Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

Developmental Biology
 

Summary

Denne protokol beskriver hvordan man producerer retinale pigment epitel celler (ÅV) fra pluripotente stamceller. Metoden bruger en kombination af vækstfaktorer og små molekyler for at styre differentieringen af stamceller til umodne ÅV i 14 dage og modne, funktionelle ÅV efter tre måneder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (128), e56274, doi:10.3791/56274 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi beskriver en robust metode til direkte differentiering af pluripotente stamceller i retinal pigment epitel celler (ÅV). Formålet at levere en detaljeret og grundig protokol er klart vise hvert trin og at gøre dette let tilgængeligt for forskere i feltet. Denne protokol resulterer i et ensartet lag af ÅV med minimal eller ingen manuel dissektion behov. Metoden præsenteres her har vist sig at være effektiv til induceret pluripotente stamceller (iPSC) og menneskelige embryonale stamceller. Derudover beskrives metoder til kryopræservering af mellemliggende cellebanker, der tillader langtidsopbevaring. ÅV genereret ved hjælp af denne protokol kan være nyttige for iPSC sygdom i parabol modellering eller klinisk anvendelse.

Introduction

Den retinale pigment epitel er en éncellelag af pigmenterede celler, der giver afgørende støtte til fotoreceptorer. Retinale pigment epitel celler (ÅV) har mange funktioner i vision, herunder lysabsorption, næringsstof og ion transport, retinoid cykling, fotoreceptor ydre segment fagocytose, og vækst faktor sekretion1. Der er en bred vifte af retinale dystrophies, der påvirker funktionen af ÅV og resulterer i et tab af synet, herunder aldersrelateret makuladegeneration og retinitis pigmentosa. Generation af ÅV fra pluripotente stamceller kan lette forskning for at forstå disse øjensygdomme, og kan give en ubegrænset kilde til ÅV til celle behandlinger2. Faktisk bruger flere kliniske forsøg undervejs ÅV afledt af pluripotente stamceller3.

Denne differentiering protokol blev oprindelig beskrevet af Buchholz4 og var baseret på den tidligere udgivne metode fra Clegg5. Proceduren, der efterligner den normale i vivo udviklingsmæssige proces direkte udifferentierede pluripotente stamceller mod en ÅV skæbne via manipulation af insulin vækstfaktor (IGF), basic fibroblast vækstfaktor (FGF-2; FGF-basic), omdanne vækst faktor beta (TGF-β) og WNT veje4,5. Protokollen blev betydeligt forbedret ved tilsætning af en WNT pathway agonist sent i den protokol, som gav 97.77% ± 0,1% pre-melanosome protein (PMEL) positive celler, og er blevet tilpasset til xeno-fri betingelser6,7. Den resulterende ÅV har vist sig at udtrykke ÅV markører på udskrift og protein niveauer, til at udskille kendte ÅV vækstfaktorer med passende polaritet, og udføre fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter8. Denne protokol er hurtigere og mere pålidelig end "spontan" protokoller af differentiering, der involverer simple fjernelse af basic fibroblast vækstfaktor8. Derudover RNA sequencing data viser, at RPE opnået med denne protokol er meget lig dem, opnået ved hjælp af de mere almindelige spontan tilgang8. Den 14-dages metode genererer ÅV, der passer til "5 P's" nævnt af Mazzoni9 (pigmenteret, polariseret, fagocyterende, post mitotiske, polygonale)9. Mens denne procedure har vist sig for at være reproducerbare i flere labs, ønsker vi at anerkende flere ekstra styret differentiering metoder, der er blevet offentliggjort i de seneste år10,11,12 , 13.

