Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nielsen, S. S., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu iletişim kuralının amacı ve ekimi pBECs ve vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modelleri pBECs mono-kültür (MC), MC astrocyte şartına orta (ACM), ile temel kurmak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar ve ortak kültür (NCC) astrocytes, domuz ile temas ya da sıçan kökenli. pBECs izole ve parçaları kapiller beyin cortices aile içi domuz 5-6 aylık üzerinden kültürlü. Bu parçaları dikkatli çıkarılması meninkslerde, yalıtım ve gri madde, filtrasyon, Enzimatik sindirim ve Santrifüjü homojenizasyon tarafından saf. Daha fazla bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için kapiller parçaları ile puromisindir içeren kültürlü orta. % 60-95 birleşmesi, kapiller parçalardan büyüyen pBECs için pasajlı zaman geçirgen membran filtre ekler ve modellerinde kurdu. Bariyer gerginlik ve pBECs BBB karakteristik fenotip artırmak için hücreleri aşağıdaki farklılaşma faktörler ile tedavi edildi: membran permeant 8-CPT-kampı (burada kısaltılmış kampı), hidrokortizon ve bir fosfodiesteraz inhibitörü, RO-20-1724 (RO). Yordamı bir 9-11 gün boyunca yürütülen ve NCC modeli oluşturulurken, astrocytes 2-8 hafta önceden kültürlü. Bağlılık protokolündeki açıklanan yordamlara endotel katmanları kurulması son derece kısıtlı paracellular geçirgenliği ile izin verdi, bir ortalama transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) 1249 ± 80 Ω cm gösterilen NCC ile model 2ve paracellular geçirgenliği (Papp) için Lucifer sarı, 0.90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sn-1 (± SEM, yani n = 55). Daha fazla bu pBEC fenotip değerlendirilmesi gösterdi sıkı bileske proteinler claudin 5, iyi ifade ZO-1, occludin ve adherens junction protein p120 catenin. Sunulan model bir dizi sağlık ve hastalığında BBB çalışmaları için kullanılabilir ve çok kısıtlayıcı paracellular geçirgenliği ile bu model taşıma ve hücre içi kaçakçılığı çalışmalar için uygundur.

Introduction

Hücresel yapısı ve fonksiyonu kan - beyin bariyerini

Dolaşım ve merkezi sinir sistemi (MSS) arayüzü BBB CNS microenvironment kontrolünü homoeostatic için anahtar bir düzenleyici site düzgün ve sinir sisteminin korunması için gerekli olan görevi görür. BBB kan damarı Lümen astar endotel hücreleri sitedir. Beyin kılcal, endotel hücreleri karmaşık hücreler arası sıkı kavşaklar oluşturmak ve belirli akını ve sızma taşıyıcılar güçlü polarize ifade şekillerinin çok özel moleküler taşıma kan ve beyin 1arasında olun. Sıkı bağlantı kompleksleri yapısal bileşenlerini aile occludin ve claudin, zonula occludens (ZO) proteinler, cingulin protein içerir ve bileske adezyon molekülleri (sıkışmaları) ilişkili. Claudin 5 paracellular bileske sınırlama içinde özellikle önemlidir. İndüksiyon ve bu karakteristik BBB endotel fenotip Bakımı dahil ile çevredeki hücreleri, perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve Bodrum membranlar, hangi beyin endotel ile birlikte form hücreleri de dahil olmak üzere dinamik etkileşimler nörovasküler birim (NVU)2,3. Bu etkileşimler dahil mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılmış değil, ancak exchange BBB geçirgenliği modülasyon kısa vadede sağlar ve uzun vadeli BBB özellikleri4indükler hücreleri arasındaki kimyasal sinyallerin içerir. Astrocytes özellikle beyin endotel hücre fenotip için katkıda bulunmak için bilinen ve düzenleyici faktörler gliyal kaynaklı Nörotrofik faktör (hücre içi kampı etkileyen)5, temel fibroblast büyüme faktörü6gibi bir kaynaktır, hidrokortizon7ve dönüştürme büyüme faktörü β (TGF-β)8. TGF-β, etkisini ancak, tartışılan9olmuştur.

Vivo Vitro BBB

İn vivo çalışmalar BBB Biyoloji değerli bilgiler vermeye devam ediyor. Ancak, hücre kültür modelleri ek anlayışlar sağlamak ve sağlık ve hastalığında BBB detaylı moleküler ve fonksiyonel yönlerini anlamak için yararlı araçlar oluşturur. Hücre tipleri ve BBB bileşenlerinin arasındaki karmaşık etkileşimler vitro modellerinde tam olarak ulaşmak zor olsa da, ortada, beyin endotel hücrelerinin ilk arıtma ve uygulama mono-kültür içinde bu yana 10 , 11 , 12, arıtma işlemleri ve BBB koşullarının büyüme kapsamlı geliştirme kültür modelleri, in vivo bariyer büyük benzerlik sonuçlanan cep. Yaygın olarak kullanılan vitro BBB modelleri kemirgen, domuz ve sığır kökenli Primer hücre ve ölümsüzleştirdi hücre satırlarını temel alır. Her model farklı avantajları ve dezavantajları vardır. Karşılaştırma ve model seçimi için doğrulama işaretleri ifade BBB enzimler, ışınlayıcılar, reseptörleri ve yapısal proteinler gibi geçerli kurulan modelleri1, genel bakış, oluşturmak için kullanılır.

Amaç iletişim kuralı

Önemli özelliklerinden biri: BBB bariyer gerginlik ve yüksek AYLARININ henüz çok sayıda mevcut modelleri de vivo içinde düzeylerini yansıtmak değil. Birkaç laboratuar geliştirme ve en iyi duruma getirme katkılarıyla bir araya getiren, bu iletişim kuralının amacı İlköğretim ile birincil pBECs MC ile ya da ezelî ACM veya NCC temel yüksek AYLARININ vitro BBB modeli oluşturmak için bir yöntem sunmaktır astrocytes fare veya domuz kökenli. Modelinin kurulması ve uygulanan yordamlar çabaları bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için ve pBECs farklılaşma BBB fenotip içine geliştirmek için içerir. Bu eser güvenilir, yüksek AYLARININ modelleri işyerinde düşük paracellular geçirgenliği ve anahtar sıkı bileske proteinler, taşıyıcılar ve reseptörleri iyi işlev ifadesi ile sonuçlandı. Ancak, üç farklı koşul kültürünün astrocytes beyin endotel hücre fenotip bir faktör olarak, üç farklı fenotipleri beyin endotel hücrelerinin temsil eder. NCC modeli nerede BBB özellikleri maksimal ifade, özellikle bazı özel mekanizmalar ilaç bulma, taşıma çalışmaları ve hücre içi kaçakçılığı, ilgili çalışmaların yanı sıra hücre-hücre etkileşimlerin incelenmesi için yararlıdır avantajlı.

Kökeni ve geçmişi iletişim kuralı

Burada açıklanan pBEC modeli Dr. Louise Morgan ve meslektaşları, hangisinin bir başarılı önceki sığır beyin endotel hücre modeli13tarihinde dayalı tarafından büyük ölçüde (Londra) Eisai laboratuarlarında geliştirilen domuz modeli dayanır. Hücre hazırlık özgün yöntem saflık geliştirmek için subculturing bir adım gelir yüzdeki yakalamak için bir iki aşamalı filtreleme naylon kullanarak kafesleri oldu. Yöntemi önceki gelişiminde en uygun BBB fenotip ve bariyer gerginlik desteklenmiştir orta ACM dahil olmak üzere, büyüme elde edildi. Yöntemine yapılan diğer değişiklikler R. Skinner tarafından Prof N. Rothwell'ın Manchester UK14,15laboratuarında yapılmış. Yöntem Abbott laboratuarı, KCL Londra, nerede Patabendige önemli ölçüde astrocytes veya ACM kullanımı kaçınarak ve puromisindir ile perisitlerden gibi bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırarak hazırlamak basit yapılmış tarafından kabul edilmiştir. MC model birkaç önemli şekil-in vivo BBB, etkili sıkı kavşaklar, membran taşıma sistemleri ve reseptör aracılı transcytosis16,17 gibi korunmuş ilk kağıtları doğruladı , 18 , 19 , 20. daha sonra S. Yusof tekrar test astrocyte ortak kültür ve bu belirgin bir biçimde iyileştirilmiş AYLARININ, yani bu şu anda Abbott laboratuarı21' kullanılan tercih edilen varyant bulundu. Model başarıyla oldu M. Nielsen transfer başka değişiklikler nerelerdeydin Aarhus, laboratuarda (Bu iletişim kuralı) tanıttı, ayıklama, tek bir kafes filtrasyon adım ve bir tek filtre kaplama adım kullanarak kolaylaştırmaya gri de dahil olmak üzere önemli kollajen ve fibronektin birleştirerek. Domuz astrocytes (Bu iletişim kuralı) yalıtım için uygulanan prosedür Thomsen ve ark22tarafından açıklanan Aalborg, T. Moos laboratuvarda tarafından geliştirilen iletişim kuralları dayanıyordu. AYLARININ ve Londra ve Aarhus içinde oluşturulan modeli diğer özelliklerini hangi model labs arasında kolayca aktarılır ve iyi dikkatli gözlem ve rasyonalizasyon yöntemi adımlardan yanıt kavramına güven ödünç benzerdir. Nitekim, S. Yusof şimdi yerel koşullara ve doku kaynakları için daha fazla ayarlama dahil bir tropik ülke (Malezya) yılında23, MC model kurmuştur.

Avantajları alternatif yöntemler üzerinde ve şu anda modelleri kurulan

Sığır ve kemirgen kökenli beyin endotel hücrelerine kıyasla, pBECs yalıtım24takip vivo BBB fenotip kaybı daha düşük bir oranı sahip olmanın avantajı sağlar. Ayrıca, pBECs MC (800 Ω cm2)16 monolayers bEND.5 ve bEND.3 (50 Ω cm2) gibi hücre hatları için yaygın olarak bildirilen düzeyleri ile karşılaştırıldığında bile yetiştirilen nispeten sıkı endotel engelleri, şekillendirme yeteneğine 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30ve cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32ve birincil beyin fare (100-300 Ω cm2) endotel hücreleriSS = "xref" > 33,34,35,36 ve fare (100-300 Ω cm2)37,38. Bununla birlikte, AYLARININ bağımlılık üzerinde arıtma ve kültür yordamlar göstermektedir. Çoğu durumda, ACM eklenmesi veya astrocytes ile ortak kültür endotel Katmanlar1gerginlik endotel hücreleri ve artış ayırt edici etkileri gösterir. Yine de, çabaları ile kodlamayla koşulları en iyi duruma getirmek için sadece sığır tabanlı modeller AYLARININ değerleri domuz tabanlı modeller (800 Ω cm2 ' MC, en çok astrocyte ortak kültür 2500 Ω cm2 Ortalamalar) karşılaştırılabilir göstermiştir13 ,39,40,41,42,43,44,45. Birincil sığır beyin üzerine alan modelleri olarak endotel hücreleri büyük varyasyon, laboratuvarlar14,45,46,47,48içinde ve arasında göstermiştir, tekrarlanabilirlik bir sorun olabilir. Rapor burada pBEC modelinde katkıda bulunan laboratuvarlar çok benzer AYLARININ ve paracellular geçirgenlik değerleri düşük değişkenliği hem de laboratuvarlar arasında ile elde ettik. Bu nedenle, burada sunulan yöntemiyle düşük değişkenliği ile güçlü bir modeli kurmak diğer laboratuarlar için mümkün olmalıdır. Sıkı endotel Katmanlar oluşturan ek olarak, pBECs modelleriyle daha önce ifade ve sıkı kavşak proteinler, fonksiyonel BBB taşıyıcılar, reseptörleri ve enzimler, gösterdiği için uygunluğunu test bir dizi çalışmalar15 tarafından doğrulanmış , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Ayrıca, yayınlanmamış transcriptome veri pBECs ortak kültürü üzerinde BBB taşıyıcılar ve reseptörleri (yayınlanmamış sonuçları, Nielsen vd.) beklenen bir profili gösterir.

Domuz tabanlı BBB modeli daha fazla avantajı vardır genom, anatomi, Fizyoloji ve hastalık ilerleme domuz yansıtmak olumlu olan60, özellikleri için kurulan diğer modellere kıyasla daha yüksek bir dereceye insan biyolojisi ilaç endüstrisi. Domuz beyin et endüstrisi ortak bir yan ürün olduğu için onlar deneyler için gerekli ve bir domuz beyin üzerinden yüksek arıtma verimi sağlayan hayvanlar sayısını en aza indirme endotel hücreleri, beyin kolayca erişilebilir bir kaynak oluşturmaktadır. Arıtma ve Primer hücre tarımı biraz zaman alıcı ve model kurma standardizasyon uzmanlık gerektirir rağmen Primer hücre en güvenilir BBB modelleri oluşturma. Bariyer gerginlik, ışınlama ifade profilleri ve microenvironment yönetmelik deneysel bulgular vivo içinde61, yansıtmıyor gibi ölümsüzleştirdi hücre hatları yerine, önemli özellikler olarak olamaz 62. vitro modeller canlı hücre daha yüksek çözünürlükte görüntüleme, görselleştirme hücre içi süreçlerin bir yakın yaklaşım kullanarak hedefleri örneklenen veya gözlenen hücrelere izin vererek mümkün hale avantajı sağlamak yüksek büyütme ile daha iyi optik kalitesi63. İki fotonlu mikroskobu yaşayan hayvanlarda kullanımı böyle değildir. Ayrıca, vitro modelleri hücreleri, görselleştirme tagged proteinlerin ve onların ticareti soruşturma izin transfect olanağı sağlar.

Uygulama modeli

BBB işlevi sabit değildir ve dinamik olarak fizyolojisi ve patoloji modülasyonlu. Nörodejeneratif, dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda enflamatuar ve bulaşıcı hastalıklar, bozulma ve BBB geçirgenliği artmıştır gözlenen64,65,66,67 . Azaltmak ve hastalık ilerleme ve sonraki zarar önlemek için kimlik ve BBB modülasyon temel moleküler mekanizmaları karakterizasyonu büyük önemi vardır. Bu bağlamda güvenilir vitro modelleri ilaç endüstrisi tarafından yüksek talep ve ayrıca MSS ilaçlara geçirgenliği BBB öngörmede önemli rol oynarlar. Geçirgenliği ekran hizmet veren herhangi bir vitro model bir kısıtlayıcı paracellular yol, bir fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi ve ışınlama mekanizmaları68fonksiyonel ifade görüntülenmelidir. Önceki çalışmalar16,17,57ve paracellular geçirgenliği ve ifade burada TJ ve AJ proteinlerin gösterdi, sunulan model bu kriterleri karşılayan ve BBB bir aralığı için uygundur çalışmalar her iki normal Fizyoloji ve patoloji. Sunulan arıtma ve ekimi yönteminin güçlü basitlik birleşimini içerir ve tekrarlanabilirlik ve yetenek astrositik dahil bir elde edilen sağlam ve güvenilir yüksek AYLARININ vitro BBB modeli ile etkiler. Bunun amacı, astrocytes, domuz ve sıçan kökenli pBECs benzer bir şekilde22BBB fenotip artırmak için gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

domuz beyin Danimarka gıda sanayi yan elde. Danimarka mezbahalarda çoğu sıkı denetim ve Danimarka Çevre Bakanlığı ve gıda gözlem altında.

astrocytes yalıtımı için kullanılan fare yetiştirilen ve grup-bir ortam sıcaklığı 22 ° C - 23 ° c ve üzerinde 12/12 h karanlık/ışık siklet muayene veteriner ve Danca göre altında yerel hayvan tesiste yer alan laboratuar hayvanları Yönetmeliği. Etik kullanımı hayvanlar (Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi 24 Kasım 1986; 86/609/EEC) ile ilgili uluslararası kurallara ve Danimarka yönergelere uygun olarak kurban edildi önce fareler euthanized. Hayvan veya insan malzeme üzerinde hiçbir in vivo deneyler bu deneylerde kullanılan.

Not: (Adım 1) arıtma, (Adım 2) ekimi ve (Adım 3) AYLARININ ölçümleri açıklayan bir pBEC ana protokol aşağıdadır. NCC astrocytes ile kurulum için arıtma ve fare ve domuz astrocytes ekimi açıklayan bir alternatif protokolünü (Adım 4) sundu.

1. domuz beyin kılcal arıtma

  1. 5-6-aylık yurt içi domuz (örneğin yakındaki bir mezbaha üzerinden) 8-10 beyin toplamak ve onları buz laboratuvar taşıma. Biz 2-3 h hayvan fesih içinde aşağıdaki arıtma yordama başlamadan öneririz.
  2. Bir steril akışı Bank beyinlerinde yerleştirin ve nazikçe 1 L PBS buz üzerinde yerleştirilen bir ölçek ile yıkayın
  3. Dikkatle ve meninkslerde ücretsiz beyin için başka bir 1 L kabı buz üzerinde yerleştirilen PBS ile transfer meninkslerde bir beyin ince uçlu forseps kullanarak bir defada çıkarın. Geçen süre uzanan kaldırma karmaşık hale getirebilir. Her beyin için kullanılan yaklaşık süresi 10-15 dk. olmalıdır
  4. Bir neşter kullanarak, bir anda kazımak gri cevherde--dan bir beyin kapalı ve Petri içeren 20 mL DMEM besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) buz üzerinde yerleştirilen yemekleri (8,8 cm 2) izole malzeme transfer. Mümkün olduğunca çok gri madde olarak beyaz madde malzeme çekme olmadan yalıtmak. İlk parçalanma için gri madde malzeme iğne olmadan bir 50 mL şırınga aracılığıyla çalıştırın. Devam etmek için tüm beyin ve toplanan gri madde malzeme Havuzu. Geçen süre uzanan kaldırma karmaşık hale getirebilir. Her beyin için kullanılan yaklaşık süresi 10-15 dk. olmalıdır
  5. DMEM/F-12 medya ile 50/50 oranında bir el doku homogenizer değirmeni tüp izole gri madde malzeme transfer edin. Malzeme sıkı bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş ardından gevşek bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş yaparak lunaparkçı. Tüm kadar izole malzeme homojenize devam, sonra homogenate 500 mL şişe aktarmak ve DMEM/F-12 ile yaklaşık 450 mL Toplam hacim sulandırmak.
  6. 500 mL mavi-cap şişeyle filtre tutucu ve 140 µm filtre-kafes kullanarak homogenate filtre ve filtre üzerinden doku çalıştırarak kılcal yalıtır. Homogenate 50 mL başına bir filtre kullanın ve daha sonra her filtre DMEM/F-12 ile yıkayın.
  7. Yer kılcal içeren filtreler Petri yemeklerinde tripsin/EDTA (% 2.5 Tripsin, PBS 0.1 nM EDTA), sindirim çözeltisi ile collagenase CLS2 (2.000 U/mL) ve Dnaz 1 (3.400 U/mL) DMEM/F-12. 1 Petri kabına (8,8 cm 2, 20 mL solüsyon) 3 filtre kafesleri kullanın.
  8. 180 RPM bir orbital Çalkalayıcı 1 h için 37 ° C'de Petri yemekler yerleştirin veya bunları her 10 min hafifçe karıştırın. Filtrelerden kılcal süspansiyon Petri kabına 1 mL pipet kullanarak üzerinden kapalı 1 saat sonra yıkayın.
  9. Süspansiyon 3 yemeklerin 2 50 mL tüpler içine split ve hazım her 50 mL tüp 10 mL DMEM/F-12 ekleyerek durdurmak.
  10. Santrifüj hücre süspansiyonlar 5 dakika süreyle 250 x g, 4 ° C de supernatants Aspire edin ve her Pelet 10 mL DMEM/F-12 yeniden askıya alma. DMEM/F12 bir başka 20 mL her tüp için ekleyin. Bu santrifüj iki kez tekrarlayın.
  11. Tüpler on Ice 5 min için serin aşağı ve çözümleri 2 yeni 50 mL tüpler için transfer edelim.
  12. Hücre-süspansiyonlar 250 x g, 4 ° C de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve 8-10 ml (yaklaşık 1 mL/kullanılan beyin) her Pelet donma çözüm % 10 DMSO FBS içinde oluşan yeniden askıya alma.
  13. Cryovials, cryovial başına 1 mL kullanarak hücre süspansiyon aktarın. Ortalama, ortalama 12-16 ekler için endotel hücreleri sağlayan kullanılan, beyin başına 1 flakon bir arıtma sonuçlanır. Şişeleri-80 ° c en az 4 gece kadar s için dondurucu bir kutuya koyun. Daha sonra cryovials bir cryotank sıvı azot ile saklayın.
    Dikkat: Son derece düşük sıcaklıklarda sıvı nitrojen var. Lütfen uygun koruma giymek.

2. Birincil pBECs (8-10 gün) ekimi

  1. İlk kültür (3-5 gün)
    gün 1
    1. pBECs, ekin için koşulları optimize etmek için bir çözüm ile sonda gelen ekleyerek bir T75 şişesi kaplama gerçekleştirin kollajen IV konsantrasyonları (150 µg/mL) ve fibronektin (50 µg/mL) GKD 2 O çözüm tüm yüzey kapsar emin şişesi için. 10 mL her T75 şişesi için kullanın. 2 h. için 37 ° C'de kuluçkaya
      Not: Kaplama olabilir sadece kullanmadan önce veya bir hafta önce gerçekleştirilen ve PBS ile 4 ° C'de depolanan Kaplama kurumasına gerekir veya artık uygun bir ek ve büyüme yüzey oluşturacak.
    2. DMEM/F-12 oluşan
    3. hazırlamak 16 mL pBEC büyüme orta % 10 plazma elde edilen serum (PDS), penisilin (100 U/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve heparin (15 U/mL) ile desteklenmiştir. Endotel hücreleri seçmek için puromisindir (4 µg/mL) ile orta ek. Puromisindir tedavi sadece en fazla 5 gün için kullanılabilir unutmayın.
    4. Aliquot 6 mL ve 10 mL cilt olarak iki 15 mL tüpler içine hazırlanmış orta.
    5. Kılcal damarlar ile bir şişe sıvı azot (Adım 1,13) getirmek ve 37 ° C su banyosu kullanımı veya hazır orta 750 µL 6 mL aliquot ekleyerek kılcal çözülme. Orta ekleyerek çözme varsa, dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı çözülme ve süspansiyon homojenize pipet. Çözdürülen, hücre süspansiyon aliquot 6 mL ortamına transfer.
    6. Spin aşağı kılcal 250 x g, 7 dk. 4 ° C, dondurucu orta, kaldırmak için
    7. Dikkatle süpernatant Aspire edin ve Pelet 1-2 mL 10 mL aliquot yeniden askıya alma. Ne zaman yeniden askıya, çözüm 10 mL orta aliquot transfer.
    8. Kılcal süspansiyon kaplı T75 şişeye aktarmak ve hafifçe Eğimli yüzey üzerinde eşit dağıtım sağlamak için cep şişesi. 37 ° C, % 5 CO 2 T75 şişeyi yerleştirin.
      2. gün
    9. Gecede kuluçka sonra 10 mL pBEC büyüme orta puromisindir (4 µg/mL) için bir T75 şişesi ile takıma hazırlamak ve orta bir değişiklik yapmak. Hücrelerine uygulanan tüm Orta çözümleri kullanmadan önce 37 ° C için Önceden ısıtılmış olmalıdır unutmayın.
      Not: Alternatif olarak, kılcal yüzeye bağlı gerçekleştirilen 4-6 h sonrası kaplama orta değiştirmek olabilir. Genellikle 3-5 gün çözdürme üzerinden % 60-95 izdiham elde kadar hücreleri kuluçkaya. Yapmak değil izin verilsindurdurmak temas inhibisyonu önlemek için % 100 izdiham ulaşmak için w hücreleri daha fazla hücre büyüme.
      Gün 4-6
    10. Ne zaman istenilen confluency elde
    11. geçiş endotel hücreleri geçirgen membran ekler (2.2 bölümüne bakın). İstenen confluency 4 günde elde değil, orta değişiklik yapılır. En geç 6 gününde hücreleri geçirgen membran ekler için passaged. Eğer gerekli confluency gün 6 tarafından elde değil, hücreleri deneysel kullanım için uygun değildir.
      Not: astrocytes NCC için hazırlanması: ortak kültür modeli, 2 - ayarlarken kültür (bakınız Bölüm 4) 8 haftalık astrocytes için ortak kültür model ekler endotel hücrelere passaging önce gün bir orta değiştirmek gerçekleştirerek hazırlanmalıdır. Her astrocyte hazırlamak için 1500 µL astrocyte büyüme orta düşük glikoz %10 FBS, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 µg/mL) ile desteklenmiş DMEM oluşan ve orta değiştirmek gerçekleştirin.
  2. PBECs geçirgen membran ekler (5 gün) üzerinde büyüme
    gün 4-6
    1. hazırla geçirgen membran için (1.12 cm 2 yüzey alanı, 0.4 µm gözenekleri ekler ile 12-şey plaka) ekler kaplama ile kollajen IV tarafından pBEC tohum (500 µg/mL) ve eklemek ve çözüm tüm büyüyen yüzey kapsadığından emin olun fibronektin (100 µg/mL) GKD 2 O. kullanımı yaklaşık 300 µL her biri için. 37 ° c, % 5 CO 2 en az 2 h kuluçkaya
    2. 30 mL pBEC büyüme ortamının hazırlamak (medya kompozisyon için 2.1.2 bölümüne bakınız) olmadan puromisindir.
    3. Orta T75 şişeye pBEC kültüründen ve yavaşça oda sıcaklığında 5 mL steril PBS ile iki kez yıkama Aspire edin.
    4. 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 2.5 Tripsin, PBS 0.1 nM EDTA) T75 için ekleyerek hücreleri trypsinize ve 37 ° c, % 5 CO 2 5-7 dakika süreyle şişeye koyun
    5. Beyin endotel hücreleri, ayırmak için hafifçe parmak eninde sonunda hayatta kalan ve daha güçlü ekleme perisitlerden Balonun yüzeyinde bırakarak ile T75 şişeye tarafına dokunun. Görsel olarak dekolmanı mikroskop altında incelemek. % 80 dekolmanı görülmektedir, trypsinization 5 mL orta de ekleyerek durdurur.
    6. Hücre çözümü 15 mL tüp 10 mL pipet ve spin beyin endotel hücreleri aşağı vasıl 250 x g, 4 ° C için 1 dakika aralıklarla tarafından kullanarak transfer.
    7. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL ortamda resuspend. Askıya zaman, Toplam hacim için 3 mL getirmek için orta bir daha fazla 2 mL ekleyin
    8. odası veya otomatik bir hücre sistemi sayma sayım bir hücre kullanımı ile hücre elle saymak. 2.2 x 1.1 x 10 5 hücreleri/INSERT son tohum yoğunluğu sonuçlanan 10 5 hücre/mL Orta hücre çözeltisi hazırlamak.
    9. Ve hücre süspansiyon 500 µL her Ekle'nin üzerine transfer kaplama çözüm gelen geçirgen membran ekler çıkarın. Ekler teke tek orta ekleyip olarak bu Ekle kullanabilirsiniz bir ' yalnızca filtre ' AYLARININ ölçümleri için denetimi.
    10. Kurmak endotel hücreleri MC, MC ACM ile veya NCC astrocytes ile şu şekilde:
      1. için MC: pBEC büyüme orta/ACM 12-şey plaka geçirgen membran ekler altında kuyu başı 1500 eklemek µL. 37 ° C, % 5 CO 2 geçirgen membran ekler yerleştirin ve 2 gün kuluçkaya.
      2. İçin KKK: Transfer astrocytes astrocyte büyüme orta ile yenilenmiş Wells'le için önceki gün ekler. 37 ° C, % 5 CO 2 geçirgen membran ekler yerleştirin ve 2 gün kuluçkaya.
        Not: alt Wells farklı ortam türleri üç model kullanımı unutmayın.
        Gün 6-8
    11. 2 günde, geçirgen membran ekler pBECs ile medyada değiştirmek. PBEC büyüme orta Ekle başına 500 µL hazırlamak ve dikkatli bir şekilde hücre tabakasının kesintileri en aza indirmek için değişiklik yapmak. Hücreleri iki gün kuluçkaya. Medya Değiştir sadece ekler ve değil alt wells gerçekleştirilen unutmayın.
  3. Stimülasyon farklılaşma faktörler (1-2 gün) ile
    gün 8-10
    1. her biri farklı modelleri için ardından olarak uyarılması ortam hazırlanmalıdır:
      1. için MC: her biri için takın ve pBEC büyüme ortamının kampı (250 µM), hidrokortizon içeren 500 µL hazırlamak (550 nM) ve RO (17,5 µM).
        MC: Ayrıca 1500 µL kampı (250 µM), hidrokortizon içeren pBEC büyüme ortamının hazırlamak (550 nM) ve RO (17,5 µM).
        MC ACM ile: çözülme 1500 µL ACM ve ile kamp (250 µM), hidrokortizon ek (550 nM) ve RO (17,5 µM).
      2. İçin KKK: her INSERT, pBEC büyüme ortamının kampı (250 µM), hidrokortizon içeren 500 µL hazırlamak (550 nM) ve RO (17,5 µM). Her astrocyte için iyi, 1500 µL DMEM/F-takıma penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 µg/mL), heparin (15 U/mL), kamp ile 12 (250 µM), hidrokortizon hazırlamak (550 nM) ve RO (17,5 µM).
    2. Her biri farklı modelleri için ortam değişimi aşağıdaki gibi yapın:
      1. için MC: dikkatle Aspire orta kuyu ve ekler ve her ekleme için 500 µL kullanarak her iki bölmeleri, farklılaşma orta eklemek ve Her şey için 1500 µL. İki tarafında bozulma eklemek etkiler ve hücre katmanı bozabilir unutmayın.
      2. İçin KKK: dikkatle Aspire orta kuyulardan ve 750 µL farklılaşma orta iyi başına ekleyin. Dikkatle ekler ortamından Aspire edin ve 500 µL farklılaşma orta Ekle başına ekleyin. Sonra her astrocyte iyi kalan 750 µL farklılaşma orta ekleyin.
    3. Tüm modeller için: 37 ° C, % 5 CO 2 hücreleri yerleştirmek ve farklılaşma orta ile ertesi güne kadar kuluçkaya.
      Not: astrocytes ile NCC için serum serbest ortamda muhafaza bu noktadan astrocytes olduğunu unutmayın.

3. AYLARININ ölçümleri

  1. gün ayırt etme orta, uyarıcı hücrelerle hazırladıktan sonra doku direnci ölçüm odası sistemi AYLARININ ölçülerini odası durulama tarafından iki kez GKD 2 O, bir kez % 70 ile alkol 5 min için ve 2 kez daha GKD 2 O.
  2. DMEM/F-12 4 mL doku direnci ölçüm odasına ekleyin, sisteme bağlayın ve yaklaşık 30 dakika başı olarak aşağıdaki ayarları için kalibre: R = 0, Test R = 1000, modu R. =
  3. Dikkatle doku direnci ölçüm odasında ekler yerleştirerek AYLARININ ölçümleri gerçekleştirmek. Her ekleme için ölçümleri nüsha gerçekleştirmek ve ortalama Ω cm 2 hesaplar.
    Not: ortak kültür modeli için AYLARININ değerleri ulaşmak için beklenen > 500 Ω cm 2. Uygun AYLARININ düzey ölçme AYLARININ ilk gününde ulaşmak değil, yeni farklılaşma faktörler ekleyerek (cAMP (250 µM), hidrokortizon (550 nM) ve RO (17,5 µM)) ve ertesi gün tekrar AYLARININ ölçmek. Ne zaman uygun düzeyleri elde model planlanan deneme için hazır olmalıdır. Hücreleri AYLARININ ölçümleri sonra kurtarmak için deneme yapmadan önce en az 3 h için dinlenme gerekir unutmayın. Stimülasyon sonra AYLARININ değerleri genel stimülasyon sonra 24-48 h için kabul edilebilir kalır.
    Not: Bu model 81 yüksek AYLARININ da katı STX - 100 C elektrot çiftini kullanarak bir alternatif ve daha hızlı yöntemi kaydeder. Esnek STX2 electrode çift verir daha az güvenilir okumalar.

4. TEMASSIZ ortak kültürü için hazırlık OF ASTROCYTES: Alternatif bir yöntem

  1. Astrocytes arıtma
    1. her fare için beyin kullanılan, kat 2 T75 şişeler Poli-L-lizin (5 µg/mL) 10 mL GKD 2 içinde O her birine ekleyerek T75 şişesi. 30 dakika süreyle 37 ° C'de şişeler kuluçkaya
    2. Yalıtım astrocytes, aşağıdaki gibi yapılır:
      1. sıçan astrocytes:
        1. Decapitate 2 1 - 2 gün eski fareler onaylanmış bir yöntem kullanarak.
        2. Boyun burun doğru başlayarak kafatası derisini kesilmiş ve sagittal bir kesi ile kemik kesti.
        3. Kafatası eğri Forseps ile açın, beynini alıp DMEM düşük glikoz % 10 FBS ve viomisin sülfat ile (125 µg/mL) takıma 11 mL ile 15 mL tüp (tüp 1) yerleştirin.
        4. Dikkatli bir şekilde ince uçlu forseps kullanarak meninkslerde kaldırmak ve 1 mL pipet kullanarak beyin malzeme askıya alma.
      2. Domuz astrocytes:
        1. 5-6-aylık yurt içi domuz beyinden almak 1.
        2. Dikkatli bir şekilde meninkslerde beyin ince uçlu forseps ve/veya ellerini kullanarak çıkarın.
        3. Toplamak 4 g gri beyinden önemi ve 1-2 mL DMEM düşük glikoz % 10 FBS ve viomisin sülfat (125 µg/mL) bir petri içinde ile takıma parçaları yer. Parçalar büyükse, neşter ya da Forseps ile kıyma.
        4. Askıya 1 mL pipet kullanarak izole malzeme taşımak bu 15 mL tüp (tüp 1) ve dolgu ile % 10 FBS ve viomisin sülfat (125 µg/mL) 11 mL toplam hacmiyle takıma DMEM düşük glikoz ile.
        5. 10 mL şırınga bağlı uzun iğne ile izole malzeme homojenizasyon devam etmek ve yukarı ve aşağı 3 kez askıya alma. Büyük parçaları tüp alt kısmında yerleşmiş kadar bekleyin, sonra tüp (tüp 1) tepesinden 7 mL orta toplamak.
        6. 7-mL hücre süspansiyon 40 µm naylon filtre ile filtre yeni 50 mL tüp içine (tüp 2).
        7. 1 beyin ile boru için
        8. eklemek 7 mL orta. Filtre uygulanan hücre süspansiyon tüp 2 hacmi yaklaşık 35 mL kadar homojenizasyon ve filtrasyon adımları 4.1.2.2.5-6 üzerinden devam.
    3. T75 şişeler [Adım 4.1.1] kaplama çözüm kaldırın. 5 mL kuluçka Poli-L-lizin ile hücreleri kaplama çözüm herhangi bir toksik etkisi tarafından zarar değil emin olmak için kullanılan sonra PBS ile hızlı bir çamaşır.
    4. Bölmek ve izole astrocyte çözüm T75 şişeler arasında eşit olarak tohum. Şişeler 37 ° c, % 5 CO 2 3-5 gün kuluçkaya.
  2. Astrocytes kültür ve hazırlama KKK endotel hücreleri (3 hafta) ile
    1. İlk kültür
      1. , kuluçka 3-5 gün sonra dikkatli bir şekilde orta alıyorum ve 10 mL ekleyerek orta bir değişiklik yapmak DMEM düşük glikoz % 10 FBS ve viomisin sülfat ile (125 µg/mL) desteklenmiştir.
        Not: ilk orta değiştirmek sonra orta her 5 günde değiştirilmelidir. İlk 2 hafta boyunca şişeler sallamak ve orta değiştirirken hücreleri PBS ile iyice yıkayın. Bu bulaşıcı microglia kaldırılmasına yardımcı olur.
      2. Ekimi, 3 hafta sonra 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi her T75 şişesi sonuna ekleyerek hücreleri trypsinize ve onları 37 ° c, % 5 CO 2 5-7 dakika süreyle kuluçkaya
      3. Trypsinization 5 mL orta de ekleyerek durdurmak, hücre çözümü 15 mL tüp için aktarmak ve astrocytes vasıl 250 x g, 4 ° C 7 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
      4. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve % 10 DMSO FBS içinde oluşan çözüm dondurma hücreleri yeniden askıya alma.
      5. Hücreleri saymak ve hücre çözümü 4.0 10 6 hücre/mL x hazırlamak. 1 mL şişe başına ekleme cryovials hücrelerde dondurmak.
    2. Büyüme geçirgen membran ekle sistem alt Wells (2-12 hafta)
      1. 12-şey plakaları Poli-L-lizin (5 µg/mL) 1 mL GKD 2 içinde O her şey için ekleyerek astrocytes büyümesi için hazırlamak. Tabakları için 2 h. 37 ° C'de yer
      2. Her 12-şey plaka için hazırlamak astrocyte büyüme ortamının (%10 FBS ve penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 µg/mL) ile DMEM düşük glikoz) 25 mL.
      3. Astrocytes şişe sıvı azot getir ve hücrelerin 750 µL DMEM düşük glikoz orta ekleyerek çözülme. Dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı çözülme ve süspansiyon homojenize pipet. Çözdürülen zaman hücre süspansiyon 15 mL tüp nakletmek ve orta toplam hacmi 7 mL için eklemek.
        Dikkat: Sıvı azot, son derece düşük sıcaklık, bu yüzden eldiven gibi kişisel koruma giymek.
      4. Spin aşağı kılcal 250 x g, 7 dk. 4 ° C, dondurucu orta, kaldırmak için
      5. Dikkatle süpernatant Aspire edin ve orta hücrelerde yeniden askıya alma.
      6. Ve 1 mL iyi kullanarak wells için hücre süspansiyon transfer kaplama 12 iyi plakaları kuyulardan çıkarın. 37 ° c, % 5 CO 2 hücreleri kuluçkaya.
      7. Orta üçüncü hergün yenileyin ve hücreler için en az 2 hafta hücreler endotel hücreleri ile ortak kültürü için kullanmadan önce kültür. Hücreleri, 2-8 hafta olmak en uygun yaş ile çözdürme sonra 12 hafta için ortak kültürü için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BBB Vitro modelleri kurulması

Sunulmuştur, en iyi duruma getirilmiş yönteminde pBECs tarımı ve geçirgen membran Ekle sisteminin kurulması MC veya ACM veya NCC olmadan astrocytes (şekil 1) ile 9-11 gün (Şekil 2) bir süre için gerçekleştirilmiştir. Endotel hücre seçimi için saflaştırılmış kapiller parçalarının ilk bir kültür puromisindir tedavi için en fazla 5 gün, hangi en bulaşıcı hücreleri ortadan ve seklinde endotel hücrelerinden büyüme terfi ile kombine edildi kılcal damar parçaları (şekil 3A-C). Gün 4-6, pBECs gibi üst üste, büyüyen % 60-95'confluency için iletişim inhibe, boyuna hizalanmış hücreleri hızla. Hücreleri istediğiniz confluency ulaşmıştı zaman pBECs kollajen IV ve fibronektin kaplı kaplı geçirgen membran Ekle filtresi membranlar (1.12 cm2 yüzey alanı, 0.4 µm gözenekleri) 1.1 x 105 hücreleri/INSERT, yoğunluğu, hangi onlar Normalde Konfluent monolayers 4 gün sonra (8-10 yalıtım sonrası) kurdu. Ne zaman pBECs ortak kültür, fare veya domuz kökenli astrocytes Poli-L-lizin kaplı alt kuyular için en az 2 hafta NCC (şekil 3D) başlamadan önce üzerinde kaplama. NCC kurarken, 2-8 hafta boyunca kültürlü astrocytes pBECs BBB fenotip teşvik için en iyi desteği sağlamak deneyimler göstermiştir; Bu süre içinde astrocytes bir petek benzeri yapı (şekil 3E-F) düzenlenmiş hücrelerle Konfluent kültürler kurdu. Gün 4 geçirgen membran ekle sistem modeli (gün 8-10 mesaj izolasyon), hücre kampı, hidrokortizon ve RO bariyer gerginlik ve BBB karakteristik ifade deseninin taşıyıcılar, sıkı bileske proteinlerin artırmak için teşvik ve reseptörleri.

PBEC fenotip karakterizasyonu ve Paracellular geçirgenliği

AYLARININ ölçüm ile kombine görsel hücre muayene rutin confluency ve darlık deneyler önce geçirgen membran ekler üzerinde büyüyen endotel hücre tabakasının değerlendirmek için en güvenilir yolu vardır. Şekil 4 küçük molekül uyuşturucu geçirgenliği BBB yoluyla değerlendirmek için belirgin geçirgenliği21 ile (Papp, kombine (iyonik geçirgenliği yansıtan) AYLARININ denetim parametrelerini deneylerin sonuçlarını iki serisi gösterir cm s-1) radiolabeled Sükroz veya tipik küçük ilaç molekülleri paracellular geçirgenliği yansıtan boya izleyici Lucifer sarı (LY), (~ 200-600 Da). Bir bileşik ile a Papp Papp Sükroz veya LY (bağlı olarak ilaç molekül ağırlığı) daha büyük ilgi transcellular geçirgenliği ve/veya taşıma hücreler boyunca hatırlatıyoruz. Fare astrocytes, pBEC iyi toplu halde kültürlü pBECs ile eklediği geçirgen membran içinde şekil 4 gösterir (örneğin burada LY ayarla) TEERs Aralık 500-2000 Ω cm2, birkaç tane daha yüksek veya düşük oluşturacaktır. Bazı parçalar, protokol, öğrenme özellikle erken evrelerinde çevresinde alt TEERs olabilir 100-900 Ω cm2 (örneğin burada Sükroz ayarla). AYLARININ ölçüm sağlar örneğin AYLARININ başlayan filtreler, seçim > 500 Ω cm2, ve aralığı, gösterilen AYLARININ üzerinde Papp nispeten AYLARININ, bu deneyler için yeterince sıkı bariyer katman göstergesidir bağımsızdır. Geçirgenliği ölçüm için protokol çözünen/yapı türüne göre değişir. NCC küçük moleküllerin geçirgenliği ölçüm yordamı açıklaması için bir protokol Yusof, SR, et açıklanmıştır. Al21. Değerlendirme ifade NCC içinde pBECs sıçan astrocytes ile sıkı kavşak proteinlerin hücre-hücre kavşak boyunca claudin 5, occludin ve ZO-1 yerelleştirme ayirt (şekil 5A-C) tarafından gösterildiği gibi gösterdi. Ayrıca, adherens junction protein p120 catenin hücre-hücre kavşak (şekil 5 d) iyi tanımlanmış dağıtım gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: uygulanan tüp bebek BBB modellerin şematik gösterim. Geçirgen membran şematik gösterimi MC (A), MC ile ACM (B)ve astrocytes (C)ile NCC pBECs sistem modelleri ekleyin. MC pBEC büyüme orta veya ACM uygulanmıştır alt wells ise NCC ekler pBECs ile wells 2-8-hafta-yaşlı astrocytes ile yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: akış şeması pBEC yetiştirme ve sunulan modeller kurulması sırasında ana adımlardan. Bir bakış ve zaman çizelgesi yöntemi için bu şematik sunu pBECs kodlamayla prosedürü ve kuruluş sunulan modellerin Yani MC ile ya da ezelî ACM ve NCC astrocytes ile ana adımları özetlemektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: ilk pBECs ve sıçan astrocytes kültürleri temsilcisi saat ders. Faz kontrast mikroskobu görüntüler kültürler pBECs (A-C) ve astrocytes (D-F) izlendi 5 gün içinde. Kılcal damar parçaları kılcal damarlar ve bulaşıcı hücrelerin varlığı gösterdi ilk kültür ilk gününde saf (A, gün 1), hangi sonra orta değiştirmek 2 gün ve büyüme, seçim için pBECs, gösterdi, ek bir gün onların büyüme kapiller parçalardan başlayarak (B, gün 3). PBECs Konfluent monolayers genellikle gün 4-ne zaman pBECs seklinde Morfoloji gösterdi ve boyuna hizalanmış 6'da, elde edildi (C). Alt numaralı seribaşı sıçan astrocytes normalde Konfluent katmanlara 5 gün (D-F)içinde hızla kuyuları ve NCC modelleri için 2 hafta sonra büyüme kullanılmıştır. Ölçek çubuğu tüm resimler için: 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: sıkı kavşak bütünlüğünü pBECs. Belirgin geçirgenliği (Papp) pBECs için paracellular işaretleri sukroz (MW 342.5 14C-etiketli, 14,8-25,9 GBq/mmol) ve Lucifer sarı (MW 521.57, 10 µg mL-1), çizilen AYLARININ karşı. pBECs 1.12 cm2 geçirgen membran ekleme filtreleri sıçan astrocytes iyi ve apikal odasına eklendi işaretleri tabanındaki yukarıda yetiştirilmiştir. Sonra 1 saatte 37 ve #730; C, Bazal odası işaretleyicisinde görünümünü hesaplanan ölçülü ve apikal-için-Bazal Papp (x 10-6 cm sn-1) yapıldı. AYLARININ ölçülen > 3 PappSTX100C EVOM elektrotlar, kullanarak, boş geçirgen membran Ekle filtresi ile direnç 150 Ω. için ortalama AYLARININ Lucifer sarı veri kümesinin düzeltilmiş önce h oldu 1249 ± 80 Ω cm2 (± SEM, yani n = 55). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: pBECs karakterizasyonu Immunocytochemical. 1.12 cm2 geçirgen membran INSERT üzerinde yetiştirilen pBECs için filtre sıçan astrocytes 5 (B) Occludin (C) ZO-1 temel şey, sıkı bağlantı bileşenleri (A) Claudin ayirt mikroskobu analizi ekler, ve adherens junction protein (D) p120 catenin hücre-hücre kavşaklar iyi tanımlanmış yerelleştirme gösterdi ve Konfluent beyin endotel hücre katmanları seklinde, üst üste hücreleri ile ortaya çıkar. Ölçek çubuğu tüm resimler için: 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Arıtma ve hızla çoğalmak-in pBEC

Arıtma işlemi sırasında kritik adımlar meninkslerde hızlı ve etkili kaldırma ve ayırma arıtma verimi ve saflık ve model uygun kurulması için önemlidir beyaz ve gri madde içerir. PBECs kullanarak sunulan vitro BBB modeli için Biz Geliştirilmiş ve mekanik homojenizasyon izole gri madde boyutu-seçici yüzdeki, sindirim collagenase ile yalıtım için filtre uygulama dayalı bir arıtma yordam Basitleştirilmiş , Dnaz ve Tripsin, ilk bir kültür, microvessel parçacıkları ile. Genel olarak, arıtma ve Primer hücre ekimi sırasında büyük zorluklardan biri bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırılması olduğunu. Birincil beyin endotel hücrelerinin arıtma ile deneyim ayrıntılı kaldırma meninkslerde ve beyaz madde sonuçlarında saflık ve verim kapiller geliştirilmiş, hem de artan endotel hücre büyümesi ve BBB ifade belirtti özellikleri. Bu nedenle, hangi dikkatli (sulci içinde de dahil olmak üzere) meninkslerde sunulan protokolündeki kaldırma kaldırma (Bu fibroblast benzeri özelliklere sahip) leptomeningeal hücrelerinin yanı sıra Arteryel ve arterioler düz kas hücrelerinin sağlamak için tasarlanmıştır büyümeye daha hızlı kültür endotel hücreleri. Aynı şekilde, beyaz madde malzeme indirilmesi daha saf endotel hücre kültürleri, daha az bulaşıcı hücreleri izole kapiller parçalardan büyüyen ile sonuçlandı. Ancak, bu Basitleştirilmiş ve yalıtım için uygulanan hızlı yöntem izole kılcal verimini düşürür ve gri cevherde yalıtım duruma getirilmesi her beyin verimini önemli ölçüde artırabilirsiniz. Bir alternatif arıtma protokolü69' dahil, bir yoğunluk degrade ücretsiz endotel hücreleri izole ve endotel hücre saflık artırmak için kullanılabilir, ama zaman alıcı ve aynı şekilde verim düşürebilirsiniz. Bu arıtma yöntemlerin her ikisi de edilmiş yoğun kullanılan ve karakterize ve MC ve astrocyte ortak kültür (normalde 500-1500 Ω cm2)7,16', yüksek AYLARININ pBEC modelleri oluşturma özellikleri paylaşan 21,22,49,57,70,71.

Monolayers yüksek paracellular restrictiveness ile oluşturmak için deneyim perisitlerden endotel kültürler16' dan ortadan kaldırılmalıdır göstermiştir. Domuz beyin perisitlerden genellikle pBEC katmanları altında büyümeye ve delik endotel katmanlarda sıçan beyin endotel hücreleri72,73kültürleri için gözlemlediği gibi neden olmaz. Kültürler her nasıl, yapmak pBEC perisitlerden daha geniş görünür endotel hücrelerinin ve düzensiz hücre yatılı16ile morfolojisi etkiler eğilimindedir. Beyin endotel hücreleri sızma Taşıyıcılar (örneğin P-glikoprotein) yüksek düzeyde yüzdeki diğer hücre tiplerinde daha hızlı çünkü bulaşıcı hücre sayısı puromisindir tedavi74tarafından azaltılabilir. Fetal veya neonatal buzağı serum iyilik endotel hücrelerinin büyümesini türetilmiş yerine PDS trombosit-türevi büyüme faktörü ve vasküler endotelyal büyüme gibi büyüme faktörlerinin düşük yoğunluklu olduğu gibi Ayrıca, serum plazma kaynaklı (PDS) kullanın faktör, BBB geçirgenliği artırmak ve anjiogenezi14,75,76,77teşvik için gösterilir. İzole kapiller parçaları ilk kültürünü tanıtmak ve bu puromisindir tedavisi (4 µg/mL) ve PDS kullanımı ile birleştirerek, böylece bundan sonra biz olabilir büyük ölçüde bulaşıcı hücreleri arıtma sonra kalan azaltmada başarılı olduk sıkı endotel monolayers geçirgen membran ekler üzerinde kurmak. Kültür yemekleri ve geçirgen membran Ekle yüzeyler üzerinde endotel hücrelerinin en iyi ek sağlamak için bu kollajen tip IV (dan insan plasenta) ve fibronektin kaplama karışımı büyük yayılması artırır gözlenmiştir verimleri ve kombine karışım bu nedenle tercih yalnızca ben78kollajen türünü geleneksel yöntem kullanarak üzerinden.

Hücreleri ve yüksek AYLARININ Vitro BBB manken kurulması farklılaşma

Böylece ortak kültür astrocytes ile fonksiyonel sıkı kavşak inducing ve yüksek AYLARININ değerleri16,57ulaşmak için gerekli değildir MC pBECs genellikle yalıtım, takip birçok BBB temel özellikleri korur. Koşullar içine BBB fenotip endotel hücrelerinin farklılaşması için en iyi duruma getirmek için çaba serum içeren kullanımı dahil 8-CPT-kamp ile (hücre içi kamp seviyesi13artan) hidrokortizon7 takıma orta ve RO 20-1724 (hücre içi kamp düzeyde muhafaza), hangi uygun olarak önceki bulgular74,79 birlikte başarıyla bariyer gerginlik geliştirilmiş ve AYLARININ arttı ve de bir daha geri yüklemek için yardımcı vivo gen ekspresyonu gibi80profil. Ancak, endotel tabakası sıkılaştırma hidrokortizon kullanımı belirli uyaranlara ve yanıt kemoterapi ve sitokinler soruşturma sırasında inflamasyon, için model kullanma amacıyla yanıtta endotel hücrelerinin değiştirebilir hidrokortizon kullanımı kaçınılması gerekir.

Karşılaştırmalı çalışmalar ile MC MC ACM ve astrocyte ile her iki katılımcı laboratuvarlar ve başka bir yerde ortak kültürlerin, astrositik katkı endotel BBB özellikleri geliştirmek ve bariyer gerginlik artan yeteneği gösterilmiştir 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. pBECs BBB fenotip yüksek gibi ifadesi elde etmek için bir NCC astrocytes ile kurulan ve her ikisi de domuz bulundu ve sıçan birincil astrocytes faydalı, aynı zamanda diğer laboratuvarlar22görülmektedir. Astrocyte NCCs kurulması sırasında ortaya çıkan gerginlik endotel bariyer, w etkisi saflık ve yaş astrocyte kültürlerin deneyimler göstermiştir2-8 hafta, hangi zaman içinde astrocyte Morfoloji içinde gözlenen bir değişiklikle ilişkili olan varlık astrocytes en uygun yaş ith. NCC kurmadan önce günde orta değiştirmek astrocytes için zararlı metabolitleri kaldırmak ve stimülasyon ve bariyer geliştirme etkileyen sinyal faktörler serbest bırakmak astrocytes için yeterli zaman tanımak için tasarlanmıştır. Endotel hücreleri ve astrocytes geçirgen membran Ekle sisteminde ortak kültür bariyer modeli işleme özel dikkat etmek önemlidir. Orta değiştirmek sırasında aspirasyon ve orta eklenmesi ve ekler hareketlerini dikkatle endotel bariyer kesintileri en aza indirmek için yapmanız gerekir.

Tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik

Primer hücre vitro modelleri oluşturmak için kullanırken büyük bir meydan okuma kültürler arası yüksek tekrarlanabilirlik ulaşmaktır. Bu tür standardizasyon seçtiğiniz yöntem, yüksek kalite araçları ve reaktifler ve mikrodiseksiyon durumumda bir araya geldi olabilir. Sunulan yöntem için düşük toplu iş toplu iş çeşitlemesiyle yüksek tekrarlanabilirlik bu nedenle son derece sıkı bağlılık açıklanan yordamlara bağlı.

Yerine esnek çubuk elektrotlar azaltmak kullanılan toplu işlemleri ve şişeleri arasında iyi bir tekrarlanabilirlik AYLARININ ölçümleri, doku direnci ölçüm odası veya katı minyatür elektrotlar ile epitel Voltmetreler sırasında elde etmek için gözlenen AYLARININ değerleri değişkenlik. Yüksek AYLARININ değerleri (şekil 4) elde ek olarak sunulan modeli güvenilirliğini karşılık gelen düşük küçük çözünen geçirgenliği (şekil 4) ve pBECs (şekil 5 immunocytochemical karakterizasyonu tarafından onaylandıktan ).

Uygulanan yöntem ve Model sınırlamalar

Transgenik ve minyatür domuzlar kullanımı son yıllarda artmıştır, ama içinde vivo veri miktarını kemirgen modeller için kullanılabilir verilere göre hala sınırlı olduğunu ve bu nedenle vitro domuz verileri karşılaştırmak için bir sorun teşkil vivo sonuçlar. Ancak, domuz Biyoloji Biyoloji insan birçok kurulan laboratuvar hayvanlarının daha yakından yansıtır ve transgenik domuz için model olarak Alzheimer hastalığı-si olmak şimdi be gibi nörolojik hastalıklar eğitim84, kullanılabilirliğini kurulan vivo veri zamanla daha az sorunlu olması beklenen.

Yüzdeki kan akışında taklit etmek için yetersizlik geçerli geçirgen membran ekle sistem modelleri BBB bir kısıtlamasıdır. Vivo, Yamultma stres endotel hücre fizyolojisi bölümü, farklılaşma, geçiş ve Apoptozis85,86gibi birçok yönlerini etkilemeye ve önemli BBB özellikleri gibi etkilemek için gösterilmiştir bileske proteinler ve indüksiyon ve polarizasyon taşıyıcılar61,85,87ifadesi. Bu koşullar tanıtmak, yeni geliştirilen mikrosıvısal sistemleri88,89,90kabul edilebilir.

Vitro geçirgenliği verilerden unstirred su Katmanı (sulu sınır tabaka) etkisi için düzeltmek için yararlı bir yöntem yazılım tabanlı yaklaşım21kullanarak tahmin edilen 'içsel geçirgenliği' vivo, türetmektir. Bu yazılım aynı zamanda detaylı geçirgenliği veri analizi21için kullanılabilir.

Gelecekteki uygulamalar ve yön yöntemi

Nörovasküler birimi bileşenleri inducing ve BBB özellikleri korumak önemli rol oynarlar gösterilmiştir ve geçerli vitro model henüz vivo içinde koşullar, önemli bileşenlerinin tam olarak taklit etmek mümkün olmuştur ve etkileşimleri hala eksik olabilir. Sunulan modeli gelişmekte olan şimdiki çabalar üçlü-kültür modelleri ile her ikisi astrocytes ve perisitlerden ve farklı türlerin hücreleri birleştirerek deneyler oluşturma içerir. Perisitlerden birleşmesiyle defa değil önemli ölçüde bariyer AYLARININ düzeylerini artırmak için gözlenmiştir. Ancak, syngeneic domuz modelleri domuz beyin endotel hücreleri, fare astrocytes ve sıçan perisitlerden bariyer gerginlik ve hallmark proteinler karakteristik beyin ifade kullanarak kültürleri üç katına karşılaştırılabilir olmak gözlenmiştir endotel22. Bir model geliştirmek için insan pluripotent kök hücreler ve yetişkin kök türetme biçimlendirmenizi gerektiren ilaç bulma ve teslim ve/veya21progenitör hücre için BBB modelleri insan hücreleri, in vitro gelecekteki gelişmeler temel alan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.

Acknowledgments

Lundbeck Vakfı Hibe numarası R155-2013-14113 ve yazarlar Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen ve Niels M. Kristiansen için teknik yardım kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0, (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7, (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57, (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261, (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35, (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244, (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15, (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17, (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14, (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115, (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280, (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441, (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8, (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10, (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8, (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565, (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179, (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42, (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506, (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468, (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116, (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053, (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425, (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36, (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54, (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12, (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12, (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60, (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19, (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16, (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15, (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19, (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818, (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43, (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111, (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27, (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156, (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64, (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118, (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14, (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42, (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4, (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40, (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16, (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90, (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5, (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68, (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32, (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049, (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93, (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27, (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193, (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271, (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28, (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51, (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22, (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88, (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101, (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12, (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125, (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13, (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics