Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

Neuroscience
 

Summary

We beschrijven een experimentele procedure voor het meten van neuronale activiteit door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie in vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (143), e56297, doi:10.3791/56297 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De hersenen van zoogdieren vertoont duidelijke symmetrie in het sagittale vlak. Gedetailleerde beschrijving van neurale dynamiek in symmetrische hersengebieden in volwassen zoogdieren dieren blijft echter ongrijpbaar. In deze studie, beschrijven we een experimentele procedure voor het meten van calcium dynamiek door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie. Deze methode maakt opnamen en ondermeer van neurale activiteit in bilaterale muis hersengebieden één tegelijkertijd in hetzelfde experiment voor een langdurige periode in vivo. Belangrijke aspecten van deze methode, die kan worden voltooid binnen een uur, omvatten minimaal invasieve chirurgieprocedures voor het maken van dual optische windows, en het gebruik van 2P imaging. Hoewel we alleen de techniek op het gebied van S1 tonen, kan de methode worden toegepast voor andere regio's van het levende brein te vergemakkelijken van de opheldering van structurele en functionele complexiteit van hersenen neurale netwerken.

Introduction

Calcium en de verordening zijn essentieel in het bemiddelen van meerdere fysiologische processen. Controle van de dynamiek van calcium is nuttig voor het begrijpen van de normale hersenfunctie evenals pathologische condities van hersenen stoornissen 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s fluorescentie is een krachtig hulpmiddel voor het kwantificeren van de spike nummers, timing, en de frequentie, alsmede de niveaus van synaptic inbreng zowel in vitro als in vivo 9,10,11.

De hersenen van zoogdieren vertoont duidelijke symmetrie in het sagittale vlak. Hoewel recente neurologische onderzoek licht op de corticale remodelleren werpen heeft en neuronale activiteit getriggerd door traumatische hersenen of ruggenmerg letsel 6,7, de rollen die intact weefsel van symmetrisch spelen overeenkomstige regio 's in herstel zijn nog steeds onduidelijk.

In deze studie beschrijven we experimentele procedures voor het maken van bilaterale symmetrische optische windows voor in vivo imaging. Deze optische windows gebruikt, beschrijven we het meten van calcium dynamiek van primaire somatosensorische cortices (S1) in GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2P microscopie. In de sectie resultaten tonen we ook in vivo dendritische morfologie op verschillende tijdstippen in de regio van de S1 in de EGFP transgene muizen met behulp van 2 P imaging. De observatie-methode met betrekking tot de dynamiek van het netwerk in de bilaterale S1 gebieden is maar een eerste voorbeeld van hoe dual open craniale windows zal helpen neurowetenschappers sonde lokale en symmetrische informatieverwerking in de hersenen volwassen zoogdieren in de normale omstandigheden of in andere ziekte modellen in vivo.

Protocol

Alle chirurgische en dierlijke omgang werden uitgevoerd zoals goedgekeurd onder de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (National Research Council) en de richtlijnen van de Indiana University School van geneeskunde institutionele Animal Care en gebruik Comité. De schematische afbeelding van de 2-photon imaging setup is afgebeeld in Figuur 1.

1. voorbereiden het dier door Imaging

  1. Plaats steriel gaas, katoenen wissers en gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische hulpmiddelen op het gebied van de chirurgie (tabel 1). Inschakelen van een Micro kraal sterilisator voor intersurgery sterilisatie van chirurgische gereedschappen.
  2. Anesthetize de muis (mannelijk of vrouwelijk, 1.5 – 2.5 maanden, 20-25 g) door intraperitoneale injectie (i.p.) uit een mengsel van ketamine (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) en acepromazine (0.238 mg/mL) (6 µL/g lichaamsgewicht). Wacht totdat de juiste diepte van de verdoving wordt bereikt wanneer het dier ophoudt te reageren op een prikkel van de snuifje teen en geen hoornvlies reflex heeft. Tijdens de operatie, geven een booster dosis van 1/3 de oorspronkelijke dosis van de cocktail als verdoving nodig de oorspronkelijke toestand van verdoving te handhaven.
  3. Subcutaan injecteren van buprenorfine (s.c.; 0,05 – 0,10 mg/kg) als een pijnstillende agent voorafgaand aan de operatie. Beschermende zalf toepassen door de ogen van het dier hoornvlies drogen en cataract vorming te voorkomen.
  4. Plaats een GCaMP6s transgene muis op een verwarming pad te voorkomen hypothermie en bedek het met een steriele chirurgische draperen. Stabiliseren van het dier hoofd met een hoofd Holding Adaptor voor muizen.
  5. Het scheren van het hoofd over het grootste deel van de hoofdhuid met een double edge scheermesje. Schoonmaken van het chirurgische gebied met een steriele alcohol voorbereiding pad gevolgd door Povidon-jodium oplossing.

2. chronische craniale venster voorbereiding

  1. Maak een rechthoekige verlaging van de hoofdhuid (2 x 3 mm) met een schaar aan één zijde (rechts) van de schedel. Druk op de huid opzij met een wattenstaafje om de totstandbrenging van een ruimte van de blootstelling van > 3 mm diameter (figuur 3A). Verwijderen van het bindweefsel die hechten aan de schedel door voorzichtig schrapen de schedel met een botte microchirurgische mes (Scalpel Blade #10; Figuur 3 c).
  2. De S1 gebied markeren door zachtjes te trekken een cirkel (3 mm diameter, center coördinatie:-1.5 mm van de bregma en 2,5 mm vanaf de middellijn) op de schedel met behulp van een tandheelkundige boren (figuur 2B).
  3. De dezelfde procedure uitvoeren op de linker schedel (figuur 2B).
  4. Breng een dunne laag van cyanoacrylaat Super lijm tot op het bot te vormen een basis voor tandheelkundige cement toepassing.
  5. Onder een Microscoop ontleden, dun beneden een circulaire groef in de schedel rond het gebied van de S1 met behulp van een snelle microdrill (figuur 3D). Het doel is het creëren van een vloeiende rand voor de plaatsing van een optische venster naar het.
  6. Herhaaldelijk toepassen kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF, kamertemperatuur) de schedel periodiek tijdens het dunner te vergemakkelijken boren en warmte. Het boren met tussenpozen Voorkom oververhitting en installeer wrijving-geïnduceerde uitvoeren Zuigen weg het bot puin met een huis vacuüm lijn of een vacuümpomp.
  7. Na ongeveer 2/3 diepte van het bot is geboord, dunne langzaam en zorgvuldig het resterende 1/3 bot totdat een circulaire stukje van de schedel (bot klep) volledig vrij van de omringende schedel is.
  8. Langzaam en zorgvuldig verwijderen van de klep van de circulaire bot met een paar # 5/45 pincet en bloot de dura (figuur 2C; De 3E figuur).
  9. Houd de blootgestelde hersenen regio vochtig met ACSF (3E figuur). Voorkom schade aan pial schepen, aangezien bloeding zal veranderen van de cerebrale doorbloeding, versnellen hersenen zwelling en ernstig imaging kwaliteit degraderen.
  10. Het uitvoeren van dezelfde procedure aan de (contralaterale) linkerzijde van de schedel.
  11. Voor het samenstellen van het optische venster, gebruik optische Lijm lijm en genezen tussen dekglaasje lagen één filter tegelijk. Indien nodig, warm het optische venster (50 ° C voor 12 h) in een incubator ter verbetering van de verlijming. Het optische venster bevat 2 delen: het bovenste gedeelte bevat een enkel ronde cover glas met een diameter van 5 mm en het onderste gedeelte bevat 1 – 3 ronde cover bril met een diameter van 3 mm (figuur 2D).
  12. Het optische venster opslaan in ethanol (70% vol/vol) en spoel het na met steriele zoutoplossing vóór gebruik. Optische venster installatie, Controleer voor het optische venster voor onvolkomenheden, met inbegrip van een onjuiste hoeveelheid optische zelfklevende of onjuiste uitlijning onder een stereoscoop.
  13. Installeer het optische venster via de craniotomy regio (figuur 2D). Het bovenste gedeelte van het optische venster berust op de schedel en het onderste gedeelte van het optische venster past binnen de craniotomized opening en berust op de dura in het bijzijn van CSF (figuur 2D, E).
  14. Zegel van het bovenste gedeelte van de rand van de optische venster op de schedel met de cyanoacrylaat Super lijm (figuur 2F; Figuur 3F).
  15. Wanneer de cyanoacrylaat Super lijm is opgedroogd, toepassing zwarte tandheelkundige cement (Dentsply) ter dekking van de rand van het glas. Tandheelkundige cement van toepassing op alle de blootgestelde schedel en wond marges voor het blokkeren van licht (Figuur 2 g-H; Figuur 3B).
  16. Het uitvoeren van dezelfde procedure aan de linkerkant.
  17. Laat het dier te herstellen op de verwarming pad en het dier terug naar haar kooi voor recuperatie onder passend toezicht. Bieden van natte voedsel om te kauwen en hydratatie te vergemakkelijken. Ter vermindering van pijn, het beheren van buprenorfine s.c. (0.05-2.0 mg/kg) elke 8-12 h-postinjury voor 2 dagen. Laat de muis om te herstellen voor een extra 7 – 10 dagen vóór de beeldvorming.

3. twee-foton imaging

  1. Anesthetize op de dag van het experiment, het dier met ketamine en xylazine (doses en onderhoud van anesthesie zoals hierboven beschreven). Reinig de craniale venster met 75% (vol/vol) ethanol.
  2. Plaats de muis onder een imaging set-up die bestaat uit een 2P-Microscoop en de hoofd houden adapter, rustend op een verwarming pad met haar hoofd door oor tralies gekoppeld aan een hoofd muishouder geïmmobiliseerd.
  3. Afbeelding één zijkant van de optische venster tegelijk. Om de optische aberraties te minimaliseren, zorg ervoor dat de optische venster en de juiste schedel georiënteerde loodrecht op de optische as van de Microscoop.
  4. Neem een eerste beeld van de craniale venster met heldere veld verlichting op de 4 x vergroting als een referentie-kaart voor registratie met hogere vergroting 2P angiographies (figuur 4A1).
  5. Zoom in op het gebied van belang met behulp van 10 x vergroting (figuur 4A2).
  6. Selecteer een gebied van belang op het gebied van S1 in corticale lagen I of II (tot 150 µm onder het pial oppervlak). Indien hogere vergroting is gewenst, gebruik een 20 X doelstelling.
  7. Zoekt u een gezichtsveld met meerdere neuronen. Verwerven van beelden met behulp van een Microscoop 2P (figuur 4B). Het bepalen van de blootstellingstijd en de excitatie lichtniveau (≈910 nm) op basis van de diepte en het niveau van de expressie van GCaMP6s, met zwakkere signalen vereisen langere belichtingstijden en concordantly minder tijd resolutie. Wij gebruiken meestal ~ 4 µs per pixel belichtingstijden. Verwerven van beelden bij beeldfrequenties van 3 – 5 Hz bij een resolutie van 512 x 512 pixels.
  8. Beginnen met opnemen van de tijdreeks. Coördinaten van alle regio's van belang (ROI) ten opzichte van de vasculaire patroon of op fiducial punten in lage vergroting afbeeldingen opslaan. Het imago van de dezelfde ROI na verloop van tijd. Uitvoeren van dezelfde procedure om te observeren calcium dynamiek van de S1-gebied op de linker hemisfeer. Wijzigingen in de fluorescentie van elke ROI berekenen.
  9. Verwerven afbeeldingen individueel of als een time-lapse film (figuur 4C1-C3, D, E).
  10. Studie corticale blood flow dynamics in vivo door imaging fluorescerende dextran kleurstoffen geïnjecteerd in de ader van de staart van knaagdieren met 2 P-microscopie. Gebruik vasculatures als monumenten te herkennen en het beeld van de dezelfde ROI in imaging sessies over lange periodes.

4. verwerking van de gegevens

  1. Gebruik ImageJ en oorsprong voor beeldanalyse. Importeren van afbeeldingsreeksen met ImageJ (figuur 5A-B). Voor afzonderlijke beelden (of t-serie films), selecteert u een ROI binnen een verbeelde neuron en 2 aparte naburige regio's voor achtergrond meting (figuur 5C). Verwerven totale intensiteit met een ROI-manager (Figuur 5C).
    Opmerking: Figuur 6 toont beelden van de representatieve calcium. Calcium van voorbijgaande aard (groen) en bloedvat (rood) tonen op verschillende tijdstippen in seconden (figuur 6A-D) in een muis op 7 d na de initiële venster installatie. De z-projectie van een periode van 3 minuten opname voor rode en groene kanalen (Figuur 6 sexies) of groene kanaal (figuur 6F) wordt ook weergegeven. Een z-projectie toont een gecomprimeerde afbeelding van alle afbeeldingen in de film waaruit de grens van een ruw en cirkel (die het object neuron van belang in alle frames) is handmatig geselecteerd en de selectie van de onafhankelijke in de buurt van achtergrond regio's ( 2 Figuur 6G).
  2. Bereken uit elke ROI, de gemiddelde fluorescentie achtergrond FB, FB = (FB1 + FB2) / 2, en de veranderingen van de fluorescentie van het soma (F) uitgedrukt als ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
  3. De analyses van de piek stap voor stap met behulp van functies voor ImageJ inclusief correctie van de basislijn, piek vinden/bepaling, piek integratie, piek montage, en/of Time-Saving Peak analysefuncties uit te voeren.

Representative Results

Wegwijs in de bilaterale optische, verkregen we resultaten 2 aparte experimenten. Het eerste experiment werkzaam EGFP-uiten muizen aan afbeelding dendritische varicosities. Figuur 4C 1-3 ziet u voorbeelden van afbeeldingen die zijn vastgelegd op verschillende tijdstippen na implantatie van optische venster. Merk op dat het aantal en de locatie van de dendritische takken en stekels opmerkelijk stabiel tussen de 2 weergaven (Figuur 4 d, E, z-projectie zijn).

Het tweede experiment werkzaam Thy1 -GCaMP6s transgene muizen voor het meten van het intracellulair calcium voorbijgaande, aldus illustreren hoe calcium fysiologie kan worden gemeten binnen een enkel neuron in vivo (Figuur 6). Deze techniek kan worden gebruikt voor het opnemen en kwantificeren van de spontane activiteit in populaties van laag V piramidale neuronen attractiepark zo diep als > 500 µm onder de pia. Gemiddelde spontane reacties na verloop van tijd (berekend als de gemiddelde antwoorden op elk tijdstip) kunnen worden berekend over de talloze proeven. De 2P-techniek heeft het voordeel voor het opsporen van activiteit gelijktijdig in grote of verspreide neuronale bevolking over een langere periode met kleine mechanische storingen naar de hersenen ten opzichte van multielectrode opnamen.

Voor het genereren van een aanvaardbare gemiddelde meting, worden 5 – 10 proeven aanbevolen. Het aantal proeven zullen afhangen van het spontane reacties of inherente variabiliteit van de reacties op een bepaalde stimulatie. Als alle stappen zijn zich dient te houden, zoals hierboven beschreven, een onderzoeker opgeleid in beide uitgedund-schedel craniale venster techniek en in vivo 2 P calcium imaging moet zitten kundig voor opnames van 100 – 200 neuronen aan beide zijden te verkrijgen van 1 – 2 dieren per dag.

Na de analyse van de piek, kan een verzameling van resultaten zoals de werkelijke locatie van de piek, de echte amplitude, het gebied en de volle breedte op halve maximum (FWHM) voor elke piek worden verkregen.

Figure 1
Figuur 1 : Schematische illustratie van de componenten van een Cranio optische venster voor 2-foton (2P) beeldvorming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Schematische tekening toont belangrijke stappen voor het voorbereiden van een Cranio venster. (A) onder een Microscoop ontleden, verwijder de huid over het chirurgische gebied met behulp van een paar chirurgische schaar. (B) gebruik een snelle microdrill voor de productie van een circulaire groef (3 mm doorsnede) op de schedel over het gebied van de S1 tot het bot flap binnen de groef wordt losgekoppeld van het omliggende bot. (C) Verwijder langzaam de bot klep om de onderliggende dura bloot te stellen. (D) Assemble het optische venster met coverglasses met 2 verschillende diameters. De bovenste dekglaasje heeft een grotere diameter (5 mm) en de lagere coverglasses (meestal 1-3) hebben een kleinere diameter (3 mm). De dikte van de coverglasses worden geïnstalleerd zullen afhankelijk van de dikte van de schedel. (E) plaats het dekglaasje op de cirkelvormige opening van de schedel aan het maken van een optische venster. Het onderste gedeelte van de coverglasses moet passen binnen de craniale opening. De onderkant van de coverglasses moet voorzichtig contact opnemen met de dura. (F) zegel het venster randen op de schedel met Cyanoacrylaat lijm. (G) wanneer de cyanoacrylaat droogt, zwarte tandheelkundige cement laterale van toepassing op de muur van de lijm. (H) de craniale venster te vullen met ddH2O en gebruik van water-onderdompeling doelstellingen voor imaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Creatie van bilaterale windows op de schedel. (A) A fotografische beeld toont 2 craniale optische windows aan weerskanten van de schedel overliggende het S1-gebied. (B) hoge vergroting van de doos regio van afbeelding (A) tonen van bilaterale optische windows bloot de onderliggende dura en bloedvaten. Schaal bar = 680 µm. (C) de blootgestelde schedel. (D) het creëren van een circulaire groef waarbinnen een centrale bot flap wordt gezien. Schaal bar = 900 µm. (E) na het verwijderen van de klep van het bot, de craniale opening was gevuld met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF). Schaal bar = 720 µm. (F) installatie van de optische zoom-venster over de craniale opening en sluiting van de rand van het venster met superlijm. De dura en bloedvaten zijn zichtbaar door de optische raam. Schaal bar = 600 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Calcium en dendritische beeldvorming. (A1) Identificeren van de regio's van belang met behulp van bloedvaten (BV) als monumenten in Thy1-GCaMP6s muizen. (A2) Identificeren dezelfde gelabelde cellen (rode pijlen) na verloop van tijd met behulp van dezelfde monumenten en record. (B) vertegenwoordiger Z-projectie van calcium signalen in neuronen (rode pijlen) van de primaire Somatosensorische cortex (S1). Schaal bar = 10 µm. (C1-3) visualisatie van dendrites (groen) en een bloedvat (rood) in B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J op verschillende diepten in de laag II van de S1 regio op 1 dag na de optische venster installatie. (D) Z-projectie van meerdere afbeeldingen in dezelfde regio op 1 dag. (E) Z-projectie van meerdere afbeeldingen op dezelfde regio 7 dagen na de installatie van optische venster. Opmerking de opmerkelijke stabiliteit van het nummer en de locatie van volwassen stekels en dendritische takken tussen 1 dag en 7 dagen na de optische venster installatie. Schaal bar = C-E 5 µm (C-E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.Figure 5
Figuur 5 : Calcium signaal tracering. (A, B) Voorbeelden van geïmporteerde t-serie films met ImageJ voor data-analyse van 2 neuronen (neuron 1 en neuron 2, respectievelijk). (C) A werkblad worden gegevens weergegeven over de intensiteit van de verlichting uit regio van belang (ROI; binnen het neuron en 2 aparte naburige regio's zoals achtergrond maatregelen). (D) berekening van de piek: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (de gemiddelde fluorescentie achtergrond [FB], en de veranderingen van de fluorescentie van het soma [F], uitgedrukt in ΔF/F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Vertegenwoordiger calcium beelden. (A-D) Calcium van voorbijgaande aard (groen) en de bloedvaten (rood) op verschillende tijdstippen in seconden in een muis op 7 dagen na de installatie van optische venster. Gele pijl: een relatief minder actief neuron. Witte pijl: een blancobepalingen neuron. (E, F) Z-projectie van een periode van de opname van 3 min voor de rode (bloedvaten) en groen (calcium) kanalen (E) en groene kanaal alleen (F). (G) geselecteerde neuronen en hun achtergrond van de aangrenzende gebieden worden gemarkeerd. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Twee-foton imaging kunt de gelijktijdige meting van de activiteit van veel cellen op een redelijke resolutie op tot ongeveer 800 µm onder het oppervlak van de hersenen. Wij 2P en een dual optische venster techniek geïntegreerd met genetisch gecodeerde GCaMP6s te observeren dynamiek van de calcium in populaties van neuronale waarin laag V gelegen > 500 µm onder de pia. Met een open optische venster op elke zijde van de schedel kunt de methode opnames van neurale activiteit over symmetrische zoogdieren hersengebieden op langdurige en stabiele calcium in vivoimaging. Belangrijke aspecten van deze methode opnemen de prestaties van minimaal invasieve chirurgie maken dubbele open schedel optische windows en 2P beeldvorming van neuronale activiteit in symmetrische S1 regio's.

Behandeling van de netwerkactiviteit in bilaterale S1 regio's is dat een voorbeeld van hoe dual craniale windows kan worden gebruikt om lokale en symmetrische informatieverwerking in de volwassen hersenen in vivosonde. Deze methode kan ook worden gebruikt om de neuronale activiteit (bijvoorbeeld met behulp van Thy1 -GCaMP6s muizen) en corticale plasticiteit B6 te studeren. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J van intact weefsel van de corresponderende symmetrische regio's in de rustfase na deafferentation als gevolg van een eenzijdige CNS blessure. De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de corticale activiteit in reactie op de stimulatie van de perifere strategieën zoals optogenetic, elektrische of chemische stimulaties. Hoewel we alleen de techniek op het gebied van S1 tonen, kan deze aanpak worden toegepast teneinde te onderzoeken van de activiteiten in andere symmetrische gebieden in de hersenen van het leven zoals de laag V neuronen van de primaire motorische cortex (M1). Opmerkingen over reorganisatie van hersengebieden kunnen voorzien van een neuraal substraat adaptieve motor gedrag, die een cruciale rol in postinjury herstel van functie speelt. Het staat ook voor chronische meting van de symmetrische activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag in hoofd-vaste muizen.

Technisch, onderzoekers moeten zorgvuldig aandacht besteden aan de kwaliteit en consistentie van dual craniale windows. Uitgedund-schedel craniale venster techniek 12 is een aanrader voor de beginners om te oefenen. Stekels zijn calcium compartimenten vanwege hun morfologie en lokale toestroom en extrusie mechanismen. In deze studie gebruikten we B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J muizen als voorbeeld om aan te tonen Dendritische spine dynamiek in vivo (Figuur 4). Een open-schedel glazen venster installatie kan veroorzaken hoge rug omzet en reactieve gliale reacties na chirurgie 12. In tegenstelling met de techniek uitgedund-schedel venster stekels en dendrites kunnen worden goed bewaard gebleven.

Keuzen van afmetingen en diktes van optische windows zullen afhankelijk van het gewenste gezichtsveld, de kromming van de schedel, de dikte van de schedel en het soort imaging 13. Onvoldoende druk van de optische coverglasses op de dura kan verdikking van de dura, hergroei van de schedel, en verhoogd hersenen beweging. Daarentegen kan de buitensporige druk van de optische coverglasses corticale bloedstroom belemmeren.

Voor de assemblage van de optische venster, lijm en genezen van extra lagen van coverglasses een op een moment met optische lijm- en lange-golflengte UV-licht. Warm om te helpen versterken van de verlijming, het verzonnen venster (50 ° C voor 12 h) in een broedmachine. Sla de optische venster dekglaasje in ethanol 70% (vol/vol) en vóór de operatie, het spoelen met een steriele zoutoplossing. Het optische venster moet worden onderzocht op hun onvolkomenheden (zoals een onjuist bedrag van optische uitlijning van de zelfklevende of onjuiste) onder een stereoscoop vóór gebruik te voorkomen van mislukking. Als de optische lijm te dun is, kan luchtruimten worden gevouwen, die leiden optische aberraties of dekking glas Detachement bij de implantatie tot kan. Daarentegen kan teveel optische lijm overloop langs de randen van de craniale venster.

Kortom, hier beschrijven we een experimentele procedure voor het meten van calcium dynamics of dendritische morfologie door craniale ramen uit 2 symmetrische primaire somatosensorische corticale gebieden in Thy1-GCaMP6s en Thy1- YFP transgene muizen, respectievelijk het gebruik van 2P microscopie. Deze techniek kan sterk vergemakkelijken ontrafeling van het complexe structurele en functionele relatie van neurale netwerken.

Disclosures

Auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn zeer dankbaar Wenbiao Gan (Skirball Institute, departement van fysiologie en Neuroscience, New York University School of Medicine, USA) voor uitstekende technische begeleiding en Patti Raley, medische Editor (departement van de Neurochirurgie, Indiana University School of Medicine), voor het bewerken van het manuscript. Wij danken Dr. Jinhui Chen (Stark neurowetenschappen Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) voor het verstrekken van B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J muizen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Stichting van de directeur van het algemene ziekenhuis van Jinan militaire regio van Ruggegraten PLA 2016ZD03 (XJL), en NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, verdienste Review Award I01 BX002356 van het US Department of Veterans Zaken, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ruggenmerg en hersenen verwonding Research Foundation, Mari Hulman George Endowment fondsen (XMX).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J Jackson 24275 Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. Jackson 7919 Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. 
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel Fine Science Tools 11251-30 Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer Southern Labware B1201 Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor Tritech Research SG-4N Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit Harvard Apparatus 72-6065 Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05 Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm Harvard Biosciences W4 64-0720 Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm Harvard Biosciences W4 64-0700 Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive Norland Products 7106 Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue WB Mason LOC1647358 Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent Dentsply 675570 Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam Moore Medical 2928 Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors Roboz RS-5841 Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) - - The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520, (7546), 180-185 (2015).
  2. Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72, (6), 1025-1039 (2011).
  3. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, (7357), 501-505 (2011).
  4. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14, (8), 1089-1093 (2011).
  5. Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9, (2), 201-208 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10, (7), e0132077 (2015).
  7. Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80, (2), 327-334 (2013).
  8. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, (6), 903-912 (2001).
  9. Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80, (2), 371-384 (2013).
  10. Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79, (8), 667-675 (2016).
  11. Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33, (12), 5285-5300 (2013).
  12. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5, (2), 201-208 (2010).
  13. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9, (11), 2515-2538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics