उपयोग कोशिकाओं तनाव; मी pores । किसी निर्दिष्ट खंड में कक्षों की संख्या की गणना किसी hemocytometer का उपयोग करके और तनावपूर्ण समाधान में कक्षों की एकाग्रता की गणना करें ।
  13. बीज कोशिकाओं पर ECMH-लेपित प्लेटों पर 1 x 10 5 कोशिकाओं/सेमी 2 में 4 एमएल (15 एमएल) के आरएसएम.
  14. कोशिकाओं को 30 दिनों के लिए परिपक्व अनुमति देते हैं । आरएसएम हर 3-4 दिन में बदलने के लिए जारी रखें ।
  15. दोहराने के ऊपर प्रक्रिया (चरण 5.2-5.11) दिन में 30 बीतने से कोशिकाओं को पारित करने के लिए 1 2.
< p class = "jove_title" > 6. एक मध्यवर्ती सेल बैंक बनाना: गद्यांश का Cryopreservation 2 दिन 3-5 RPE

< p class = "jove_content" > नोट: Cryopreserve कोशिकाओं जबकि वे subconfluent (~ ५०%) हैं और वर्णक फिर से प्राप्त नहीं किया है ।

  1. कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, 10% DMSO 3x10 6 कोशिकाओं/एमएल
  2. की एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पैंड करने की जरूरत के साथ cryopreservation माध्यम की मात्रा की गणना
  3. चरण ५.२ के लिए ५.८ का पालन करें । 10% DMSO के साथ cryopreservation मीडियम में सेल गोली reसस्पेंड 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं/एमएल और १.२ एमएल क्रायोजेनिक शीशियों के लिए सेल निलंबन की 1 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
  4. स्थान पर क्रायोजेनिक शीशियों को ठंडे करने के लिए डिज़ाइन किया गया कंटेनर में-1 & #176; c/मिनट और स्थान पर-८० & #176; ग रात भर । लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: इन कोशिकाओं गल पर 3 गद्यांश हो जाएगा । संस्कृति लक्षण वर्णन से पहले 30 दिनों के लिए कोशिकाओं । बीज गद्यांश 3 RPE पर १.५ x 10 5 प्रति सेमी 2 गल पर । < सुप वर्ग = "xref" > २ , < सुप वर्ग = "xref" > ४ , < सुप वर्ग = "xref" > ६ , < सुप वर्ग = "xref" > 7

Representative Results

यह विधि एक सजातीय, pigmented, और RPE के cuboidal monolayer के उत्पादन में परिणाम है । चित्रा 1 में समयरेखा चित्रा 2में चित्रित छवियों से मेल खाती है । जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है, स्टेम सेल कालोनियों को निर्धारित किनारों के साथ कसकर पैक किया जाता है और कालोनियों के भीतर या अपारदर्शी कोशिकाओं के बीच कोई fibroblastic कक्ष नहीं होते हैं । चित्रा बी + अपरिपक्व RPE है कि subconfluent रहे है की एक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है । यदि कोशिकाओं को पहले से ही इस स्तर पर धाराप्रवाह हैं, वे अनुमान है कि भेदभाव की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है विस्तार नहीं कर सकते । कोशिकाओं है कि गंभीर रूप से subconfluent है एक monolayer और फार्म तंग जंक्शनों, उपकला की विशेषता स्थापित करने में सक्षम नहीं होगा । इस संगम को ऑप्टिमाइज़ करने के बारे में विवरण चर्चा अनुभाग में उल्लिखित हैं. चित्र 2c दो सबसे आम प्रकार की आकृति विज्ञान से पता चलता है गैर-RPE कि इस भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न हो सकता है: तंत्रिका या fibroblastic पैच. यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन तंत्रिका पैच विशेष रूप से एक विदारक माइक्रोस्कोप पर अपारदर्शी दिखाई देते हैं, जबकि परिभाषित, fibroblastic पैच की तरह एक विदारक माइक्रोस्कोप पर लगभग पारदर्शी हैं. यह एक इथेनॉल प्रूफ लैब पेन के साथ एक टिशू कल्चर प्लेट पर इन क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए और अधिक आसानी से दोनों एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप और विदारक माइक्रोस्कोप पर उन्हें पहचान करने के लिए सहायक हो सकता है । आंकड़े 2 डी-एफ विशेषता उज्ज्वल सीमाओं, cobblestone आकृति विज्ञान, और रंजकता है कि एक स्वस्थ, RPE के परिपक्व संस्कृति का संकेत दिखा । चित्रा 3 एक उच्च आवर्धन छवि को पूरी तरह से परिपक्व चरण के विपरीत और चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित RPE के विभिंन उपस्थिति दिखाने के लिए है । बीतने पर 3 दिन 30, कोशिकाओं के लक्षण वर्णन है कि पिछले प्रकाशनों में वर्णित किया गया है के लिए तैयार हैं, आरएनए अभिव्यक्ति सहित, प्रोटीन अभिव्यक्ति, विकास कारक स्राव, और phagocytosis2,4,6 ,7. इन characterizations बताते है कि इन चित्रों में प्रतिनिधित्व कोशिकाओं न केवल pigmented और cuboidal हैं, लेकिन यह भी phagocytic, पोस्ट mitotic, और ध्रुवीकरण ।

Figure 1
चित्र 1: । विकास कारकों और RPE की परिपक्वता के अलावा के लिए समयरेखा । वृद्धि कारकों 12-अच्छी तरह से 0-14 दिन से प्लेटों में जोड़ रहे हैं । परिपक्व RPE 6 में संस्कृति रहे है अच्छी तरह से प्लेटें या संवर्धन के दिन से T75 कुप्पी 30 दिनों के बाद गल (बीतने 3 दिन 30) । तीर एंजाइमी कक्ष passaging इंगित करते हैं । (A-E) समयरेखा के नीचे आरेख 2में छवियों के अनुरूप हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि आकृति विज्ञान और परिपक्व RPE का संगम. passaging (A) के लिए तुरंत पहले प्रेरित pluripotent स्टेम सेल । अपरिपक्व RPE कोशिकाओं दिन 2 पर subconfluent () और लेने से पहले 14 दिन पर संवर्धन निकालने के लिए; गैर RPE पैच (सफेद तीर से संकेत) पैच या अपारदर्शी "रिबन" () के रूप में दिखाई देते हैं । 30 दिन (डी, ई, और एफ) पर 0, 1, और 3 गद्यांश में RPE करें । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: यात्रा 3 पर परिपक्व RPE: दिवस 30 चरण कंट्रास्ट (A) में चित्रित Cuboidal आकृति विज्ञान और चमकीले क्षेत्र (बी) में चित्रित रंजकता. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए. विधि एक फीडर से मुक्त, सीरम मुक्त संस्कृति विधि दोनों मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था । १९९८ में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के प्रारंभिक अलगाव और २००७ में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) के व्युत्पत्ति के बाद से, स्टेम सेल संस्कृति विधियों के एक भीड़ विकसित किया गया है14,15,16, 17. इन तरीकों स्टेम सेल कालोनियों है कि इस भेदभाव के लिए अतिसंवेदनशील होते है उत्पादन के लिए पर्याप्त होना चाहिए । इस विधि के लागू करने के लिए कोई ज्ञात सीमाएं ठीक से व्युत्पंन और pluripotent स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखा है ।

सबसे महत्वपूर्ण कदम passaging (चरण २.५) और प्रक्रिया (चरण ४.५) के 14 दिन में मैनुअल विच्छेदन के लिए संभावित आवश्यकता के दिन 0 करने के लिए स्टेम सेल के हैं । जब स्टेम सेल कालोनियों से विभेदित कोशिकाओं को हटाने के लिए उठा, केंट18में छवियों को देखें । संकेत के रूप में, कालोनियों के भीतर और अपारदर्शी कोशिकाओं के बीच fibroblastic कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल18शुरुआत से पहले हटाया जा करने की आवश्यकता है कि विभेदित कोशिकाओं का संकेत. केवल विभेदित, कसकर निर्धारित किनारों के साथ कॉलोनियों पैक अंतर के लिए पारित किया जाना चाहिए ।

स्टेम कोशिकाओं की संख्या में अच्छी तरह से (चरण 2.6.7) प्रति वरीयता प्राप्त तथ्य यह है कि स्टेम सेल बीतने पर एक भी सेल निलंबन में triturated नहीं किया जा सकता है और सही एक hemocytometer का उपयोग कर गिना जा सकता है द्वारा जटिल है । ८०% धाराप्रवाह स्टेम कोशिकाओं के सन्निकटन एक 12-अच्छी तरह से थाली के 4 कुओं में एक 6 अच्छी तरह से थाली के passaging 1 के लिए संकेत दिया है । स्टेम सेल लाइनों के बीच अंतर, जैसे विकास दर, कितनी जल्दी प्रभावित कर सकते है अपरिपक्व RPE दिन 0 से 4 के बीच संगम तक पहुंचने । स्टेम कोशिकाओं सटीक संगम की परवाह किए बिना RPE उत्पादन होगा, लेकिन कोशिका उपज नकारात्मक इस स्तर पर भी विरल हैं, तो प्रभावित हो जाएगा । अपरिपक्व RPE कोशिकाओं लगभग 40-50% दिन 1 पर धाराप्रवाह और लगभग १००% 4 दिन से धाराप्रवाह होना चाहिए । यदि कोशिकाओं को 4 या 6 दिन से एक धाराप्रवाह monolayer उत्पादन नहीं कर रहे हैं, प्रोटोकॉल 0 दिन में एक उच्च बोने की सघनता पर दोहराया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि 1 अच्छी तरह से एक 6-अच्छी थाली के 4 कुओं को 0 दिन में एक 12-अच्छी तरह से थाली के लिए पारित किया गया था और अपरिपक्व RPE १००% 4 दिन में धाराप्रवाह नहीं हैं, 0 दिन पर एक 1:3 या 1:2 बीतने के लिए बोने की कमी या स्टेम कोशिकाओं को और अधिक धाराप्रवाह बनने की अनुमति passaging से पहले । यह एक सुसंगत बोने घनत्व जब एकाधिक सेल लाइनों की तुलना स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

14 दिन में मैन्युअल विच्छेदन चरण केवल तब आवश्यक है जब गैर-RPE कक्ष संस्कृति (चित्र 2c) में मौजूद हों । प्रोटोकॉल के लिए CHIR99021 के अलावा के बाद से, कई pluripotent स्टेम सेल लाइनों कोई मैनुअल विच्छेदन के लिए थोड़ा की आवश्यकता है । कुछ तैयारी तंत्रिका पैच की एक उच्च घटना है और यह उन कोशिकाओं को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि RPE 3 गद्यांश के माध्यम से पारित 0 में व्यवहार्य नहीं हैं, यह सभी गैर RPE कोशिकाओं को दूर करने के लिए पर्याप्त समय लेने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल दोहराने के लिए संभव है । यह अक्सर नहीं होता है, लेकिन यह ध्यान दें कि 14 दिन पर विच्छेदन कदम जब जरूरत अनुकूलित किया जा सकता है उल्लेख किया है ।

वहां RPE भेदभाव प्रोटोकॉल है कि लागत में भिंनता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संस्कृति तरीकों, दक्षता, ठहराव, और कार्यात्मक मूल्यांकन, जिसके बाद अच्छी तरह से2की समीक्षा की गई है की एक किस्म है । हम अपनी प्रभावकारिता, अनुकूलन क्षमता, और सेल लाइनों4,7,8की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रयोज्यता के कारण यहां विस्तृत 14 दिन विधि पसंद करते हैं । इस प्रोटोकॉल में cryopreservation कदम भी भविष्य के उपयोग के लिए एक मध्यवर्ती सेल बैंक बनाने में एक प्रमुख लाभ प्रदान करता है, बहुत से परहेज-प्रयोगों में बहुत परिवर्तनशीलता । एक 12-अच्छी तरह से थाली के केवल 4 कुओं के साथ शुरू, यह 6 में विस्तार करने के लिए संभव है-अच्छी तरह से पारित 0 और मार्ग पर T75 कुप्पी में प्लेटें 1 और 2 । पारित होने पर 2 दिन 3-5, जब कोशिकाओं अभी भी subconfluent है और वर्णक प्राप्त नहीं है, यह कोशिकाओं के लाखों के दसियों cryopreserve के लिए संभव है और फिर गल परिपक्व RPE, निर्दिष्ट मार्ग 3 दिन 30, आरएनए अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति, विकास कारक स्राव, phagocytosis, आदि । हम भी स्थापित किया है प्रोटोकॉल के लिए RPE विस्तार करने के लिए 13 मार्ग 19

आगे खोज, इस विधि नेत्र रोग के iPSC मॉडलिंग और सेलुलर थेरेपी के लिए RPE की पीढ़ी के लिए के लिए उपयोगी हो जाएगा । साथ iPSC रोग मॉडलिंग करने का संबंध है, इस प्रोटोकॉल वर्तमान में एक ही रोगी से गैर सही नियंत्रण के साथ CRISPR-सही लाइनों से RPE उत्पादन करने के लिए प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा रहा है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सिंथेटिक सब्सट्रेट और एक्सो मुक्त शर्तों है कि अच्छा विनिर्माण एक सेलुलर थेरेपी के लिए आवश्यक प्रथाओं का पालन करने के लिए उपयोगी होते है के लिए अनुकूल है ।

Disclosures

डॉ Clegg एक सह reअपक्षय पैच टेक्नोलॉजीज LLC के संस्थापक है ।

Acknowledgments

यह काम विजन के लिए माला पहल द्वारा समर्थित किया गया था, के लिए कैलिफोर्निया संस्थान (सीआईआरएम; पलाश DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 और TG2-01151), वरमोंट समुदाय फाउंडेशन, Breaux फाउंडेशन, और फाउंडेशन लड़ अंधापन व्यान-गुंद शोधों अनुसंधान त्वरण कार्यक्रम ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet Baker model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood Labconco Model 3970405 laminar flow bench top
dissecting microscope Nikon SMZ 1500 heated stage
air-jacketed CO2 incubator Sanyo MCO-17AIC 37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope Olympus IX53
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
DMEM/F12 Gibco 10565042
N2 Supplement Gibco 17502048
B27 Supplement Gibco 17504044
NEAA Gibco 11140050
Name Company Catalog Number Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide Sigma N0636
Recombinant mouse noggin R&D systems 1967-NG-025
Recombinant human DKK-1 R&D systems 5439-DK-010
Recombinant IGF-1 R&D systems 291-G1-200
FGF-basic Peprotech 100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A Peprotech 120-14E
SU5402 FGF inhibitor Santa Cruz Biotechnology sc-204308
Name Company Catalog Number Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free Corning 356237 extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free Corning 354277 growth factor reduced ECMH
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA) Gibco 15040066
DPBS Gibco 14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium) Gibco 10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) Gibco 12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) Lonza BW04-743Q
Y-27632 Tocris 12-541-0 (1254)
CryoStor CS10 BioLife Solutions 210102 cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial Corning 430487
Mr. Frosty (freezing container) Nalgene 5100-0001 freezing container
Normocin Invivogen ant-nr-2 antimicrobial reagent
Name Company Catalog Number Comments
Other Equipment
Pipet-aid Drummond 4-000-101
12-well culture plate Corning CLS3516 Used during differentiation.
T75 flask Corning 430641 Used during RPE maturation.
6-well culture plate Corning CLS3513 Used during RPE maturation.
cell scraper Corning 08-771-1A Used during passages.
cell strainer Falcon 352340 Used during passages before cell count.

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References

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