Protocol

1. forberedelse af reagenser til dag 0 til dag 14 i protokollen

  1. forberede følgende mellemstore komponenter:
    1. gøre 100 mL af retinale differentiering medium (RDM) ved tilsætning af 1 mL af 100 x N2 tillæg, 2 mL 50 x B27 supplement, og 1 mL 100 x ikke-essentiel aminosyre (NEAA) 96 ml Dulbecco ' s ændret afgørende medium/næringsstof blanding F12 9 (DMEM/F12).
    2. Gøre 10 mL 1 M nicotinamid (NIC) af opløsende 1.221 g NIC i 8 mL sterilt vand, vortexing og bringe volumen til 10 mL sterilt vand. Sterilt Opløsningen filtreres.
  2. Forberede følgende vækstfaktorer og små molekyler:
    1. rekonstruere rekombinant mus noggin, menneskelige dickkopf WNT signal pathway hæmmer 1 (kr.-1), og IGF-1 til 100 µg/mL hver i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufferet løsning (PBS). Delprøve efter behov og opbevares ved-20 ° C i op til 3 måneder.
    2. Rekonstruere FGF-basic til 10 µg/mL og rekombinant human/mus/rotte Activin A 100 µg/ml hver i 0,1% BSA i PBS. Delprøve efter behov og opbevares ved-80 ° C i op til 1 år.
    3. Rekonstruere SU 5402 (FGF-receptoren-specifikke tyrosin kinase inhibitor) og CHIR99021 (glykogen syntase kinase 3, GSK-3β, hæmmer) til 10 mM i dimethylsulfoxid (DMSO). Alikvot og opbevares ved-20 ° C for op til 1 år og 6 måneder, hhv.
  3. Få følgende for dag 0 og/eller dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning (0,2 g EDTA per 1 L PBS), 1 X PBS- / - (PBS uden calcium eller magnesium, pH 7,4), 1 x trypsin-lignende dissociation enzym (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), ÅV støtte medium (RSM), og Y-27632 dihydrochlorid (brug på 10 µM).

2. Dag 0: Dag af pluripotente stamceller Passage for differentiering

  1. vokse stamcelle kolonier i feeder-fri, serum-fri betingelser til ca 80% sammenløbet før passaging.
    Bemærk: Se diskussion for at få oplysninger om optimering af dette trin.
  2. Frakke en 12-godt plade med ekstracellulære matrix-baserede hydrogel (ECMH) som pr fabrikantens anbefalinger. Gør det muligt for at indstille i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  3. Alikvot mængde af RDM og PBS- / - behov for dag 0 og varme i et vandbad på 37 ° C før du tilføjer vækstfaktorer. Bringe EDTA til stuetemperatur.
  4. Tilføje vækstfaktorer nødvendigt for dag 0 til den varmede RDM med 10 mM NIC, 50 ng/mL noggin, 10 ng/mL kr.-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra de lagre, der er beskrevet i trin 1.2, Tilsæt 100 µL af NIC, 5 µl af noggin, 1 µL af DKK-1 og 1 µL af IGF-1 til 10 mL af RDM.
  5. Vælge for at fjerne alle differentieret kolonier baseret på morfologi fra de stamceller, der vil være passaged for differentiering. Hjælp en P10 afpipetteres aflæsse hen til manuelt fjerne de differentierede celler.
    Bemærk: Fibroblastic celler mellem kolonier samt den uigennemsigtige celler i kolonier angive differentierede celler skal fjernes. Se diskussion for detaljer om differentierede celler.
  6. Passage et enkelt godt af en 6-godt plade i 4 brønde i en 12-godt plade (1:4).
    Bemærk: Se diskussion for detaljer på passaging stamceller på dette stadium.
    1. Opsug stamcelle medium fra stamceller og brøndene vaskes en gang med 2 mL pre varmede PBS- / -.
    2. Opsug PBS- /- og skyl godt tre gange med 1 mL af EDTA pr. brønd af et 6-godt plade.
    3. Forsigtigt VIP pladen og Opsug EDTA. Ikke agitere plade på nogen måde at undgå tidligt løfte cellerne.
    4. Efter den tredje vask, tilsættes 1 mL af EDTA og inkuberes ved stuetemperatur i hood for 3-5 min. Forstyr ikke pladen under denne inkubering.
    5. Opsug EDTA og tilsættes 1 mL af RDM pr. brønd, der vil være seedet med 0,5 mL af ekstra medium. For eksempel, vaske 1 godt af en 6-godt plade med 4,5 mL RDM plade på 4 brønde i en 12-godt plade.
    6. Bruger en celle skraber forsigtigt Adskil celler. Indsamle alle celler i en konisk slange og hakkede celler i RDM af pipettering op og ned 5 gange. Adskille store klumper af celler, men ikke hakkede til enkelt cellesuspension. Distribuere celler jævnt i pipette. Fuldfør dette trin hurtigt for at forhindre limning til pladen.
    7. Frø celler på ECM-belagt 12-godt plader (1 mL cellesuspension pr. brønd).
    8. Vippe plade frem og tilbage for at distribuere celler jævnt i brøndene. Anbring forsigtigt i en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 indtil den næste ændring af mellemlang.
    9. Bemærk det nøjagtige tidspunkt. Ændre medium på samme tidspunkt hver dag.

3. Dag 1 til 14: tilføjelse af vækstfaktorer

  1. dag 1: ændre medium på alle boringer (1 mL pr. brønd) ved hjælp af RDM med vækstfaktor sammensætning for dag 0 (Se trin 2.4).
  2. Dag 2: ændre medium ved hjælp af RDM (1 mL pr. brønd) med 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, 10 ng/mL noggin, 10 ng/mL kr.-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra de lagre, der er beskrevet i trin 1.2, tilføje 100 µL af NIC, 5 µL af FGF-basic, 1 µL af noggin, 1 µL af DKK1 og 1 µL af IGF1 til 10 mL af RDM.
  3. Dag 4: ændre medium ved hjælp af RDM (1 mL pr. brønd) med 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL kr.-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra de lagre, der er beskrevet i trin 1.2, tilføje 10 µL af activin A, 1 µL af DKK1 og 1 µL af IGF-1 til 10 mL af RDM.
    Bemærk: Observere, at cellerne er sammenflydende på dette stadium.
  4. Dag 6: ændre medium ved hjælp af RDM (1 mL pr. brønd) med 100 ng/mL activin A og 10 µM SU 5402. Fra de lagre, der er beskrevet i trin 1.2, tilsæt 10 µL af activin A og 10 µL af SU 5402 til 10 mL af RDM.
  5. Dage 8, 10 og 12: ændre medium ved hjælp af RDM (1 mL pr. brønd) med 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 og 3 µM CHIR99021. Fra de lagre, der er beskrevet i trin 1.2, tilføje 10 µL af activin A, 10 µL af SU 5402 og 3 µL af CHIR99021 til 10 mL af RDM.

4. Dag af berigelse til Passage 0 af ÅV

  1. pels 6-godt plade med vækstfaktor reduceret ECMH som pr fabrikantens anbefalinger. Gør det muligt for at indstille i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  2. Alikvot volumen af DPBS behov og 1 mL af RDM pr. brønd af berigelse og varme i et vandbad på 37 ° C. Bring TDE til stuetemperatur og varm nødvendige mængde af RSM, antimikrobiel reagens og Y-27632 til 37 ° C.
  3. Tilføj antimikrobiel reagens og Y-27632 at opnå 0,5 x og 10 µM kompositioner henholdsvis til RSM. Brug dette medium for de første 4-7 dage til at forbedre vedhæftet fil.
  4. Aspirat brugt medium fra alle brønde og tilsættes 1 mL pr. brønd af pre varmede RDM (ingen nødvendige vækstfaktorer).
  5. Manuelt ved hjælp af en dissekere mikroskop, dissekere og skrabe væk alle ikke-ÅV celler ved hjælp af en P10 afpipetteres tip.
    Bemærk: Se afsnittet repræsentative resultater for eksempler.
  6. Efter dissektion, Aspirér RDM og alle celle debris. Vaskes to gange med 1 mL af pre varmede DPBS pr. brønd.
  7. Tilsættes 0,5 mL TDE pr. brønd af et 12-godt plade og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Brug en celle skraber forsigtigt fjerne celler fra pladen. Bruge en P1000 pipette til forsigtigt hakkede celle/TDE suspension af pipettering op og ned 3 - 4 gange til at oprette et ensartet suspension.
  8. Fortyndes celle/TDE suspension 1:10 i pre varmede RSM, uden Y-27632. Centrifugeres cellesuspension ved 173 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  9. Opsug medium fra celle pellet og resuspend celler i RSM med 10 µM Y-27632 (1 mL per beriget brønd).
  10. Stamme celler ved hjælp af en nylon mesh celle si med 40 µm porer. Tæller antallet af celler i en angivet diskenhed ved hjælp af en hemocytometer og beregne koncentrationen af celler i opløsningen anstrengte.
  11. Frø celler på vækstfaktor reduceret ECM-belagte plader på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL af RSM med 10 µM Y-27632.
  12. Erstatte RSM med 10 µM Y-27632 48 timer efter celle såning og fortsætte med at erstatte media hver 3-4 dage (f.eks. på mandage og torsdage). Erstatter ikke den 10 µM Y-27632 efter 4-7 dage.
  13. Tillader cellerne til at modnes til 28-35 dage ved 37 ° C og 5% CO 2. Fortsætte med at erstatte RSM hver 3-4 dage (f.eks. på mandage og torsdage).

5. Modning: Passage 1 og 2 af ÅV

Bemærk: diskenheder er indiceret til 1 godt af en 6-godt plade eller en T75 kolben, som er angivet med parenteser.

  1. Mellem passage 0 dage 28 og 35 coat en 6-godt plade (T75 kolbe) med ECMH som pr fabrikantens anbefalinger.
  2. Alikvot mængde DPBS og RSM nødvendige og varme i et vandbad på 37 ° C. bringe TDE til stuetemperatur.
  3. Aspirat brugt medium fra brønde og vask hver godt to gange med 2 mL (10 mL) af pre varmede DPBS.
    Bemærk: Brug ikke 10 µM Y-27632.
  4. Opsug DPBS og tilsættes 1 mL (5 mL) af TDE. Sted i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min. Efter inkubationen Se celler på en inverteret mikroskop til at bekræfte cellerne er kontraherende og afmontering.
  5. Ved hjælp af en passende størrelse celle skraber, forsigtigt fjerne cellerne fra bunden af brønd eller kolbe.
  6. Bruger en P1000 tip (10 mL serologisk pipette) til forsigtigt hakkede celle/TDE suspension op og ned 3 - 4 gange til at oprette et ensartet suspension.
  7. Fortyndes celle suspension 1:10 i RSM. Reserve 2 mL (5 mL) af RSM skyl godt/kolbe og føje til en fortyndet cellesuspension.
    Bemærk: Tillad ikke enzym eksponeringstid overstiger 25 min.
  8. Centrifugeres cellesuspension ved 173 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  9. Opsug medium fra celle pellet og resuspend celler i 1 mL (5 mL) af RSM
  10. Stamme celler ved hjælp af en nylon mesh celle si med 40 µm porer. Tæller antallet af celler i en angivet diskenhed ved hjælp af en hemocytometer og beregne koncentrationen af celler i opløsningen anstrengte.
  11. Frø celler på de ECMH-belagte plader på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL (15 mL) af RSM.
  12. Tillader cellerne til at modne i 30 dage. Fortsætte med at ændre RSM hver 3-4 dage.
  13. Gentag ovenstående procedure (trin 5.2-5.11) på dag 30 til passage celler fra passage 1 til 2.

6. At skabe en mellemliggende celle Bank: kryopræservering af Passage 2 dag 3-5 ÅV

Bemærk: Cryopreserve celler, mens de er subconfluent (~ 50%) og har ikke genvundet pigment.

  1. Baseret på antallet af celler, beregne mængden af kryopræservering medium med 10% DMSO skulle resuspend celler i en koncentration på 3 x 10 6 celler/mL.
  2. Følg trin 5.2 til 5.8. Resuspenderes celle i kryopræservering medium med 10% DMSO til 3 x 10 6 celler/mL og overføres 1 mL af cellesuspension til 1,2 mL kryogene hætteglas.
  3. Placer kryogene hætteglas i en indefrysning container designet til at køle-1 ° C/min. og placere ved-80 ° C natten over. Overføre til flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
    Bemærk: Disse celler vil være passage 3 efter optøning. Kultur cellerne for 30 dage før karakterisering. Frø passage 3 ÅV på 1,5 x 10 5 per cm 2 efter optøning. 2 , 4 , 6 , 7

Representative Results

Denne metode resulterer i produktionen af en homogen, pigmenteret og cuboidal éncellelag af ÅV. Tidslinjen i figur 1 svarer til de billeder, der er afbildet i figur 2. Som vist i figur 2A, er stamcelle kolonier tæt pakket med definerede kanter og ingen fibroblastic celler mellem kolonier eller uigennemsigtig celler i kolonier. Figur 2B giver en repræsentation af umodne ÅV, der er subconfluent. Hvis cellerne er allerede sammenflydende på dette stadium, kan de udvide fremskrivninger, der er afgørende for differentiering proces. Celler, der er alvorligt subconfluent vil ikke kunne etablere en éncellelag og danner stramme kryds, karakteristisk for epitel. Oplysninger om, hvordan du optimerer denne sammenløbet er beskrevet i afsnittet diskussion. Figur 2 c viser morfologi af de to mest almindelige typer af ikke-ÅV, der måtte opstå under denne differentiering proces: neurale eller fibroblastic pletter. Det er vigtigt at bemærke, at disse neurale patches synes især uigennemsigtig på et dissekere mikroskop, der henviser til, at de definerede, fibroblastic-lignende pletter er næsten gennemsigtig på en dissekere mikroskop. Det kan være nyttigt at markere disse områder på en vævskultur plade med en ethanol-bevis lab pen mere let kan identificere dem på både sammensatte lysmikroskop og dissekere mikroskop. Tal 2D-F viser karakteristiske lyse kanter, brostensbelagte morfologi og pigmentering, der indikerer en sund, modning kultur af ÅV. Figur 3 er en højere forstørrelse billede at vise de forskellige udseende af fuldt modne ÅV skildret af fasekontrast og lysfelt mikroskopi. På passage er 3 dag 30, cellerne klar til karakterisering, der er blevet beskrevet i tidligere publikationer, herunder RNA udtryk, protein udtryk, vækstfaktor sekretion og fagocytose2,4,6 ,7. Disse beskrivelser vise, at de celler, der er repræsenteret i disse billeder er ikke kun pigmenteret og cuboidal, men også fagocyterende post mitotiske og polariseret.

Figure 1
Figur 1:. Tisdlinje for tilsætning af vækstfaktorer og modning af ÅV. Vækstfaktorer føjes til 12-godt plader fra dag 0-14. Modning ÅV er kulturperler i 6-godt plader eller T75 kolber fra dagen for berigelse til 30 dage efter tøbrud (passage 3 dag 30). Pilene angiver enzymatisk celle passaging. (A-E) under tidslinjer svarer til billederne i figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative morfologi og sammenløbet af modning ÅV. Induceret pluripotente stamceller umiddelbart før passaging for differentiering (A). Umodne ÅV celler subconfluent på dag 2 (B) og før pick at fjerne berigelse på dag 14; ikke-ÅV patches (angivet med hvide pile) vises som patches eller uigennemsigtig "bånd" (C). ÅV på passage 0, 1 og 3 dag 30 (D, E og F). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: modne ÅV på passage 3: dag 30 Cuboidal morfologi afbildet i fasekontrast (A) og pigmentering afbildet i lysfelt (B). Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver hvordan man producerer retinale pigment epitel celler fra pluripotente stamceller. Metoden blev optimeret ved hjælp af både menneskelige embryonale og inducerede pluripotente stamceller fra et feeder-fri, serum-fri kultur metode. Siden den oprindelige isolering af humane embryonale stamceller i 1998 og afledning af induceret pluripotente stamceller (iPSC) i 2007, et væld af stamceller kultur metoder har været udviklet14,15,16, 17. Disse metoder bør være tilstrækkeligt for producerende stamcelle kolonier, der er modtagelige for denne differentiering. Der er ingen kendte begrænsninger for anvendelsen af denne metode til ordentligt afledte og vedligeholdt pluripotente stamceller.

De mest kritiske trin er passaging af stamceller til dag 0 af differentiering (trin 2,5) og potentielle behovet for manuel dissektion på dag 14 af processen (trin 4.5). Når picking fjerne differentierede celler fra stamceller kolonier, henvise til billeder i Kent18. Som anført, angive de fibroblastic celler mellem kolonierne og de uigennemsigtige celler i kolonier differentierede celler, der skal fjernes, før du begynder denne protokol18. Kun udifferentierede, tætpakkede kolonier med definerede kanter skal være passaged for differentiering.

Antallet af stamceller seedede pr. brønd (trin 2.6.7) kompliceres af, at stamcellerne kan ikke være triturated i en enkelt cellesuspension ved passage og præcist kan ikke medregnes ved hjælp af en hemocytometer. Tilnærmelse af 80% sammenflydende stamceller er indiceret til passaging 1 godt af en 6-godt plade i 4 brønde i en 12-godt plade. Forskelle mellem stamcellelinjer, såsom vækst, kan påvirke, hvor hurtigt de umodne ÅV nå sammenløbet mellem dage 0 til 4. Stamcellerne vil producere ÅV uanset præcise sammenløbet, men celle udbytte vil blive negativt påvirket, hvis cellerne er alt for sparsomme i denne fase. De umodne ÅV celler skal være ca 40-50% sammenflydende på dag 1 og næsten 100% sammenflydende dagen 4. Hvis cellerne ikke producerer en sammenflydende éncellelag af dag 4 eller 6, bør protokollen gentages på et højere seeding tæthed på dag 0. For eksempel, hvis 1 godt af en 6-godt plade var passaged til 4 huller i en 12-godt pladen på dag 0 og den umodne ÅV er ikke 100% sammenflydende på dag 4, reducere Seedning til en 1:3 eller 1:2 passage på dag 0 eller tillade stamceller til at blive mere sammenflydende før passaging. Det er afgørende at etablere en ensartet såning tæthed, når man sammenligner flere cellelinjer.

Manuel dissektion skridt på dag 14 er kun nødvendige, når ikke-ÅV celler er til stede i kulturen (figur 2 c). Da tilsætning af CHIR99021 til protokollen kræver mange pluripotente stamcellelinjer lidt at ingen manuel dissektion. Nogle præparater har en højere forekomst af neurale patches og det er afgørende at fjerne disse celler. Hvis ÅV ikke er levedygtig på passage 0 gennem passage 3, er det muligt at gentage differentiering protokollen tager tilstrækkelig tid til at fjerne alle ikke-ÅV celler. Det sker ikke ofte, men det er nævnt her for at bemærke, at trinnet dissektion dag 14 kan optimeres, når det er nødvendigt.

Der er en bred vifte af ÅV differentiering protokoller, der varierer i pris såvel som kultur metoder, effektivitet, kvantificering og funktionel vurdering, hvor sidstnævnte har været gennemgået grundigt2. Vi foretrækker den 14-dages metode detaljeret her på grund af dens effektivitet, tilpasningsevne og anvendelighed til en bred vifte af celle linjer4,7,8. Kryopræservering skridt i denne protokol giver også en stor fordel i at skabe en mellemliggende celle bank til fremtidig brug, undgå lot-for-lot variabilitet i eksperimenter. Starter med kun 4 brønde i en 12-godt plade, er det muligt at udvide i 6-godt plader på passage 0 og T75 kolber på passage 1 og 2. På passage 2 dag 3-5, når cellerne er stadig subconfluent og ikke har genvundet pigment, er det muligt at cryopreserve millioner af celler og derefter optø den modne ÅV, udpeget passage 3 dag 30, kontrollere RNA udtryk, protein udtryk, vækst faktor sekretion, fagocytose, osv. Vi har også etableret protokoller for at udvide ÅV for op til 13 passager 19.

Rettes blikket fremad, vil denne metode være nyttigt for iPSC modellering af okulær sygdomme og for generation af ÅV til cellulære terapi. Med hensyn til iPSC sygdom modellering anvendes denne protokol i øjeblikket i laboratoriet til at producere ÅV fra CRISPR-korrigeret linjer med ikke-korrigeret kontrol fra den samme patient. Denne protokol er desuden tilpasses syntetiske substrater og xeno-fri betingelser, der er nyttige for at overholde god fremstillingsmæssig praksis kræves for en cellulær terapi.

Disclosures

Dr. Clegg er medstifter af regenerativ Patch Technologies LLC.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Garland initiativ for Vision, California Institute for regenerativ medicin (CIRM, grants DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 og TG2-01151), The Vermont Fællesskabet Foundation, The Breaux Foundation, og den Foundation Fighting blindhed Wynn-Gund Translationel forskning Acceleration Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet Baker model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood Labconco Model 3970405 laminar flow bench top
dissecting microscope Nikon SMZ 1500 heated stage
air-jacketed CO2 incubator Sanyo MCO-17AIC 37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope Olympus IX53
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
DMEM/F12 Gibco 10565042
N2 Supplement Gibco 17502048
B27 Supplement Gibco 17504044
NEAA Gibco 11140050
Name Company Catalog Number Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide Sigma N0636
Recombinant mouse noggin R&D systems 1967-NG-025
Recombinant human DKK-1 R&D systems 5439-DK-010
Recombinant IGF-1 R&D systems 291-G1-200
FGF-basic Peprotech 100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A Peprotech 120-14E
SU5402 FGF inhibitor Santa Cruz Biotechnology sc-204308
Name Company Catalog Number Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free Corning 356237 extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free Corning 354277 growth factor reduced ECMH
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA) Gibco 15040066
DPBS Gibco 14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium) Gibco 10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) Gibco 12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) Lonza BW04-743Q
Y-27632 Tocris 12-541-0 (1254)
CryoStor CS10 BioLife Solutions 210102 cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial Corning 430487
Mr. Frosty (freezing container) Nalgene 5100-0001 freezing container
Normocin Invivogen ant-nr-2 antimicrobial reagent
Name Company Catalog Number Comments
Other Equipment
Pipet-aid Drummond 4-000-101
12-well culture plate Corning CLS3516 Used during differentiation.
T75 flask Corning 430641 Used during RPE maturation.
6-well culture plate Corning CLS3513 Used during RPE maturation.
cell scraper Corning 08-771-1A Used during passages.
cell strainer Falcon 352340 Used during passages before cell count.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85, (3), 845-881 (2005).
  2. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33, (8), 2363-2373 (2015).
  3. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32, (5), 261-271 (2016).
  4. Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2, (5), 384-393 (2013).
  5. Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
  6. Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, (2), 1002-1013 (2015).
  7. Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4, (2), 165-177 (2015).
  8. Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32, (5), 317-330 (2016).
  9. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  10. Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4, (5), 662-673 (2009).
  11. Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6, (2), 490-501 (2017).
  12. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (35), 10950-10955 (2015).
  13. Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3, (11), 1295-1304 (2014).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
  15. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  17. Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200, (Pt 3), 225-232 (2002).
  18. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  19. Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3, (9), 1066-1078 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics