تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Biochemistry
 

Summary

الترسب اميلويد هو السمة مميزة لأمراض مختلفة ويصيب الكثير من الأجهزة المختلفة. وتصف هذه الورقة تطبيق أوليجوثيوفيني مترافق الإنارة الفلورية تلطيخ في تركيبة مع تقنيات الفحص المجهري الأسفار. ويمثل هذا الأسلوب المصبوغة أداة قوية للكشف والتنقيب من المجاميع البروتين في الأجهزة السريرية والعلمية على حد سواء.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nyström, S., Bäck, M., Nilsson, K. P. R., Hammarström, P. Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56279, doi:10.3791/56279 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البروتينات التي تودع اميلويد في الأنسجة في جميع أنحاء الجسم يمكن أن تكون سببا أو نتيجة لعدد كبير من الأمراض. ومن بين هذه نجد أمراض الأعصاب مثل مرض باركنسون والزهايمر التي تصيب أساسا الجهاز العصبي المركزي، والداء النشواني الجهازية حيث تودع اميلويد المصل A, ترانسثيريتين وسلاسل خفيفة مفتش اميلويد في الكبد، الرسغ النفق والطحال والكلى، والقلب والأنسجة الطرفية الأخرى. وقد تعرف اميلويد ودرس لأكثر من قرن، غالباً باستخدام الأصباغ اميلويد محددة مثل أحمر الكونغو وثيوفلافين تي (تي إتش تي) أو ثيوفلافين (ThS). في هذه الورقة، نقدم هيبتامير-فورميل حمض الخليك ثيوفين (هفتا) كمثال ليكمل وضعت مؤخرا إلى هذه الأصباغ تسمى أوليجوثيوفينيس مترافق الإنارة (لكوس). هفتا سهلة الاستخدام وهو متوافق مع تلطيخ شارك في الفلورة أو علامات أخرى الخلوية. بحوث مستفيضة أثبتت أن هفتا بالكشف عن طائفة أوسع من المجاميع البروتين الأمراض المرتبطة الأصباغ اميلويد التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق هفتا الضوئية انتداب مورفوتيبيس مجمعة متميزة للسماح للدراسات المتعلقة بتعدد الأشكال فيبريل اميلويد. بينما التصوير المنهجية المطبقة اختيارية، ونحن هنا تثبت التصوير الطيفي (له)، ليزر المسح المجهري [كنفوكل] وعمر fluorescence التصوير (فليم). وتبين هذه الأمثلة بعض تقنيات التصوير حيث لكوس يمكن استخدامها كأدوات للحصول على معرفة أكثر تفصيلاً لتشكيل والخصائص الهيكلية أميلويدس. قيداً هاما لهذه التقنية، أما بالنسبة لجميع تقنيات الفحص المجهري الضوئي التقليدية، شرط الحجم المجهري للمجاميع للسماح بالكشف عن. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تشمل الإجمالي بنية بيتا-ورقة متكررة للسماح لربط هفتا. التعرض المفرط التثبيت و/أو حانمه أن تعديل الهيكل الإجمالي أو تكيف يمكن أن تجعل هفتا الفقيرة ملزمة وتشكل القيود المفروضة على التصوير بدقة ومن ثم.

Introduction

ترسب المادة النشوانية في الأنسجة السمة مميزة باثولوجي في عدد أمراض مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والداء النشواني النظمية وأمراض بريون. وعلى الرغم من انتشار الأمراض المرتبطة بالمادة النشوانية، وحقيقة أن ما يقرب من 40 من البروتينات المختلفة للتاريخ قد صنفت اميلويد السلائف في الإنسان1، يعرف الكثير عن العلاقة بين الترسيب اميلويد والمرض النمط الظاهري. علم الأنسجة للعينات المأخوذة من المرضى البشرية قد تم استخدامها سواء لأغراض التشخيص والعلمية. عدد كبير من النماذج الحيوانية قد أنشئت للتحقيق في العلاقة بين عبء اميلويد والسلوك ومدى الحياة وعدد من الآخرين قراءة المظهرية الرافضة للمرض تطور2،3. كما تبذل جهود كبيرة في اكتشاف الأدوية وتصميم لمكافحة بعض الأمراض على نطاق واسع يخشى معظم أعمالنا. ومع ذلك، تقييم العلاقة بين النمط الوراثي والنمط الظاهري، وتحميل البلاك اميلويد، والدواء ليس مستقيمة. أدوات التلوين والتصوير من اميلويد في الأنسجة غالباً ما تكون حادة وتوفير معلومات ذات الدقة المنخفضة على تشكيل اميلويد والهيكل.

إنكسار مزدوج أحمر الكونغو وتي إتش تي ThS الأسفار أمثلة الأساليب الكلاسيكية لكشف وتحليل عبء اميلويد في عينات الأنسجة من خزعات المريض وبعد الوفاة عينات ونماذج حيوانية للمرض4. وقد استخدمت هذه التقنيات لعدة عقود (أحمر الكونغو منذ العشرينات من القرن الماضي وتي إتش تي ومشتقاته منذ الستينات)، وعلى الرغم من أن الأجهزة وقد تم تنقيح ويسمح بتحليل مفصل، لا تزال قيد التنفيذ الإجراءات المصبوغة والتحليل بنفس الطريقة التي يعامل بها قبل قرن تقريبا.

في هذه الورقة، ويصف لنا الاستفادة من صبغة اميلويد رواية حساسة للغاية، هفتا5، التي تسمح الكشف عن رواسب صغير البروتين غير ناضج بدرجة عالية من الدقة، فضلا عن الكشف عن اميلويد ناضجة. ومقارنة بالأصباغ التقليدية، لقد أثبت هفتا للكشف عن مجموعة واسعة من الأمراض المرتبطة البروتين المجاميع5،،من67. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق هفتا للتعيين بصري مورفوتيبيس مجمعة مميزة8. وهنا، يمكننا وصف تلطيخ هفتا وتحليل الأنسجة من نماذج حيوانية المنشأة من المرض بريون وبيتا اميلويد السلائف البروتين (APP) الفئران المعدلة وراثيا مصممة لتقليد وضع اللوحة في مرض الزهايمر9،10 . نعرض أيضا تحليل للتشخيص وبعد الوفاة عينات من المرضى الذين يعانون من الداء النشواني النظامية. وقد لكوس الخصائص الجوهرية التي تمكنهم من الإبلاغ عن الاختلافات conformational داخل اللوحة واحدة؛ وعن طريق الجمع بين اثنين لكوس مع خصائص مختلفة فيما يتعلق بالأسفار والملزمة، أكثر وضوحاً الفارق11. مجهر ابيفلوريسسينسي مزودة بمرشحات تمرير طويل ويستخدم رأس كاميرا الفائقة الطيفية لتمكين تسجيل من ميكروجرافس للتحليل الطيفي وتصنيف موضوعي للخواص الطيفية. يستخدم مجهر الأسفار [كنفوكل] مع ليزر الانضباطي كمصدر للإثارة لتقييم الخصائص ثلاثية الأبعاد البلاك اميلويد بمزيد من التفصيل. ليزر الانضباطي يتيح جمع طيف الإثارة وخطوة أقل اختيار الأطوال الموجية الانبعاثات في المجهر يمكن تصوير المشارك لكو الأسفار والفلوره لتحديد المشارك الترجمة من البروتين المستهدف واميلويد. فليم يوفر حساسية لم يسبق لها مثيل للاختلافات كونفورماشونال المفروضة لكوس، ويكشف عن الخلافات التي قد لا يمكن الكشف عنها في أطياف الانبعاث الأسفار.

هي الأهداف الرئيسية مع أسلوب المصبوغة وصف لتيسير الكشف عن حساسية من رواسب اميلويد الصغيرة وتميز conformational التعدد داخل رواسب اميلويد. هذه المعرفة هامة لفهم أساسي لأمراض تجميع البروتين.

Protocol

ملاحظة: توليف لكو تم أداؤه في مختبراتنا لأكثر من عقد من الزمان. بتطبيق بروتوكولات لاستبدال العطرية electrophilic البلاديوم حفزت الصليب-اقتران، واقتران أميد والتحلل إستر أساسا، نحن تخصيص صناعيا المسابير لأغراض مختلفة 5 ، 12-بعد التوليف، والوصف، وتنقية، لكو المنتج المجففة بالتبريد، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. بعض المسابير (بينها هفتا) هي الآن متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).

1. "الحل تلطيخ لكو"

ملاحظة: إذا تم شراء هفتا من مورد تجاري، الرجاء اتباع البائع ' تعليمات s بدلاً من القسم 1.

هفتا
  1. ريسوسبيند المجففة بالتبريد في مم 2 هيدروكسيد الصوديوم تحضير حلاً أسهم 1 ملغ/مل. إبقاء المخزون في قنينة زجاجية في 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين الأوراق المالية لمدة سنة واحدة.
  2. اليوم لتلطيخ، تعد حلاً عامل بإضعاف المضيفين الأسهم في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).

2. إعداد "عينات الأنسجة"

ملاحظة: يمكن تصويرها العديد من أنواع الأنسجة باستخدام هفتا كعلامة اميلويد. انظر الشكل 1 للحصول على أمثلة. هفتا حساس لتكيف التجميعية. تلطيخ ينبغي من ثم يفضل إجراء في المجاميع المتلاحقة مع لا التعرض حانمه. تحقق نوعية الطيفية الأمثل إذا كان يتم الاحتفاظ تثبيت الأنسجة إلى الحد أدنى. ومن ثم المواد المجمدة الطازجة، ثابتة برفق في الإيثانول في الوقت لتلطيخ، المفضل. ومع ذلك، من الممكن للكشف عن رواسب اميلويد أيضا في الأنسجة التي قد تم إصلاحها مع مثل الفورمالين. هفتا عموما تخترق الأنسجة أيضا. تحديد سمك عينة متوافق مع تقنية التصوير المقصود.

  1. إذا الفورمالين ثابتة، تستخدم المقاطع، بارافينيمبيديد ديبارافينيزي في زيلين نفط طوال الليل. تراجع المقاطع في حمامات متعاقبة من الإيثانول 99% إيثانول 70%، dH 2 س وبرنامج تلفزيوني، 10 دقيقة في كل. يسمح بوجود مقاطع الأنسجة الجافة تحت الظروف المحيطة.
    تنبيه: هو دائماً معالجة زيلين نفط في غطاء الأبخرة كيميائية. زيلين نفط والمذيبات العضوية الأخرى الضارة.
    1. كريوسيكشنز ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إصلاح أقسام الأنسجة في الفورمالين 10% بين عشية وضحاها وترطيب بغمس لهم في حمامات متعاقبة من الإيثانول 99% إيثانول 70%، dH 2 س وبرنامج تلفزيوني، 10 دقيقة في كل. يسمح بوجود مقاطع الأنسجة الجافة تحت الظروف المحيطة.
  2. إضافة قطرات الحل العامل هفتا (حوالي 200 ميليلتر) إلى مقاطع الأنسجة لتغطية ذلك. يجب أن تبقى الحبرية في مكان بالتوتر السطحي. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ.
  3. شطف قبالة الحل المصبوغة مع 500 ميليلتر PBS باستخدام ماصة وثم تزج الشريحة في حمام برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة السماح المقطع لتجف تحت الظروف المحيطة.
  4. التحميل باستخدام المتوسط تصاعد الأسفار. تسمح المتوسطة المتصاعدة لتسوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تلطيخ هفتا يمكن تنفيذها في تركيبة مع الأساليب الأخرى المصبوغة مثل الفلورة، علامات محددة الخلية أو عضية، إلخ. القيام بتلوين شارك، تشغيل الخاص بك بروتوكول المصبوغة كاملة لاختيار وإضافة هفتا تلطيخ نهاية، بدءاً من الخطوة 2، 2. انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة. الفلورة، يفضل تحديد جسم ثانوي هو متحمس في 640 nm أو أعلى. في هذا الطول الموجي، لا تستوعب هفتا وبالتالي لا يمكن أن يكون متحمس وسوف لا فلوريس. وهذا ما يضمن أن لا تنزف خلال يعتبر بين هفتا وجسم.

3. الفحص المجهري

ملاحظة: استخدام مجهر الأسفار مزودة بمرشحات تمرير طويل. واستخدمت جميع الإعدادات أدناه لإنشاء الصور في الشكل 4. تعديلات قد تحتاج إلى إجراء اعتماداً على العينة نوع والأنسجة اميلويد. على الرغم من أن هفتا منضمة إلى اميلويد مستقر نحو التبييض، فإنه من المستحسن إيقاف مصدر الضوء عند عدم فحص العينة أو تصويرها.

  1. له
    ملاحظة: تم إجراء التجربة باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مع عوامل الانبعاثات تمريره طويلة ورأس كاميرا له (انظر الجدول للمواد).
    1. استخدام مجهر الأسفار قياسية مزودة بمرشحات تمرير طويل وكاميرا الفائقة الطيفية. تأكد من أن يتم معايرة الكاميرا الطيفية.
    2. في البرنامج، اسم المشروع، حدد " الصورة الطيفية " والبدء في اقتناء.
    3. حدد موضع اهتمام من خلال العين استخدام عامل التصفية الإثارة 436-شمال البحر الأبيض المتوسط، وتحول مسار الضوء إلى الكاميرا.
    4. في حالة البيانات إدارة (CDM)، حدد نوع العينة طيفية، تسمية العينة، والحصول على الصحافة. سيتم فتح إطار اكتساب.
    5. في إطار اقتناء " التصوير الطيفي " وفتح من القائمة إعدادات، حدد خصائص حيازة، وتعيين النطاق الطيفي إلى 460-700، اكتب نوعية السرعة بأقصى سرعة ممكنة، والقياس في مرشحات الغاز/الليزر/الضيقة. قم بإغلاق مربع الحوار-
    6. في القائمة صورة، حدد العيش الكامل. شريط الرموز، قم بإيقاف تشغيل هامش. حدد أو حجم منطقة الصورة التي لديها قيمة الذروة الذاكرة أدناه 800 ميغا بايت. تعيين وقت التعرض إلى قيمة التي تعطي سطوع صورة إجمالية بين 1000 و 3,000. شريط الرموز، اضغط على الكاميرا الملونة. وسوف تبدأ اقتناء. عند الانتهاء من الحصول على الصور، اضغط على حفظ في " صورة طيفية الحصول " مربع الحوار و " خلية جديدة " في مربع الحوار إدارة بيانات الحالة.
    7. "من إليه التنمية النظيفة"، قم بفتح الصورة التي تم جمعها باستخدام الزر تحليل ابدأ. سيتم فتح إطار تحليل البيانات-
    8. يمكن جمع المعلومات
    9. الطيفية من كل بكسل من الصورة عن طريق تحديد رويس باستخدام مربع الحوار عرض الطيفية. اختر " تحديد " وحدد رويس من مجالات ذات صلة بالصورة-
    10. حفظ البيانات الطيفية كملف نصي باستخدام الزر Lib. يمكن استيراد الملف.txt المحفوظة لأي برمجيات التحليل للاختيار. يمكن استخدام الملف.slb للتحليل ضمن برنامج تحليل البيانات. يمكن أيضا تصدير البيانات الفائقة الطيفية المكعب من الصورة بأكملها كملف raw، كما " الطبقات كمعرض طرابلس "، أو كما " الطبقات في تنسيق نص " لتطبيقات تحليل البيانات والصور باستخدام برامج خارجية.
  2. [كنفوكل] مجهرية
    ملاحظة: المجهر [كنفوكل] مجهز بليزر الانضباطي كمصدر للإثارة. لجميع التجارب الانبعاثات الأسفار، تعيين كثافة الليزر إلى 0.2% (المقابلة لقوة متوسط من 3 µW)، الثقب 1 وحدة جيدة التهوية، وحجم الإطار إلى 1,024 مقصف x 1,024 مقصف، سرعة المسح الضوئي 7 وفي المتوسط ما يزيد على 16 بالأشعة، وعمق بت 8 بت (انظر < s في س > "الجدول للمواد"). هذه الإعدادات تحتاج إلى تعديل لكل نظام [كنفوكل] فردية، ومصدر الليزر، ونوع العينة.
    1. أجل طيف الانبعاث، جمع البيانات باستخدام طريقة لامدا والإثارة باستخدام الأرجون ليزر مجموعة إلى 488 نانومتر. جمع الانبعاثات بين nm 503 و 687 استخدام قنوات 22 في كشف اللحظات 32 قناة. تعيين المكسب إلى 755.
    2. لتحقيق صور قناة واحدة، استخدم الذكية إعداد الخيار. فيتك (تصفية الخضراء)، حددت الربح إلى 750 وأجل أليكسا 535 (تصفية الحمراء) تعيين المكسب إلى 845.
    3. لجمع طيف الإثارة مع ليزر الانضباطي، واستخدام الإثارة مع 1 نانومتر الخطوات بين 490 و 545 نانومتر بينما جمع الانبعاثات بين 551 و 586 شمال البحر الأبيض المتوسط. تعيين كثافة الليزر إلى 2% (المقابلة لقوة متوسط من 30 µW) والمكاسب إلى 774.
    4. لجمع Z-مكدس الذاكرة المؤقتة في وضع الطيفية، والمسح الضوئي من خلال عمق المقطع في الخطوات من 0.96 ميكرومتر. يمكن استخدام نفس إعدادات الإثارة والانبعاثات كما في الخطوة 3.2.1 لكن تعيين المكسب إلى 730.
  3. فليم
    ملاحظة: المجهر [كنفوكل] مجهز بوحدة فليم (انظر الجدول للمواد).
    1. إعداد المعلمات التالية للمجهر [كنفوكل]: الثقب، 20؛ والإثارة الطول الموجي، 490 نانومتر؛ وكثافة الليزر، 0.5% (المقابلة لقوة متوسط من 7.5 µW). تستخدم أشعة الليزر النبضي في 40 ميغاهرتز.
    2. البرمجيات "في فليم"، إعداد فوتون عد ما يزيد على 550 نانومتر. في إطار عرض معلمات، اتبع فوتون العد حتى العدد الحد الأقصى هو حوالي 4,000 فوتون التهم.
    3. قم بحفظ الملف وتصديره كصورة توافق آراء ساو باولو-
    4. تناسب البيانات التي تحلل أسي 2-مكون في برنامج فليم. نوبة يعطي χ 2 < 2 جيد. قيمة على المحور ص هو عدد التهم لعمر معين.
    5. تحديد عتبة للتهم تشمل، مثلاً، 100. لون رمز من T1 وحدد نطاق مدى الحياة. الانحلال يعتمد على بنية اميلويد حيث يرتبط هفتا. وقد لوحظت إعمار الأسفار بين 300 و 000 1 ps. قم بحفظ الملف.
    6. تصدير البيانات الأولية باستخدام خيارات تصدير وحفظ البيانات المطلوبة في مجلد جديد.

Representative Results

تلوين الحساسة وانتقائية لرواسب اميلويد من عدد كبير من البروتينات في العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة من المرضى البشر والحيوانات التجريبية أمر حيوي للتشخيص السريري، وكذلك كما هو الحال في البحث العلمي. في هذه الورقة، ونظهر كيف يمكن تحقيقه باستخدام لكوس، يتجلى في هفتا, لتلطيخ والتصوير المتعدد الوسائط من اميلويد من مجموعة مختارة أنواع الأنسجة. منذ صدور أول يغاندس اميلويد ثيوفين القائم منذ أكثر من عشر سنوات13، اميلويد الرواسب التي تتألف من مجموعة كبيرة من البروتينات في مجموعة متنوعة من الأنسجة تم تصويرها باستخدام لكوس6،،من711، 14،،من1516 (الشكل 1). في تركيبة مع الأجسام المضادة أو علامات نسيجية أخرى، لكوس توفير أدوات ممتازة لأغراض التشخيص والعلمية (الشكل 1a، الشكل 2). مع اختيار مناسب من علامات مضيئة، يمكن تصويرها عدة فلوروفوريس في نفس القسم (الشكل 1a، هفتا و DAPI، هفتا الشكل 2a في الإعداد الفلورة). من الممكن أيضا استخدام مقاطع متتالية للتلوين باستخدام برايتفيلد والأسفار (الشكل 2bوهفتا وتلطيخ جسم الدأب). في الآونة الأخيرة، وقد ثبت هفتا لتكون عنصرا مكملاً واعدة جداً إلى أحمر الكونغو تلطيخ في التشخيص السريري7،15 (الشكل 3).

تطوير تقنيات التصوير خلال العقود الماضية زادت الحاجة إلى اميلويد الصبغات التي يمكن أن تميز بين دقيقة، ولكن في الوقت نفسه الخلافات العميقة في رواسب اميلويد بطريقة كمية. نظام مترافق داخل لكو يوفر لها قدرة فريدة على تقرير عن الاختلاف في طريقة عملها ملزمة. التواء جزيء يمكن أن يؤدي إلى تشويه في زوايا ملزم في نظام مترافق وتعرقل نقل الإلكترونات (الشكل 4 أ). وهذا يعكس بدوره على خصائص الفلورسنت لكو في الطول الموجي الإثارة والانبعاثات وفي الانبعاثات مدى الحياة. نحن نستخدم له في مجهر الأسفار تستقيم مزودة بمرشحات تمرير طويل للانبعاثات. للإثارة وأطياف الانبعاث في الفحص المجهري [كنفوكل] وفليم، نحن نستخدم LSM780 مع الليزر النبضي. نحن تصويرها لتجسيد مختلف التقنيات، كائن واحد (اللوحة بيتا اميلويد (Aβ) في ماوس المحورة وراثيا تطبيق) (الشكل 4 باءه). يسمح الفائقة الطيفية الفلورية الأطياف (الشكل 4 باء) لتقييم التحولات الطيفية وتباين كثافة في مناطق مختلفة من اللوحة. يمكن استخدام الطيف الإثارة في [كنفوكل] مجهرية (الشكل 4 ج) لتحديد الطول الموجي الإثارة الأمثل للتجارب المصب، مثلاً، وتركيبة تلطيخ مع عدة فلوروفوريس. هذا الأسلوب يمكن أن يكون مفيداً للكشف عن الاختلافات كونفورماشونال في طريقة ربط لكو أيضا. طيف انبعاث في وضع [كنفوكل] يمكن استخدامها لتحديد خصائص الانبعاثات الأسفار من هفتا أو من مزيج من فلوروفوريس عدة لتقييم كولوكاليزيشن في الجمع بين تجارب مع عدة لكوس أو لكو والفلوره تركيبات. عمر fluorescence هفتا العالية تتأثر بالاختلافات الصغيرة في وضع ملزمة لةفتا. ومن ثم فليم أداة قوية في التمييز بين الاختلافات المفروضة على هفتا بهدف الربط (الشكل 4 د). ويمكن استخدام هذا على سبيل المثال في التمييز بين سلالات مختلفة بريون8. [كنفوكل] التصوير وتجهيز مداخن Z إلى صور ثلاثية الأبعاد أداة مفيدة لاستكشاف الشكل العام لتجميع اميلويد (4e الشكل). مرة أخرى، استخدام fluorophores إضافية يمكن أن تساعد في فهم تكوين وديعة.

Figure 1
الشكل 1: مختلف الأنسجة والبروتينات وأنواع المجاميع تظهر فتا ح تلطيخ من: () Mallory Denk هيئات تتألف من مجاميع الكيراتين في كبد (كونتيرستينيد مع DAPI)، (ب) r p62-إيجابية تضمينات في متفرقة إدراج-التهاب العضل (s--أي بي أم) العضلات أنسجة الجسم، (ج) اميلويد من جزيرة ليلى ببتيد اميلويد في البنكرياس البشري، والدماغ (د) سلسلة الخفيفة "اميلويد الغلوبولين المناعي" في الأمعاء البشرية، الرعاش () الأغنام (البريونات) في الماوس، (و ) المزمنة الهزال مرض (البريونات) في الدماغ الماوس، لويحات (ز) Aβ في الدماغ الماوس APP23، علم الأمراض (ح) Aβ في التطبيق/PS1 الماوس الدماغ، وخزعة (أنا) الدهون مسحات من عينات تشخيصية من اميلويد ترانسثيريتين في مرضى البشرية تصنيف 1-4 وفقا لسجل قياسي أحمر الكونغو (الجمهورية التشيكية). وتظهر المناطق الصفراء هفتا الملون رواسب اميلويد والأزرق هو أوتوفلوريسسينسي من الأنسجة الدهنية. يتم تحديد طول شريط مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: أمثلة على تلطيخ يشترك مع الأجسام المضادة- () يشترك تلطيخ مع البروتين اميلويد المصل المضاد A (أإ) الفلورة وهفتا من اميلويد AA البشرية في نفس القسم. أعلى اليسار: AA جسم الانبعاثات 640 نانومتر؛ هفتا الأيمن العلوي في 488 نانومتر؛ أسفل لوحة تراكب الصورة كولوكاليزاتيون تظهر باللون الأصفر. (ب) جسم fluorescence تلطيخ وهفتا في الأقسام على التوالي. أعلى اللوحة: AA جسم الدأب تلطيخ، واللوحة السفلية: هفتا تصويرها مع عامل تصفية انبعاثات الفلترات. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مقارنة الأسفار مع مرشحات تمرير قصيرة في اميلويد ترانسثيريتين في قلب الإنسان ملطخة ماير لتوضع/أحمر (د) والكونغو الهيماتوكسيلين/هفتا في ماير (e). () برايتفيلد صورة، (ب) برايتفيلد + الأسفار، (ج) برايتفيلد متقاطعة المستقطبات، (د) برايتفيلد الأسفار + + عبرت المستقطبات، (ه) هفتا الأسفار في 405شمال البحر الأبيض المتوسط + 480 نانومتر الإثارة (أقسام متتالية د). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: يتجلى نفس الكائن ملطخة هفتا وتصويرها مع العديد من تقنيات استخدام اللوحة Aβ واحدة الماوس APP23 الذين تتراوح أعمارهم بين. () الأسفار خصائص هفتا تمليها حالته كونفورماشونال. ويرد هيكل هفتا في الدولة مستو والملتوية. (ب) الفائقة الطيفية تصوير للتقييم المستمر انبعاث الطيف. الأطياف في اللوحة السفلي تم تلوينها حسب المناطق محاصر من الاهتمام في الصورة. (ج) (ط) كونفوكال تصوير لتصوير الإثارة والطيف (الثاني والثالث) وتصوير الانبعاثات في وضع عامل تصفية أو وضع الطيفية (رابعا). (د) Fluorescence تصوير مدى الحياة للكشف عن الاختلافات conformational في اميلويد، حيث تم العثور على أقصر مدة حياتها في محيط اللوحة Aβ وأوقات الحياة الأطول في وسط اللوحة. ويبين الرسم البياني في لوحة أقل توزيع أوقات الحياة لهذه اللوحة كاملة. يتم تلوين الصورة طبقاً لمقياس الرسم البياني أدناه. () [كنفوكل] Z-مكدس الذاكرة المؤقتة التي تم جمعها في وضع عامل تصفية لعرض هيكل ثلاثي الأبعاد للكائنات. يتم تحديد طول شريط مقياس في كل فريق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ترسب البروتينات أبيرانتلي مطوية في اميلويد حدثاً رئيسيا للعديد من الأمراض العمليات. لويحات اميلويد خارج الخلية تتألف من الببتيدات Aβ والتشابك نيوروفيبريلاري داخل الخلايا التي شكلتها تاو هايبرفوسفوريلاتيد توجد في المخ لمرضى الزهايمر. مجموعة من البروتينات المختلفة، مثلاً، ترانسثيريتين (بعد)، "اميلويد المصل" ألف عنصر (سا)، ومفتش السلسلة الخفيفة ميسفولد وبيان رواسب اميلويد في الأنسجة خارج الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أن اميلويد قد يعرف بالودائع ودرس لأكثر من قرن، ونحن لا تزال تفتقر إلى معرفة تفصيلية لكيفية اميلويد هو بدأ ترسب على المستوى الجزيئي، وما يمكن فعله لمنع هذه العملية. لمرض الزهايمر, ومن الضروري أن تثبت كيف ترتبط عملية الداء النشواني مع نيوروديجينيريشن. السعي مفتاح واحد في البعثة لعلاج الداء النشواني هو وضع رواية صقل أدوات لرصد بدء اميلويد، والتدرج، والانحدار؛ ومن ثم الكشف عن اميلويد المستهدف هو المفتاح. على المدى الطويل، التشخيص اﻻكلينيكي سوف تستفيد من زيادة الحساسية والانتقائية اميلويد المصبوغة أساليب7،15. التحديات الحالية في هذا الصدد هائلة، وهي منطقة أبحاث نشطة للغاية. إحدى المسائل الرئيسية للتطوير السريري والمحاكمات تشخيص تنبؤاتها. بدء هذه الأمراض المحتمل وذلك قبل ظهور الأعراض، ولكن يلزم للبدء بالعلاج هناك تحديد لهذا المرض. هذه الوثيقة، حساسية أحد جوانب رئيسية لمنهجيات جديدة. وعلاوة على ذلك، أن هذه المسألة أكثر تعقيداً لأن بعض المجاميع البروتين السامة، وبعضها واقية، وبعضها محايد. ومن ثم القدرة على رصد مورفوتيبيس المجمعة محددة أمر أساسي نظراً لوجود الأنواع مجمعة مميزة قد اقترح لشرح النمط الظاهري غير المتجانسة التي ذكرت لمجموعة متنوعة أمراض تجميع البروتين الأعصاب. على سبيل المثال، هو بروتين بريون مثال كلاسيكي لكيف يمكن ميسفولد تسلسل الأحماض الأمينية أساسية متطابقة في مورفوتيبيس التجميعية المميزة، التي تؤدي إلى سلالات بريون محددة. تعدد الأشكال مماثلة قد أبلغ أيضا عن الببتيد Aβ و α-سينوكلين تاو. وفي هذا الصدد، أظهرت لكوس لتكون أدوات المستحقة لإحالة بصري مورفوتيبيس مجمعة متميزة. بروتين بريون حدة السلالة المجاميع، ودائع البروتين الموجودة في عدة أنواع من الداء النشواني النظامية، فضلا عن Aβ متعددة الأشكال، وتم تمييز تاو المجاميع بسبب ظاهرة الضوئية المستحث كونفورماتيونالي ملاحظته من لكوس.

الترسب اميلويد هو حدث الذي يحدث في الأنسجة التي من الصعب اختراق مع الأساليب الفيزيائية أو الكيميائية الحيوية الجزيئية الدقة. إمكانية للتحقيق في أحداث السابقين فيفو فيفو، و في المختبر باستخدام الجزيئات لكو نفس يمهد الطريق لكشف الأحداث التي تحدث في فيفو استخدام التقنيات التي الوحيدة الممكنة لتطبيق على السابقين فيفو أو في المختبر عينات11،17. يظهر نموذج هيكلي دقة عالية تم الإبلاغ عنها مؤخرا أن بينتاميريك لكو فتا (بفتا) يربط في تجويف شكلت بمحاذاة الجانب سلاسل متوازية مع محور فيبريل تمتد 6 في سجل مواز بيتا-خيوط18، مما يدل على أنه ممكن اكتساب المعرفة القرار الذري عن الكيانات المستهدفة لكو. في جوهرها يشبه وضع تجويف وملزمة ملزمة بفتا أحمر الكونغو19، تمليها أخدود تصطف المتكررة إيجابية مشحونة ليز الجانب سلاسل. تقارب لكوس يبدو أفضل مقارنة بالأحمر الكونغو احتمالاً بسبب سلسلة من المرونة وقوى فإن دير فالس التفاعلات من ذرات الكبريت الخواتم ثيوفين نحو تجويف مسعور. الكشف عن أنواع بريفيبريلار (قبل يستجيب تي إتش تي)5،20 يظهر اعتماداً على أوراق β المتكررة، تتألف من بسجل مواز-بيتا-خيوط، الذي سيكون هفتا يجري وحدتين ثيوفين أطول من بفتا تمتد عبر معبر خيوط بيتا يصل إلى 8.

يتطلب البروتوكول المصبوغة بإيلاء الاهتمام لمشكلة إطلاق النار في الخطوات التالية: (ط) التثبيت: التثبيت واسعة من عينات الأنسجة يمكن أن يعطل هيكل اميلويد وتحد من إمكانية الكشف عن التباين في الأطياف fluorescence الناجمة عن كونفورماشونال تشويه للجزيء هفتا. ويفضل تثبيت خفيفة من كريوسيكشنز من المواد الطازجة المجمدة لتحقيق الدقة الطيفية المثلى. ومع ذلك، سوف هفتا وصمة عار وفلوريس اميلويد في الأنسجة الثابتة ولكن مع انخفاض كفاءة وأقل تباين الطيفية. (ثانيا) حانمه التعرض: المعالجة المسبقة للأنسجة لتحقيق حانمه التعرض لجسم ملزمة أحياناً قد تقلل قدرة هفتا لربط نظراً لتعطل هيكل اميلويد. إذا كان هذا مشكلة، والتعرض حانمه خطوة حاسمة في جسم تلطيخ البروتوكول، باستخدام مقاطع متتالية للأجسام المضادة وهفتا، على التوالي يمكن اعتبار. (ثالثا) أوفيرستاينينج: هفتا حساس للغاية. يجب أن تبقى الحلول العامل بتركيز منخفض شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض تركيز هفتا إذا كان تلوين الخلفية مشكلة. إذا كانت العناصر التي تربط هفتا متفرق في الأنسجة، يمكن تجميع فائض هفتا وتتراكم في الأجلين المتوسط والتركيب. هذا هو معترف به الأسفار التي ليست في الطائرة التركيز من الأنسجة نفسها. إذا كان هذا يبدو، تزج الشريحة المحملة في برنامج تلفزيوني حتى يمكن أن ينزلق من القسم بكشف الغطاء ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإعادة تحميلها مع تصاعد الطازجة المتوسطة وزلة غطاء جديد. (رابعا) عامل التصفية على أساس التصوير: تصف هذه الورقة حل معظمها طيفيا fluorescence التصوير باستخدام مرشحات تمرير طويل أو الكشف عن قنوات متعددة. ويمكن أيضا رصد هفتا استخدام مرشحات تمرير قصيرة. يرجى أن يكون على علم بأن هذا الحد من التباين وتلغي إمكانيات الكشف عن ألوان متعددة.

على مدى السنوات الماضية، أصبح من الواضح أن أدوات، لكوس فلوري البحث ولا سيما هفتا إظهار خصائص واعدة جداً. وقد أظهرت نتائج لمجموعة كبيرة متنوعة من البروتينات والحالات المرضية، تتراوح بين هفتا الكشف عن المجاميع داخل الخلايا (تاو، الهيئة إدراج التهاب العضل)، اميلويد الجهازية المصل اميلويد أ، ترانسثيريتين، وسلاسل خفيفة الغلوبولين المناعي (كابا و لامدا) سيمينوجيلين 1، بريون البروتين (بما في ذلك العينات السريرية)21، ببتيد اميلويد في جزيرة ليلى، والإنسولين7،15. عاملاً مقيداً لتنفيذ هفتا كأداة تشخيص المجهري الأسفار أن لا يستخدم على نطاق واسع في مختبرات علم الأمراض اميلويد الروتينية. وعلاوة على ذلك، له ليست متاحة بسهولة في العيادة. ولكن هفتا تلطيخ اميلويد ومجهرية الأسفار قد استخدمت في المختبرات السريرية في مجهر الأسفار استناداً إلى عامل تصفية وينبغيتعتبر طريقة تشخيص مجاني. وقد تجلى مؤخرا في النفق الرسغي خزعات مع الداء النشواني ترانسثيريتين باستخدام الإعدادات الأساسية للأسفار في أزياء الآلي22.

وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى البروتينات المختلفة، fluorescence هفتا تسلم مجموعة متنوعة واسعة من أنواع فيبريل ومجاميع اميلويد فيبريلار مسبقاً، مثلاً، تم الكشف عن مسار فيبريلار الأنواع وتتميز. في هذا المنشور، لقد أظهرنا لكو واحد على مختلف أنواع العينة باستخدام ثلاث تقنيات الفحص المجهري. كما أتاح استخدام التوليف التي تسيطر عليها لوضع لكوس للكشف تنوعاً من الأهداف الجزيئية البيولوجية، مثلتسجيل التفاعلات السطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)23 وراديولابيلينج لانبعاث بوزيترون تصوير شعاعي طبقي (محبوبة)24.

وحتى الآن، تم نشر ما يزيد على 25 لكوس مختلفة. زيادة استخدام لكوس لتصوير رواسب اميلويد ستزيد معرفة وفهم لكيفية تجميع هذه المجاميع المرتبطة بالمرض وتفكيكه وتتداخل مع الأجهزة والأفراد التي يقيمون فيها.

Disclosures

هي الرقم الهيدروجيني PN ميغابايت SN المساهمين طفيفة في التكنولوجيا الحيوية إيبا التي تتاجر هفتا تحت اسم العلامة التجارية Amytracker545.

Acknowledgments

الكتاب نود أن نشكر ليندغرين ميكائيل وسلوزني شأنا لإسداء المشورة بشأن الفحص المجهري الأسفار، وادريانو اغوزي، يوهان بيجزيت، حزينبيرج بوك، هيبنير فرانك، جاكر ماتياس، تيريز كلينجشتات، ماجنوسون كارين، كريستينا سيجوردسون، دانيال Sjölander، كريستوف Röcken، ويستيرمارك غونيلا، الواحدة ويستيرمارك، وكورت زاتلوكال للمساهمة في أقسام الأنسجة أو ميكروجرافس المعروضة في هذا المنشور. وتم تمويل جمع البيانات المعروضة في هذه الوثيقة بمساهمات "المؤسسة السويدية في الدماغ" (Hjärnfonden)، جمعية "الزهايمر السويدية" (الزيميرفوندين)، ومجلس البحوث السويدية (VR)، الرابطة غوستافسون غوران، غيورغ & أستريد أولسون، ومشروع "الاتحاد الأوروبي FP7 الصحة" لوباس، وجامعة ينكوبينج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hFTAA/Amytracker545 Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting medium Agilent technologies GM304
LeicaDM6000 Leica
Lumen 200 Prior
Spectraview system ASI spectral imaging
Spectraview software ASI spectral imaging
LSM780 Zeiss
Zen 2010b v6.0 software Zeiss
FLIM system Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514 Zeiss
Tunable Laser In Tune Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
  2. Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
  3. Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
  4. Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. 3-25 (1999).
  5. Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
  6. Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
  7. Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
  8. Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
  9. Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
  10. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
  11. Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
  12. Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
  13. Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
  14. Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
  15. Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
  16. Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
  17. Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
  18. Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
  19. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50, (26), 5956-5960 (2011).
  20. Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
  21. CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
  22. Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. 1-9 (2017).
  23. Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
  24. Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics