In Vitro och In Vivo upptäckt av Mitophagy i mänskliga celler, C. Elegansoch möss

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mitophagy, processen för clearing skadade mitokondrier, är nödvändigt för mitokondriell homeostas och hälsa underhåll. I denna artikel presenteras några av de senaste mitophagy identifieringsmetoder i mänskliga celler, Caenorhabditis elegansoch möss.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitokondrierna är kraftcentrumen av celler och producera cellulär energi i form av ATP. Mitokondriell dysfunktion bidrar till biologiska åldrande och en mängd olika sjukdomar inklusive metabola sjukdomar, för tidigt åldrande syndrom och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD). Underhåll av mitokondriell hälsa beror på mitokondriell biogenes och effektivt clearance av dysfunktionella mitokondrier genom mitophagy. Experimentella metoder för att upptäcka autofagi/mitophagy, särskilt i djurmodeller, har varit en utmaning för att utveckla. Senaste framsteg mot förståelsen av molekylära mekanismer för mitophagy har möjliggjort utvecklingen av Roman mitophagy detekteringsmetoder. Här, vi införa flera mångsidiga tekniker för att övervaka mitophagy i mänskliga celler, Caenorhabditis elegans (t.ex., Rosella och DCT-1 / LGG-1 stammar), och möss (mt-Keima). En kombination av dessa mitophagy detekteringsmetoder, inklusive mellan djurarter utvärdering, kommer att förbättra noggrannheten av mitophagy mätningar och leda till en bättre förståelse av rollen som mitophagy i hälsa och sjukdom.

Introduction

Mitophagy är viktigt för mitokondriell underhåll. Mitokondrier skär flera cell signalering vägar och är universella sub cellulära organeller ansvarar för cellernas energiproduktion, cellernas ämnesomsättning och kalcium homeostasen1,2,3, 4. mitokondrier ständigt uppleva utmaningar från endogena och exogena källor, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) och mitokondrie gifter, respektive, som leda till generation av ”åldern” och dysfunktionella mitokondrier. Ansamling av skadade mitokondrier minskar effektiviteten i ATP produktionen samtidigt öka mängden skadliga ROS och har kopplats till åldersrelaterade sjukdomar såsom metabola sjukdomar, AD, och PD1,5,6 . För att förhindra mitokondrier inducerad cellulär dysfunktion, kallas celler behöver särskilt erkänna skadade mitokondrier och effektivt ta bort dem genom en cellulär process mitokondriell autofagi (mitophagy). Detta visade betydelsen av mitophagy i hälsa och sjukdom illustrerar behovet av korrekta och effektiva metoder för att upptäcka mitophagy både in vitro- och in vivo.

Mitophagy är en process i flera steg som innefattar många proteiner och protein komplex5,7,8. I korthet är en skadad mitokondrien först erkänt och uppslukas av en dubbel-membraned phagophore, som kan härröra från den plasmamembran, endoplasmatiska nätverket, Golgi komplexet, kärnan eller mitokondrien själv9,10. Den sfäriska phagophore förlänger och så småningom förseglar mitokondrierna inuti, som utgör den mitokondriella autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome sedan säkringar med Lysosomen för nedbrytning, bildar en autolysosome där den skadade mitokondrien är degraderad och återvunnet7,8. Stora autophagic proteiner också involverade i mitophagy inkluderar: autofagi relaterade 7 (ATG7) och Beclin1 (initiering) Microtubule-Associated Protein 1A/1B-Light kedja 3 (LC3-II) (LGG-1 i C. elegans) och p62 (komponenter av phagophore), och lysosomala-associerade membran glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. Dessutom finns det flera viktiga proteiner som är unika för mitophagy, inklusive PTEN-inducerad förmodad Kinase 1 (rosa-1), Parkin1, Nuclear Dot Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interagerar Protein 3 som (NIX/BNIP3L) (DCT-1 i C. elegans), bland annat5,6,11.

En vanlig metod att upptäcka förändringar i nivåer av autofagi är av förhållandet mellan LC3-II/LC3-I eller LC3-II/aktin. Denna metod är dock ospecifik, eftersom en ökning av detta förhållande kan återspegla en ökad initiation eller en nedsatt fusion av mitophagosome till Lysosomen12. En annan metod är att utvärdera colocalization mellan en autofagi-markör (t.ex., LC3) och en mitokondriell protein (t.ex., Translocase av yttre mitokondriella membranet 20 (TOMM20, som kan brytas ned av proteasomen)). Dock detta endast kan indikera förändringar i totala mitophagy nivåer och kan inte skilja på stegen som blockering sker. Detta kan klargöras med hjälp av lysosomala hämmare (t.ex., E64d + Pepstatin A, kallas EP) parallellt kan orsaka ansamling av mitophagosomes. Skillnaden mellan antalet mitophagosomes vid baseline och antalet mitophagosomes efter behandling med EP kan indikera mitophagy. Dessa begränsningar har föranlett utvecklingen av Roman mitophagy detekteringsmetoder. Med tanke på den ökande betydelsen av mitophagy i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar presenterar vi flera robusta mitophagy detektering tekniker som kan vara användbar för forskare. Vi täcker både in vitro- och in-vivo tekniker och rekommenderar att kombinera flera tekniker för att verifiera ändringar av mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur (manliga och kvinnliga möss) var födda och uppvuxna i en ackrediterad djuranläggningen, i enlighet och godkännande från NIH djur vård och användning kommittén. Dödshjälp metoder måste överensstämma med samtliga nationella och institutionella bestämmelser.

1. detektion av Mitophagy i mänskliga celler

  1. Påvisande av mitophagy använder mt-Keima plasmid
    Obs: Proteinet Keima, smält mitokondrier målet signal, förenklad som mt-Keima, har visat sig användbart för i vivo mitophagy upptäckt. MT-Keima är en proportionerlig pH-känsliga fluorescerande protein som uppvisar grön fluorescens (excitation 458 nm) i grundläggande eller neutrala förhållanden och röd fluorescens (excitation 561 nm) i sura förhållanden. Hälsosam mitokondrier trivs i grundläggande eller neutralt (pH 7-8) och indikeras med grön fluorescens när transfekterade med mt-Keima. När mitokondrierna genomgå mitophagy och säkring med sura lysosomer, pH sjunker till 4.5 och mitokondrier som innehåller mt-Keima uppvisar röd fluorescens6,13,14. Viktigt, är mt-Keima resistenta mot lysosomala proteaser, möjliggör utvärdering av mitophagy över längre perioder. Protokollet nedan är avsedd för 6-väl plattor.
    1. Dag 1: Använda primära mänskliga celler (t.ex., fibroblaster) eller förevigade mänskliga celler (t.ex., Hela Cells eller U2OS celler). Utsäde cirka 0,3-1 × 106 celler per brunn (beroende på cell tillväxttakten att tillåta celler att nå 70% konfluens nästa dag) i en 6-bra platta. Upprätthålla cellerna i komplett cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) medium kompletteras med 10% FBS och 1% blandad lösning av penicillin-streptomycin), och inkubera i en cell kultur inkubator vid 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Tillsätt 1 mL komplett cell odlingsmedium per brunn i en 6-well platta.
      Obs: Gen överuttryck/knockdown eller läkemedel behandlingar kan göras på denna etapp6.
    2. Dag 2: Blanda mt-Keima plasmid DNA6 och DNA transfection reagens (blandningen för en väl 6-well platta).
      1. Späd ut 15 µL ett DNA transfection reagens med 150 µL av serumfritt medium enligt tillverkarens protokollet.
      2. Späd 2-5 µg av mt-Keima plasmid DNA med 150 µL av serumfritt medium.
      3. Lägga till utspädda mt-Keima plasmid i utspädda DNA transfection reagenset, virvel för 10 s, och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
        Obs: Optimering av DNA transfection villkor kan vara nödvändigt beroende på storleken på plattan (se tillverkarnas protokoll för detaljer).
      4. Lägg DNA/transfection reagens blandning droppvis till celler, sedan skaka plattorna försiktigt i 5-10 s tills lösningen blandas helt.
    3. Dag 3: Ändra media genom att ersätta det DNA transfection reagens-innehållande mediet med färska komplett cellodlingsmedium (1 mL per brunn).
    4. Dag 4: Image cellerna använder konfokalmikroskopi6. Använda två imaging kanaler: gröna kanalen (excitation 458 nm, emission 570-695 nm) för att visualisera normala mitokondrier och röda kanalen (excitation 561 nm, emission 570-695 nm) för att visualisera mitokondrier som genomgår mitophagy. Slumpmässigt bild 20 områden under 40 x förstoring att täcka sammanlagt 100-200 celler i varje brunn.
    5. Utföra dataanalyser. Beräkna ”mitophagy index” (andelen mitokondrier som genomgår mitophagy), med bild analys programvara för att kvantifiera mängden fluorescens i både de röda och gröna kanalerna: ta förhållandet mellan röd fluorescens till röd + grön fluorescens, och multiplicera med 1006.
      Obs: Alternativ till transfection inkluderar användning av mt-Keima stabilt uttryckt HeLa cell linjer14. Eftersom HeLa celler inte uttrycker Parkin, uttryckas Parkin stabilt för att studera Parkin-beroende mitophagy i denna cellinje.
  2. Påvisande av mitophagy med colocalization mellan cytokrom C oxidas subenhet II (COXII) och LAMP2
    Obs: COXII är ett mitokondriella genomet-kodade inre membranprotein. 'mitophagy index' är lika med förhållandet mellan COXII colocalized med LAMP2 uttryckt som en procentandel av det totala beloppet för COXII.
    1. Seed HeLa celler (eller andra celler av intresse som nämns i steg 1.1.1) i en 4-väl kammaren bild (1-5 × 104 celler i 1 mL komplett cell odlingsmedium per brunn) i en cell kultur inkubator vid 37 ° C (20% O2, 5% CO2) över natten.
    2. Lägg till 3,0 µL 10 mM karbonyl cyanid - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) och inkubera i cell kultur inkubator (steg 1.2.1) för 3 h.
      Obs: Andra droger som påverkar mitophagy får användas.
    3. Ta bort odlingssubstratet med 1 mL pipett, tvätta cellerna två gånger med 1 mL/väl av förkylning (0-4 ° C) 1 x PBS. Låt lösningen sitta i 10-30 s innan nästa tvätten. Tillsätt 0,5 mL 3,7% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS till varje brunn och inkubera i 10 min på is fixar cellerna.
      Varning: PFA är toxin. Arbeta i dragskåp när du använder PFA.
    4. Kassera den PFA lösning med 1 mL pipett, tvätta cellerna två gånger med kallt 1 X PBS (1 mL per brunn, låt lösningen sitta för 10 s innan nästa tvätten), och permeabilize celler med 1 mL/väl av 0,25% tvättmedel (i 1 x PBS) för 10 min på is.
    5. Ignorera permeabilizing bufferten, försiktigt tvätta cellerna två gånger med kallt 1 x PBS och kassera (Låt lösningen sitta för 10 s mellan tvättarna). Blockera cellerna med 1 mL/väl på 5% FBS i 1 x PBS över natten vid 4 ° C. Täcka kamrarna för att förhindra vätskeförlust.
    6. Förbereda 0,5 mL per brunn av en blandad antikropp lösning med COXII antikroppar (mus, 1: 250 utspädning) och LAMP2 antikropp (kanin, spädning 1:20-1:50) i 1 x PBS med 5% FBS och store på is för 0,5-1 h.
    7. Ta 4-väl kammaren bilden ur kylrummet och kassera den blockerande lösningen med en 1 mL pipett. Försiktigt tvätta cellerna två gånger med 1 mL/väl av kallt 1 x PBS och kassera (Låt lösningen sitta för 10 s mellan tvättarna), sedan lägga till 0,5 mL/väl blandade antikropp lösning. Inkubera vid 37 ° C i 1 h på en shaker vid låg hastighet.
    8. Kassera de första antikropp lösning med 1 mL pipett och försiktigt tvätta cellerna tre gånger med 1 mL/väl av kallt 1 x PBS och kassera. Låt lösningen sitter för 10 s innan nästa tvätten. Tillsätt 1 mL per brunn av fluorescerande sekundära antikroppar (t.ex., get anti-kanin med våglängd 568 nm röd fluorescerande protein (RFP) för LAMP2; och geten antimus med våglängd 488 nm grönt fluorescerande protein (GFP) för COXII) i 1: 250 spädning med 5% FBS i 1 x PBS. Täcka 4-väl kammaren bilden med aluminiumfolie och inkubera vid 37 ° C för 1 h på en shaker vid låg hastighet.
    9. Kassera den andra antikropp-lösningen med en 1 mL pipett. Försiktigt tvätta cellerna sex gånger med 1 mL/väl av kallt 1 x PBS. Låt lösningen sitta i 1 min innan nästa tvätten.
    10. Montera cellerna med 50 µL per brunn av antifade monteringsmedium med DAPI, och lägga täckglas.
    11. Bild cellerna under en confocal Mikroskop med 66 x förstoring och nedsänkning olja (kakel File / mosaik kan användas för att öka antalet celler som avbildas av programvara). Använd samma inställningar som kanal exponeringstid, digital vinst, digital offset, etc. i hela alla tänkbar processer (se programvara instruktioner för detaljer)15.
    12. Använda colocalization analys programvara att kvantitativt analysera minst 20 slumpmässiga bilder av 100 celler15. Använd funktionen ”stängd Bezier” Markera hela enskilda celler. Jämför den Pearsons colocalization koefficient av GFP RFP, antingen viktat eller oviktade, för att fastställa mitophagy nivåer i analyserade celler. Upprätthålla värdena för horisontella och vertikala hårkorset på colocalization analys programvaran i hela analysen. Att exakt ange dessa hårkorset, förbereda två extra uppsättningar av celler och märka en COXII och den andra LAMP2. Ställ sedan hårkorset direkt ovanför pixel fördelningen för varje kanal15 (se programvaran instruktioner för detaljer).
  3. En hög genomströmning imaging mätning för mitophagy screening
    Obs: Utför hög genomströmning skärmar av mitophagy-inducerande eller -mitophagy-hämmande föreningar från stora sammansatta bibliotek är tekniskt krävande. En tänkbar teknik baserat på colocalization av mitokondrier med autophagosomes är ett mer förenklat, men ändå mycket känsliga alternativ för mitophagy screening16.
    1. Dag 1: Utsäde celler (t.ex., mänskliga primära fibroblaster på 5 000 celler/100 mL cell kultur media per brunn) i en plattan med 96 brunnar (se steg 1.1.1).
    2. Dag 2: Behandla cellerna från den andra dagen med FCCP eller andra föreningar av intresse för utsedda inkubationstiden (se steg 1.2.2).
    3. Följ stegen 1.2.2-1.2.9 med de primära antikropparna för COXII (mus, 1: 250 spädning med 5% FBS i 1 x PBS) och LC3B (kanin, 1: 100-1: 200 spädning med 5% FBS i 1 x PBS). Alternativt, primära antikroppar för COXII och LAMP2 användas.
    4. Bild de celler som använder en fluorescerande läsaren16. Samla bilder i slumpmässigt placerade fält och med en minsta 500 celler per brunn.
    5. Analysera data med hjälp av en cell analyzer anpassade protokoll16.

2. detektion av Mitophagy i C. elegans

Obs: Nematoden C. elegans ger en plattform för att assay mitophagy på organismers nivå. Två stammar kan användas för att övervaka mitophagy: (1) mitokondrierna-riktade Rosella (mtRosella) eller (2) mitophagy receptor DCT-1 smält med GFP tillsammans med autophagosomal markör LGG-1 smält med Discosoma sp. röd fluorescerande protein (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy övervakning med Rosella biosensor
    Obs: Rosella är en molekylär biosensor som kombinerar en pH-okänsliga DsRed smält till en pH-känsliga GFP variant. Den Rosella biosensor utnyttjar pH skillnaderna mellan sura Lysosomen (pH ~ 4.5) och andra cellulära fack. Detta biosensor har använts framgångsrikt övervaka mitophagy i Saccharomyces cerevisiae och flera däggdjursceller rader, till exempel HeLa, HEK293 och HCT11618,19. Vi anpassade här mångsidig dual-fluorescerande-reportern och genererade transgena C. elegans nematoder uttrycker mitokondrierna-riktade Rosella (mtRosella) i kroppen-väggen muskelceller. Mitophagy induktion indikeras av en minskad GFP/DsRed förhållandet av mtRosella fluorescens.
    1. Dag 1: Plocka L4 larver av maskar som uttrycker mitokondrierna-riktade Rosella (mtRosella) i kroppen-väggen muskelceller på Nematoden Growth Media (NGM) plåt ympats med E. coli (OP50) använder en dissektion Mikroskop5. Placera 10-20 maskar/platta på minst tre 3,5 cm plattor. Inkubera i nematoder vid vanlig temperatur av 20 ° C5.
      Obs: Se referens för mask anatomi, inklusive identifiering av L4 larver20och sättet att göra ett val som används för att överföra maskar från en plats till en annan21.
    2. Dag 5: Synkronisera nematoder genom att välja 15-20 L4 transgena larver och överföra dem till färska OP50 seedade NGM plattan. Använda minst fem plattor per experimentella villkor.
    3. Dag 7: Förbereda fordonet plattor för mitophagy-påverkar droger av intresse eller positiva kontroller.
      1. Döda E. coli (OP50) bakterier seedade genom att exponera NGM plattor för 15 min med 222 µW/cm2 (intensitet) av UV-ljus för att säkerställa att mitophagy-inducerande föreningar inte metaboliseras av bakterier. Plattorna måste exponeras med 2 000 J/m2.
        Obs: Sekunder exponering behövs = 2,000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Lägga till andra sevärdheter i toppen av seedade NGM plattor. Lägga till motsvarande mängd sammansatta fordon (lösningsmedel som används för att upplösa föreningen, såsom dimetyl sulfoxid (DMSO)) till fordonets plattorna som negativ kontroll. För positiv kontroll av mitophagy induktion, en mitokondriell för människor, användes parakvat (8 mM slutlig koncentration). Lägga till en lösning som innehåller 10 µL 8 M parakvat lager med 190 µL av ddH2O på toppen av agarplattan för behandlingsgruppen. Lägga till en lösning som innehåller 10 µL av DMSO med 190 µL av ddH2O på toppen av agarplattan för gruppen fordon.
        Obs: Parakvat arbetande lösningen kan förvaras i 1 månad vid 4 ° C.
      3. Snurra försiktigt plattorna tills läkemedlet eller fordonet rockar hela ytan. Låt plattorna torka med locken stängda i rumstemperatur i minst 1 h innan du överför maskar.
        Obs: Drogen plattor kan också framställas genom att lägga droger i flytande NGM innan det stelnar.
    4. Dag 7: Överföra 10-20 av 2 dagar gamla vuxna transgena djur som bereddes i steg 2.1.2 till plattor som innehåller antingen parakvat, andra av intresse, eller fordon (DMSO). Inkubera transgena djuren vid 20 ° C i 2 dagar.
    5. Dag 9: Förbereda 2% agaros pads (se Kompletterande Material). Lägg sedan till en droplet (10 µL) av 20 mM Levamisol i M9 per block. Immobilisera på transgena djur för imaging, genom att placera dem i M9-Levamisol drop. Placera försiktigt ett täckglas på toppen.
    6. Fånga enda transgena djur med hjälp av en kamera kopplad till ett epifluorescensmikroskop. Förvärva fluorescerande bilder av hela transgena nematoder uttrycker mtRosella i kroppen-väggen muskelceller vid 10 X förstoring5. Spara insamlade bilderna.
    7. Behandla de förvärvade bilderna med ImageJ programvara. Analysera kroppen väggen muskelcellerna ligger i huvudet av masken att undvika autofluorescens i intestinal vävnaden. Mäta den genomsnittliga pixel intensity värde och totalt området för varje fluorescerande bild endast i regionen huvud i varje djur. Att analysera specifika området av intresse:
      1. Välj 'split channel' under 'bild' och 'color' droppa-ned menyn konvertera bilder.
      2. Utnyttja ' freehand' markeringsverktyget för att fånga den fluorescerande intresseområde.
      3. Välj kommandot 'mätning' under 'analysera' droppa-ned menyn och utföra pixel intensitet analys.
      4. Pixel intensitet bör normaliseras genom att dividera intensiteten av den totala areal som analyseras. Vid normalisering, beräkna GFP till DsRed baserat på22.
    8. Använda statistisk analys programvara för att antingen genomföra student t-test (jämförelse mellan två grupper) eller ANOVA (jämförelse bland flera grupper) för statistisk analys med p < 0,05 som betydande5,17 .
  2. Att bedöma mitophagy med samtidig lokalisering mellan DCT-1 och LGG-1
    Obs: DCT-1 är en yttre mitokondriella membranprotein som fungerar som en mitophagy receptor som svar på stress förhållanden, liknande dess förmodade orthologues BNIP3 och NIX/BNIP3L i däggdjur5. Således bedöms mitophagy inledandet av samtidig lokalisering mellan DCT-1 mitophagy receptor och autophagosomal membranprotein LGG-1 (homolog av de däggdjur LC3).
    1. Dag 1: Plocka L4 larver av transgena djur att uttrycka både DCT-1::GFP och DsRed::LGG-1 i kroppen-väggen muskel cellerna5 på en OP50 seedade NGM plattan. Placera 5-10 maskar/3.5 cm platta och Använd minst tre plåtar. Inkubera i nematoder vid 20 ° C.
      Obs: Transgener ligger på separata plasmider och de är inte integrerade i genomet. Plocka upp nematoder som transporterar både rol-6(su1006) och pmyo-2 GFP contransformation markörer. Bara uttrycka transgena maskar med båda contransformation markörer både DCT-1::GFP och DsRed::LGG-1 i kroppen-väggen muskelceller.
    2. Följ anvisningarna från 2.1.2-2.1.5.
    3. Bild enda kropp-vägg muskelceller med hjälp av en kamera kopplad till en confocal Mikroskop5,23. Upptäcka gränserna för hela kroppen-väggen muskelceller och ta z-stack bilder under 63 x förstoring. Högre förstoring kan också användas.
    4. Öppna och bearbeta bilder som förvärvats med programvaran confocal. Initiering av mitophagy indikeras av samtidig lokalisering av mitophagy receptor (DCT-1::GFP) till autophagosomal markör (DsRed::LGG-1). Manuellt mäta Co lokalisering händelser i varje stapel av kroppen-väggen muskel cell5. Det är viktigt att hålla alla Mikroskop och kamera inställningar (objektiv och förstoringsglas, filter, exponeringstid, upplösning, laser intensitet, vinst, etc.) konsekvent genom hela experiment. Alla inställningar bör noteras.
    5. Använda statistisk analys programvara för att antingen genomföra student t-test (jämförelse mellan två grupper) eller ANOVA (jämförelse bland flera grupper) för statistisk analys med p < 0,05 som betydande5,17 . För dubbelriktad jämförelser använda Students t-test (p < 0,05 anses betydande). Använd variansanalysen enda faktor (ANOVA), rättad genom post hoc Bonferroni test för multipla jämförelser. Vi rekommenderar att analysera minst 50-70 djur eller 30-50 kroppen-väggen muskelceller för varje experimentella villkor. Upprepa experimentet minst tre gånger.

3. Påvisande av Mitophagy i möss

Obs: Föregående metoder att upptäcka mitophagy i möss var besvärliga, okänslig och svårt att kvantifiera. En transgen musmodell uttrycker mitokondrie-riktade form av fluorescerande reportern Keima kan (mt-Keima) nu användas för att bedöma nivåerna av mitophagy i en lång rad fysiologiska och patofysiologiska förhållanden.

  1. Euthanize möss använder ett protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén14.
  2. Trygga musen (ventrala sidan uppåt) till arbetsplattformen med pinnarna i armar och ben. Gör ett snitt i bukens nedre del med mikrokirurgi sax och pincett för att exponera levern24. Skär en bit av levern (t.ex., en bit av höger lob på 1 × 1 × 1 cm) med hjälp av microsurgery sax och pincett.
    Obs: Påvisande av mitophagy i möss är komplicerade och kräver kunskaper på mus anatomi och mycket skicklig mus hantering och mus kirurgi. Det här protokollet ger grundläggande, viktiga steg på den här metoden, och en mer detaljerad metod är tillgänglig24.
  3. Placera lever provet på en metallplatta på is svalna snabbt vävnaden. Hålla vävnaden på kall metallplattan och bearbeta så snabbt som möjligt. Optimalt, Använd inom 1 h av dissektion.
  4. Lyft lever provet med böjda pincetten och skölj med 5 mL iskallt 1 x PBS.
  5. Överföra levern till en petriskål (Ø 100 mm) på is med sked slutet av en spatel.
  6. Skär lever provet för hand i 0,5-1 mm tjocka sektioner med singel-kant blad.
  7. Noggrant överföra avsnitten vävnad till en glas botten maträtt med mikrokirurgi pincett.
  8. Noga ange avsnittet lever med pincett platta på undersidan.
  9. Täcka skivad levern med 3-5 droppar kallt 1 x PBS.
    Obs: DAPI färgning rekommenderas att identifiera regionen av intresse i vissa vävnader (t.ex., hjärnan)24. För att validera samtidig lokalisering av röd mt-Keima signalen med lysosomen, kan lysosomala färgämnen, såsom dextran cascade blå och lysosensor, vara begagnade24.
  10. Bild på vävnadssnitt under konfokalmikroskopi via två sekventiella excitationer24. Ange två imaging kanaler: ”gröna” mt-Keima kanal (excitation 458 nm, emission 570-695 nm intervall) och ”röd” mt-Keima (excitation 561 nm, emission 570-695 nm räckvidd). Upprätthålla imaging inställningar mellan experimentella förhållanden. För effektivare imaging, analysera två djur på en gång.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Påvisande av Mitophagy i mänskliga celler:

Använda proceduren presenteras här, var mänskliga HeLa cells transfekterade med mt-Keima plasmid. Friska celler visat ett välorganiserat mitokondriell nätverk (GFP, 488 nm) med några incidenser av mitophagy (RFP, 561 nm). Dock celler förbehandlats med en mitokondriell uncoupler FCCP (30 µM för 3 h) uppvisade en djupgående ökning i mitophagy incidens (figur 1A). Mitophagy mättes också med samtidig lokaliseringen mellan LAMP2 och COXII (figur 1B).

Påvisande av Mitophagy i C. Elegans

Vi har granskat den kropp-väggen muskel celler av transgena nematoder uttrycker DsRed smält med LGG-1 och antingen mtRosella eller DCT-1 smält med GFP normala och mitophagy-inducerande villkor såsom oxidativ stress. Transgena djur utsattes för parakvat (8 mM för 2 dagar). Mitophagy induktion indikeras av minskad GFP/DsRed förhållandet mellan mtRosella fluorescens (figur 2A). Dessutom innebär förhöjda antalet samtidig lokalisering händelser mellan DCT-1::GFP och DsRed::LGG-1 signaler mitophagy stimulering i svar till oxidativ stress (figur 2B).

Påvisande av Mitophagy använder mt-Keima möss:

Imaging analys av in-vivo mitophagy ger inblick i mitophagy i normala och patofysiologiska förhållanden. Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, kan mitophagy förekomst i olika organ vävnader, såsom levern och lillhjärnan (figur 3), visualiseras med confocal mitophagy.

Figure 1
Figur 1. Olika metoder för att utvärdera mitophagy i mänskliga celler. (A) mänskliga HeLa celler var transfekterade med mt-Keima plasmid i tre dagar, följt av imaging på båda 488 nm och 561 nm. Som positiv kontroll behandlades ceflls med FCCP (30 µM) 3 h före till imaging. (B) bilder av mänskliga primära fibroblaster fläckade LAMP2 (RFP) och COXII (GFP). (C) bilder av mänskliga fibroblaster färgas med anti-TOM20 (röd) och anti-LC3 (grön)-antikroppar. Staplarna till höger visar avläsningen av mitokondrier Co lokalisering med autophagosomes. Samtidig lokalisering ökas med energisk stress (fritt från glukos galaktosmalabsorption media) och tillägg av lysosomala hämmare E64d och Pepstatin A (EP) för 24 h. representativa skala bommar för (A), (B), och (C) är märkta på sista Figur av varje panel, självständigt. Kvantitativa data visas i medelvärde ± S.E.M. ***p < 0,001; t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. In vivo påvisande av mitophagy i C. elegans. (A) transgena nematoder uttrycker mtRosella i kroppen-väggen muskelceller behandlades med 8 mM parakvat. Mitophagy stimulering kännetecknas av minskad förhållandet mellan pH-känsliga GFP att pH-okänsliga DsRed (n = 50; ***p < 0,001; t-test). Pilspetsar påpeka intestinal autofluorescens. Skala barer beteckna 20 µm. förvärvet Detaljer: exponeringstid, 200 ms; Kontrast, medium. Bilder förvärvades med en 10 X objektiv. Kvantitativa data visas i medelvärde ± S.E.M. värden. (B) transgena nematoder tillsammans uttrycker mitophagy receptor DCT-1 smält med GFP tillsammans med proteinet autophagosomal LGG-1 smält med DsRed i kroppen-väggen muskelceller exponerades för 8 mM parakvat. Mitophagy induktion kännetecknas av samtidig lokalisering av god Jordbrukarsed och DsRed signaler (för varje grupp av bilder DCT-1 visas i grönt på toppen, autophagosomes i rött nedan och en sammanslagen bild längst; n = 30; ***p < 0,001; t-test). Salu barer beteckna 20 µm. förvärvet Detaljer: upplösning, 1 024 X 1 024; Master få, Track1: 562 och Track2: 730; Utsläpp filter, Track1 Channel1: 639 nm och Track2 Channel2: 519 nm. Laser intensitet, Track1 (543 nm): 12,9% och Track2 (488 nm): 39,4%. Bilder förvärvades använder ett 40 X-objektiv. Kvantitativa data visas i medelvärde ± S.E.M. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. In vivo påvisande av mitophagy i mt-Keima transgena möss. Representativa bilder av mt-Keima signaler i levern (övre) och lillhjärnan området (inklusive Purkinje celler, nedre panelen) en mt-Keima-mus (458 nm, grön; 561 nm, röd). Skalstapeln betecknar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Noggrann mätning av mitophagy är tekniskt krävande. Här har vi presenterat flera robust teknik som möjliggör för både kvalitativ detektion av mitophagy och kvantifiering av mitophagy nivåer i de vanligaste laboratorium experimentella modellerna.

Att förvärva replikerbara data, en experimentell design med minst tre biologiska upprepningar är nödvändigt. Alla forskare i experiment och analys måste vara blinda för experimentella gruppen identiteter. Dessutom skall imaging fält slumpmässigt väljas under bild förvärv. Cellodling och C. elegans studier, ska minst tre biologiska repetitioner utföras. För mt-Keima mus studier, är det rekommenderat att använda ett tillräckligt antal möss för att uppnå statistisk signifikans. Analysera 30-100 celler för varje experiment för däggdjursceller och köra minst 3 olika experiment. Kvalitetskontroll i dessa steg kan replikerbara resultat. Påvisande av mitophagy i jäst nyligen har sammanfattat någon annanstans25.

Det finns flera kritiska steg i in vitro- mitophagy detektering tekniker. Transfection effektivitet, vilket beror på kvaliteten av reagenser och DNA används, är avgörande under transfection av mt-Keima protein. Optimering av transfection effektiviteten i olika förhållanden (t.ex., använder olika cellinjer) är alltså nödvändiga. LAMP2/COXII metoden, antikropp specificitet och optimal primär antikropp utspädning fold påverka kvaliteten på bilderna och bör testas innan början experiment. Detsamma gäller för hög-innehåll tänkbar metod, där antikroppar kvalitet och utspädning är avgörande. Automatiserad mikroskopi systemet och anpassade analys protokollet tillåter för bildhantering och analys av minst 1 500 celler/tillstånd, vilket gör resultaten extremt robust jämfört med andra i vivo imaging metoder. Dessutom ger analys protokollet data på ytterligare mitokondriell parametrar såsom längd- och totalt område utifrån cell för cell, som är mycket användbara i mitophagy forskning.

I vissa fall rekommenderas det inte till assay colocalization av LAMP2 med mitokondriell yttre membranproteiner såsom TOMM20. Ett mycket tidigt skede av mitophagy innebära Parkin-medierad ubikvitinering av mitokondriell yttre membranproteiner, inklusive TOMM20 och Mitofusin 1 (MFN1). Parkin konjugat flera olika ubiquitin kedja kopplingar på dessa proteiner inklusive K48-länkade ubiquitin kedjor, som främjar nedbrytningen av protein av 26S proteasom. Därför kan dessa ubiquitineras mitokondriella yttre membranproteiner fortfarande brytas även om mitophagy är blockerade6. Detta kan förvränga data, vilket leder till falskt positiva i tolkning av övergripande data. Dessutom, eliminering av mitokondrie-DNA (mtDNA nucleoids) är en andra indikator på mitophagy, och det kan kvantifieras genom immunofluorescens använder en anti DNA antikropp6.

Vissa kritiska steg för övervakning i vivo mitophagy i C. elegans är listade nedan:

1. överföring av transgena djur till nya plattor varje 24 – 48 h rekommenderas att undvika utväxten av avkomma, vilket leder till en blandad befolkning eller svält, som i sig kan utlösa mitophagy. Icke-svalt nematoder bör därför användas.

2. Levamisol är en mild bedövningsmedel som används för att immobilisera nematoder. Undvika bedövningsmedel som kan påverka mitokondriell aktivitet, till exempel natriumazid. Natriumazid blockerar komponenter i kedjan mitokondriell respiratoriska och perturbs energiproduktion, leder till mitokondrie och oxidativ stress. Natriumazid är således sannolikt att utlösa mitophagy.

3. exemplar bör inte tillåtas att torka ut under mikroskopisk undersökning. Därför rekommenderas användning av M9 buffert istället för vatten att garantera gynnsamma osmotiska förhållanden.

4. intestinal autofluorescens ökar med åldern i C. elegans. Kroppen-väggen muskelceller nära tarmen bör således undvikas under mikroskopisk undersökning.

5. om parakvat inte inducera mitophagy: a. öka parakvat exponeringstid på maskar, b. ökning parakvat koncentration eller c. förbereda en fräsch fungerande lösning av parakvat eftersom dess effektivitet minskar med tiden.

6. om ökade matricidal kläckning observeras i worms utsätts för parakvat, antingen: a. minska parakvat behandlingsperioden, b. minska parakvat koncentration, c. tillägg plattor med fluorodeoxyuridine (FUdR) (slutlig koncentrationen av 100-400 μM), en hämmare av DNA-syntes som förhindrar ägg kläckning, eller d. genomföra experimentet i äldre worms (t.ex., 4 dagar gamla maskar).

Denna procedur beskriver stegen för imaging mitophagy i levern med mt-Keima transgena möss, som visas i figur 3. Andra vävnader än hjärnan och levern har analyserats med hjälp av mt-Keima system14. Dual-magnetiseringen baserat imaging i levern vävnader erhålls via två sekventiella excitationer. Alla bilder måste erhållas från färska exciderad organ. Vävnader som undersökt bör hållas kallt och bearbetade så snabbt som möjligt. Lever skivor kan erhållas i alla åldrar. När imaging mitophagy, optimera laser befogenheter och exponering tider för varje orgel under Mikroskopisk analys. Lasereffekt bör fastställas på den lägsta utdata som tillåter tydlig visualisering av mt-Keima signal14. Det finns dock vissa begränsningar för mt-Keima transgena möss. På grund av instabiliteten i Keima liksom förlusten av en pH-gradient över lysosomala membranet under fixering passar denna musmodell inte för cryo-snittning och immunohistokemi. En annan begränsning är att mt-Keima, eller matris aggregat av detta protein, kan påverka okänd mitokondrie eller cellulära funktioner, även om det inte ändra mitokondriell syre förbrukning hastighet14. Dessutom göra tiden och kostnaderna associerade med mt-Keima möss det mindre önskvärt för hög genomströmning analys än de ovannämnda cellkultur och C. elegans metoder. Andra sätt att kvantitativt studera mitophagy i mt-Keima möss ingår förutom de metoder som nämns här, Western blot eller FACS. Att notera, förutom mt-Keima transgena möss, det är en annan mitophagy musmodell, den ”mito-QC”, en transgen musmodell med en pH-känsliga fluorescerande mitokondriell signal26. På grund av komplexiteten och dynamiken i mitophagy, rekommenderar vi att kombinera ovannämnda fluorescens metoder med andra gemensamma mitophagy upptäckt metoder, såsom elektronmikroskopi och Western blotting, för att stärka resultaten.

Utvecklingen av nya mitophagy detektering tekniker såsom de som anges här kommer att ha breda applikationer, från mekanistiska studier av mitophagy till hög genomströmning drog skärmar. Det bör noteras att mitophagy påverkas lätt av både endogena och exogena svängningar (t.ex., cell kultur förhållanden såsom cell densiteten, svält, hypoxi, etc.) 1 , 5 , 8. därför är det avgörande att samma experimentella villkor bibehålls för alla experiment. Det är viktigt att använda en kombination av olika mitophagy identifieringsmetoder i både in vitro- och in-vivo studier för att kontrollera den rätta tolkningen av mitophagy status. Vidare förståelse av mekanismerna bakom mitophagy, uppnås genom tekniker som nämns häri, kommer att möjliggöra utvecklingen av nya, mer precisa metoder för mitophagy upptäckt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bohr laboratoriet har CRADA arrangemang med ChromaDex och GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Atsushi Miyawaki och Dr. Richard J. Youle för att dela mt-Keima plasmiden och mt-Keima integrerat Hela cells. Vi tackar Raghavendra A. Shamanna och Dr. Deborah L. Croteau för den kritiska behandlingen av manuskriptet. Denna forskning stöddes av intramurala forskningsprogrammet av NIH (VAB), bevilja National Institute on åldrande, samt en 2014-2015 och en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EFF, VAB). EFF stöddes av HELSE SOR-OST RHF (projekt nr: 2017056) och av Norges forskningsråd (projekt nr: 262175).

FÖRFATTARE BIDRAG:

EFF konstruerade manuskriptet och iordningställda utkastet. KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH och ED skrev olika avsnitt av papper; NT, JP, HN och VAB reviderade manuskriptet och förutsatt kompetens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61, (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163, (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521, (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524, (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40, (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16, (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22, (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40, (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 15, Unit 15 16 (2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60, (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157, (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25, (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7, (7), e2215 (2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12, (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214, (3), 333-345 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics