Author Produced

Sammansättning och egenskaper Aquafaba: vatten återvinns från kommersiellt konserverade kikärter

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Aquafaba är en trögflytande saften från konserverade kikärtor som, när rörde kraftigt, producerar en relativt stabil vita skum eller skum. Primär forskning målet är att identifiera de delar av aquafaba som bidrar med viscosifying/förtjockning egenskaper med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR), ultrafiltrering, elektrofores och peptid massa fingeravtryck.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shim, Y. Y., Mustafa, R., Shen, J., Ratanapariyanuch, K., Reaney, M. J. T. Composition and Properties of Aquafaba: Water Recovered from Commercially Canned Chickpeas. J. Vis. Exp. (132), e56305, doi:10.3791/56305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kikärtor och andra baljväxter säljs vanligen som konserverade produkter förpackade i en tjock lösning eller en saltlake. Denna lösning har nyligen visat att producera stabilt skum och emulsioner och kan fungera som förtjockningsmedel. Intresse för denna produkt har nyligen förbättrats via internet där det föreslås att denna lösning, som nu kallas aquafaba av en växande gemenskap, används en ersättare för ägg och mjölk protein. Som aquafaba är både nya och utvecklas av ett internet-baserat samhälle lite är känt om dess sammansättning eller egenskaper. Aquafaba återfanns från 10 kommersiella konserverade kikärtor produkter och korrelationer mellan aquafaba sammansättning, densitet, viskositet och löddrande egenskaper undersöktes. Proton NMR användes för att karakterisera aquafaba sammansättning före och efter ultrafiltrering genom membran med olika molekylvikt cut offs (MWCOs 3, 10 eller 50 kDa). Ett protokoll för elektrofores och peptid massa fingeravtryck är också presenteras. Dessa metoder som värdefull information om komponenter ansvarar för aquafaba funktionella egenskaper. Denna information gör att utvecklingen av praxis att producera standard kommersiella aquafaba produkter och kan hjälpa konsumenterna att välja produkter av överlägsen eller konsekvent nytta.

Introduction

Alltmer vegetariska produkter utvecklas som efterliknar egenskaperna för kött, mjölk och ägg. Pulser funktionella egenskaper är viktiga i deras nuvarande användning i livsmedelsapplikationer och deras egenskaper utforskas i utvecklingen av ersättare för animaliskt protein. Exempelvis mejeriprodukter alternativ försäljningen var $8,80 miljarder USD under 2015 och denna marknad växer snabbt. Denna marknad beräknas växa till 35.06 miljarder dollar år 2024. Dessutom är den uppåtgående trenden i efterfrågan på växtbaserad mjölkersättning delvis ett resultat av konsumenternas hälsa oro angående kolesterol, antibiotika och tillväxthormoner som ofta används i mjölk produktion1. Likaså, vegetabiliskt protein och Hydrokolloid egg replacer marknader växande snabbt och en förening årlig tillväxt på 5,8% väntas för dessa material under de kommande 8 åren med en omsättning på 1,5 miljarder USD i 20262. Ett växande antal konsumenter föredrar veganska proteinkällor, allergen minskat kost och minskad klimatpåverkan för livsmedelsprodukter. Efterfrågan på puls-baserade produkter, särskilt från linser, kikärtor och faba bean växer stadigt tack vare hög proteinhalt, kostfiber och låg mättat fett halten av pulser3. Baljväxter innehåller även fytokemikalier med potentiellt gynnsamma biologiska aktivitet4.

Kommersiella enheter, forskare och privatpersoner tagit olika tillvägagångssätt att kommunicera kvalitetsegenskaper av kikärtor baserat ägg och mjölk ersättare. Gugger et al. 5 gav en mjölk-liknande produkt från hög stärkelse korn inklusive Adukibönor och kikärtor. I deras beskrivna metoder försökte förespråkarna Visa att deras produkt är unikt och skiljer sig från ”aquafaba”6. I en annan kommersiell strategi klarlagd av Tetrick o.a. 7 en växtbaserad ägg substitut utvecklades. Sin patentansökan beskriver metoder för att kombinera puls mjöl med kända förtjockningsmedel som emulerar funktionen av äggvita i bakad material. Typiska formler inkluderar 80-90% puls mjöl och 10-20% förtjockning tillsatser.

Granskade litteratur också anger funktionen möjligt med kikärtor och har visat att albumin protein fraktioner erhålls från kabuli och desi kikärtsmjöl har bra emulgering egenskaper. De har också funnit en signifikant effekt av kikärtor källa på albumin kapacitet och prestanda8.

Efter den första internet-rapporten som beskriver ”aquafaba” av den franska kocken Joël Roessel, visar en öppen källkod rörelse nyttan av aquafaba som ersättning av äggvita och mjölk protein i många mat-program. Det finns många mycket besökta webbsidor och YouTube-videor som visar införlivandet av aquafaba i livsmedel som emulerar kvaliteterna av isen grädde, maräng, majonnäs, ost, äggröra, och vispad grädde. De flesta pionjärer att tillhandahålla öppen källkod aquafaba (recept) få sitt material genom att sila konserverade kikärter och använda vätskan i sina recept. Dessa individer är oftast inte utbildade forskare. Video kommentarer avsnitt visar att respondenterna har kopierat recept och några har misslyckats med att replikera aquafaba förespråkare framgångar.

Alla tre metoder (corporate, vetenskapliga och öppen källkod) att utveckla ägg och mjölk ersättare har meriter men saknar en viktig dimension. Tillämpad forskare, grundläggande forskare och privatpersoner utfärda puls-baserade produkter har ofullständigt kännetecknas och standardiserade deras insatsmaterial. Standardisering av en produkt för en särskild användning är en normal industriell praxis. Kikärt sorter har inte standardiserats för aquafaba kvalitet och industriella konservering praxis standardiseras för att producera konsekventa kikärter inte aquafaba.

Baserat på studier av andra råvaror, är det förutsägbart att både genotyp och miljö kommer att bidra till puls aquafaba kvalitet. Det är känt att både genotyp och miljö påverkar kabuli kikärtor konservering boenden9. Genotypisk effekter är vanligtvis stora mellan besläktade arter och mindre inom medlemmar av en art. Variation i fysikaliska och kemiska egenskaper kan minimeras genom identitet bevarande som gör urvalet av sorter med önskade egenskaper. Miljöpåverkan kan även vara stora och hanteras av kvalitetsbedömning och blanda till standard prestanda i specifika tester10.

I området i närheten finns det många genetiskt distinkta sorter av kikärtor i kommersiell produktion. För exempel, University of Saskatchewan gröda utvecklingscentrum, en viktig källa till kommersiella kikärtor arvsmassa, släppt 23 kikärtor sorter sedan 1980 varav 6 för närvarande rekommenderas för odling i Kanada. Medan vetenskapliga manuskript beskriver ofta den sort som används i en studie, visade inte de patent och internetsidor som tillfrågades sorten används eller härkomsten för kikärterna. Standardiseringen av sorter och hantering kan hjälpa användare att öka sin framgång i att använda kikärtor men denna information är inte tillgänglig på konserverade kikärtor produkter.

Syftet med denna forskning är att bestämma de aquafaba komponenter som bidrar löddrande egenskaper. Här, reologiska egenskaperna för aquafaba från kommersiella kikärtor märken jämfördes och kemiska egenskaper studerades av NMR, elektrofores och peptid massa fingeravtryck. Till vår kunskap är detta den första forskning som beskriver den kemiska sammansättningen och de aquafaba viscosifier komponenterna funktionella egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Separation av Aquafaba från kikärter

  1. Få burkar av kikärtor från lokala livsmedelsaffär och öppna med en manuell konservöppnare.
  2. Etiketten burkar från A-j
  3. Separat kikärter från aquafaba med hjälp av en rostfri maskor kök sil och väga separerade kikärter och aquafaba.

Få ett representativt urval av kikärter och Aquafaba för kemisk analys.

  1. Välj slumpmässigt ut tio kikärter tömd på aquafaba för att bestämma vattenhalt.
  2. Placera markerade kikärterna i en snabbtorkande tin och värme vid 100 ± 2 ° C för 16-18 h i torkugn.
  3. Efter torkning, mal kikärterna till ett pulver för vidare användning (t.ex. protein och kol innehåll analys).
  4. Frysa aquafaba och aquafaba skum från varje källa till-20 ° C och sedan torka i en frysning torktumlare. Den torkade aquafaba kommer att användas för bestämning av kväve och kol innehåll.

Aquafaba funktionella egenskaper

  1. Bestämma aquafaba viskositet vid 25 ° C med en nr 2 skal kopp.
    1. Doppa i shell cup i aquafaba.
    2. Registrera den tid som krävs för att dränera cup11. En timer är började när koppen var lyfte från aquafaba och stannade när strömmen lämnar koppen stannar.
    3. Aquafaba viskositet kan fastställas genom ett diagram som medföljer den cup som relaterar viskositet och dränering tid.
  2. Skummande kapacitet
    1. Blanda aquafaba lösningen (100 mL) i en rostfri skål med en hand mixer på hastighetsinställning 10 i 2 min.
    2. Spela in skum volymen omedelbart efter blandning 100 mL av den aquafaba lösningen som Vf100 genom att placera skum i en graderad mätkopp.
    3. Låt skummet att stå och torka över tid att observera skum stabilitet och få ett urval av torkat skum.

Färg parametrar av kikärtor utsäde

  1. Välj slumpmässigt kikärtor utsäde från varje kan för bestämning av färg.
  2. Kalibrera den Hunter lab kolorimeter med vitt, svart och referens standarder före mätningar.
  3. Färg koordinatvärden bestäms av CIE Lab system12, inklusive L (positiv representerar vitt och 0 representerar mörka), en (positiv är röd och negativa är grön), och b (positiva är gul och negativa är blå) i tre exemplar med den ljusa dagen 65°.

Protein och kolinnehåll

  1. Fastställa protein och kol genom förbränning med hjälp av en elementär analyzer13. Proteinhalt uppskattas kvävehalt multiplicerat med 6,2514.

Vattenhalt

  1. Fastställa utsäde och aquafaba fukt genom upphettning av prover vid 100 ± 2 ° C i 16-18 h i ett torkning ugn15.

NMR spektrometri

  1. Provberedning
    1. Innan spektrometri, Centrifugera aquafaba prover vid 9200 × g i 10 min. Efter centrifugering, passera supernatanten genom ett 0,45 µm spruta filter (25 mm spruta filter med polytetrafluoreten (PTFE) membran). Överför aquafaba provet (0,4 mL) till en NMR tube värdt 50 mg lagt till deuteriumoxid inuti och ämne provet för NMR analys.
    2. För torkade skum provet tidigare beskrivits, provet (25 mg) i deuteriumoxid (500 mg) och lösningen är föremål för NMR analys.
    3. Placera alla prover för 13C-NMR och 1H-NMR i utjämnade 5 mm NMR rör. Lägga till deuteriumoxid och 3-(trimetylsilyl) syra natriumsalt i propionsyra-2,2,3,3-d4 (TMSP) till varje NMR röret ger en lösningsmedel lås signal och fungera som en intern standard, respektive.
  2. NMR villkor
    1. Förvärva proton NMR spectra med en 500 MHz NMR eller liknande höga fält NMR spectrometeren) med minst 16 scanningar per spektrum med en vatten dämpning program såsom dubbelpuls fältet gradient snurrandet ekar proton NMR (DPFGSE-NMR) puls sekvens16.
    2. Justera det spektrala skiftet för att placera den TMSP toppen vid 0 ppm sedan använda programvaran integration för att bestämma relativa mängder av föreningar som finns.

Elektrofores

Obs: I detta steg måste valdes aquafaba som gav det mest stabilt skummet (märke H). Detta märke innehåller inte salt.

  1. Provberedning
    1. Införa aquafaba den övre behållaren av tre centrifugal regenererad cellulosa ultrafiltrering enheter varje med olika molekylvikt cut offs (MWCOs) 3, 10 eller 50 kDa.
    2. Placera de centrifugal filterenheter i en lämplig Centrifugera vid 4 ° C och centrifugera vid 3900 × g i 2 h för att erhålla supernatanten och retentate fraktioner. Supernatant fraktioner användes för 1H-NMR analys av mindre molekyler i avsaknad av högre molekylvikt (MW) arter. 3 kDa membran retentate bråket användes för elektroforetisk separation som man trodde att detta membran skulle behålla de flesta proteiner.
    3. Uppskatta protein innehållet i båda supernatanten och retenate med en modifierad Bradford metoden med bovint serum albumin som en standard17.
    4. Placera prover av supernatanten och retentate fraktioner i Eppendorf-rör och skakar i en frekvens av 25 per s (10 min) i en lämplig shaker18som omfattas av dessa fraktioner. Observera den skakas lösningen att avgöra om en skum har bildats från skakningar.
    5. Lös retentate genom att lägga till 2,0 mL destillerat vatten till ultrafiltrering enheten för en andra centrifugering-behandling för att uppnå diafilteration. Omfattas ultrafiltrering enheten en andra centrifugering vid 4 ° C och 3900 × g för 2 h.
    6. Blanda i retentate (0,025 g) med 1 mL 0,02 M Tris-HCl pH 7,4 eller fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,4 att upplösa protein.
    7. Centrifugera blandningen vid 21000 x g i 1 min.
    8. Använda supernatanten för att bestämma proteininnehåll med den modifierade Bradford som tidigare nämnts.
  2. Elektroforetisk separation
    Obs: De 3 kDa MWCO membran retentate (beskrivs ovan) utsätts för elektroforetisk separation använder sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE).
    1. Förbereda polyakrylamidgeler med en 15% polyakrylamid lösa gel och en 5% polyakrylamid stapling gel.
    2. Ett urval av 20 µg protein gälla ett körfält av gel och PageRuler Prestained Protein stege med en rad 10-170 kDa till en separat Polyakrylamidgelen lane.
    3. Omfattas av gelerna en elektrisk ström i en mini Protein Tetra Cell system enligt modifierad från Laemmli (1970)19. För elektrofores driftsförhållanden, gel färgning och avfärgning Följ Ratanapariyanuch o.a. (2012) 20.

Peptid massa fingeravtryck

Obs: Klippa band från SDS-PAGE gel av 3 kDa-retentate (MWs av ca 8, 10, 13, 14, 15, 20, 22, 31, 37, 55 och 100 kDa) för trypsin matsmältningen enligt Ratanapariyanuch et al. (2012) 20 och utföra massa spektralanalys.

  1. I-gel matsmältningen
    1. De färga banden två gånger genom nedsänkning i 100 µL av 200 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3) i 50% acetonitril (ACN) och inkubera vid 30 ° C i 20 min.
    2. Efter slutförandet av de färgning, behandla gel proverna med ACN (100 µL) för 10 min och sedan torka under vakuum, använda en centrifugal vakuum evaporator, under 15 minuter vid rumstemperatur.
    3. Fördjupa de torkade gel proverna i 100 µL 10 mM Ditiotreitol (DTT) i 100 mM NH4HCO3 lösning och inkubera vid 56 ° C i 1 h.
    4. Ta bort överflödigt att minska buffert och ersätta det med 100 µL alkylerande buffert [100 mM iodoacetamide i masspektrometri (MS) grade vatten].
    5. Inkubera gel proverna vid rumstemperatur i mörkret i 30 min.
    6. Wash gel prov två gånger med 200 mM NH4HCO3 (100 µL), krympa gelerna genom att doppa dem i ACN (100 µL), åter svälla gelerna med 200 mM NH4HCO3 (100 µL) och igen krympa genom att behandla med ACN (100 µL).
    7. Töm ACN och torka gel proverna under vakuum i en centrifugal vakuum evaporator för 15 min.
    8. Åter svälla torkade gel prover med 20 µL trypsin buffert (50 ng/µL trypsin i 1:1,200 mM NH4HCO3: Trypsin stamlösning) följt av tillägg av 30 µL 200 mM NH4HCO3 till varje prov.
    9. Inkubera prover på en Thermomixer övernattning på 30 ° C med skakningar vid 300 rpm.
    10. Stoppa trypsin matsmältningen reaktionen genom att lägga till 1/10 av den slutliga volym (volymen av blandningen efter steg 8) 1% trifluoracetic syran och extrahera de tryptic peptiderna från gel prover med 100 µL 0,1% trifluoracetic syra i 60% ACN och torr under vakuum med en centrifugal vakuum evaporator.
    11. Lagra tryptic peptider i-80 ° C före massa spektrometriska analys.
  2. Masspektrometri
    1. Bered tryptic peptider genom att tillsätta 12 µL MS grade vatten: ACN: myrsyra (97:3:0.1, v/v) och sedan virvel för 1 till 2 min att upplösa peptider.
    2. Centrifugera den resulterande lösningen vid 18 000 g i 10 minuter vid 4 ° C.
    3. Överför lösningen alikvoter (10 µL) till MS injektionsflaskor för liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys på en quadrupole time-of-flight (QTOF) masspektrometer utrustade med ett instrument för vätskekromatografi och en LC-MS-gränssnitt.
    4. Utföra kromatografiska peptid separation med en hög kapacitet HPLC-Chip: bestående av en 360 nL anrikning kolumn och en 75 µm × 150 mm analyskolonnen, båda packad med C18-A, 180 Å, 3 µm stationär fas.
    5. Läsa in prover på kolumnen berikning med 0,1% myrsyra i vatten med en flödeshastighet av 2,0 µL/min.
    6. Överföra prover från kolumnen berikning till analyskolonnen.
    7. Peptid separationsbetingeiserna är: en linjär övertoning lösningsmedel system bestående av lösningsmedel en (0,1% myrsyra i vatten) och lösningsmedel B (0,1% myrsyra i ACN). Linjära övertoningen börjar med 3% lösningsmedel B som ökar till 25% lösningsmedel B över 50 min. Därefter ökar lösningsmedel B från 25 till 90% över 10 min med en flödeshastighet av 0,3 µL/min.
    8. Förvärva positiva-Jon elektrospray massa spektrala data med hjälp av en kapillär spänning på 1900 V, fragment jonen på 360 V och snabbtorkande gasen (kväve) i 225 ° C med en flödeshastighet av 12,0 L/min.
    9. Samla in spektrala resultat över en massa rad 250-1700 (massa/avgift; m/z) en scan hastighet av 8 spectra/s. samla MS/MS data över en rad 50-1700 m/z och en uppsättning isolering bredd 1,3 atomic mass enheter. Välj topp 20 mest intensiva föregångare jonerna för varje MS skanning för tandem MS med en 0,25 min aktiva uteslutning.
  3. Protein identifiering
    1. Konvertera spektrala data till en massa/kostnad dataformat med Agilent MassHunter kvalitativ analysprogramvara.
    2. Bearbeta data mot UniProt Cicer arietinum (kikärtor) databasen, med SpectrumMill som databas sökmotor.
    3. Inkludera sökparametrar såsom ett fragment massa fel på 50 ppm, en förälder massa fel av 20 ppm, trypsin klyvning specificitet och carbamidomethyl som en fast ändring av cystein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Varje burk kikärtor är märkt för att ange de ingredienser som lagts under konservering. Ingredienser ingår vatten, kikärtor, salt och dinatrium etylendiamin tetraacetic acid (EDTA). Dessutom var två burkar märkt som ”kan innehålla kalciumklorid”. Tre distinkta foder färger observerades; vit, klart gul och metallic (tabell 1).

Varumärket kod Salt Dinatrium EDTA Kalciumklorid Kan slemhinnan
A + Vit
B + Vit
C + + Gul
D Metallic
E + + Vit
F + + Gul
G + + +/ – Vit
H Gul
Jag + + Gul
JANSSON + + +/ – Gul

Tabell 1: Tillsatser och kan slemhinnan.

Märken E och D hade högsta (607 g) och lägsta (567 g) totala massa (kikärter plus aquafaba). Variationskoefficienten (CV) total massa per kan var bara 2%. Varumärket H innehöll den högsta massan som kikärtor (488 g). Varumärket J, med den lägsta kikärtor massan (335 g), var 31% lättare än varumärket H och hade det lägsta antalet frön (244) i varje kan (tabell 2). Varumärket D innehöll lägsta juice volymen i kan (110 mL) medan den högsta juice volymen observerades för varumärket E (225 mL). Den högsta viskositeten observerade, för varumärket H (114,2 cP), var 4,3 till 20 gånger högre än för andra märken (5.7-26,4 cP). Ett antal signifikanta korrelationer observerades som kan förutsäga nyttan av konserverad produkt för att producera aquafaba. Kikärt färsk vikt var negativt korrelerade med juice volym och positivt korrelerade med juice viskositet. Vispa 100 mL aquafaba jämnt ökade skummet med cirka 5 gånger (Vf100 = 470) omedelbart efter blandning med CV på bara åtta procent. Varumärken D, E och G produceras det lägsta beloppet av skum från 100 mL aquafaba. Aquafaba viskositet var negativt korrelerade med totalt skum volym per dosa (Vfcan) (tabell 3). Juice densitet var den minst variabel parametern CV 4,6% medan juice viskositet var den mest rörliga 160%. CV för ärter per kan var 22%.

Varumärket kod Kan innehåll
(g)
Kikärt fwt
(g)
Frön/kan Juice volym
(mL)
Juice densitet
(kg/m3)
Juice viskositet
(cP) 1
Vf100
(mL) 2
Vfcan
(mL / kan) 3
A 588 392 454 170 1067 8,75 ± 0,27f.Kr. 500 850
B 581 355 404 200 1100 8,34 ± 0,17abc 500 1000
C 590 389 289 175 1112 10.50 ± 0,18c 470 823
D 567 428 423 110 1180 26,41 ± 1,14e 410 451
E 607 364 300 225 1066 6.21 ± 0,24ab 405 911
F 602 364 304 220 1048 6.32 ± 0,10ab 480 1056
G 598 349 280 220 1103 5.70 ± 0,13en 430 946
H 595 488 429 125 1160 114,2 ± 4,29f 500 625
Jag 599 385 323 200 1009 16.12 ± 0,64d 500 1000
JANSSON 584 335 244 220 1109 5.79 ± 0,30en 510 1122
Menar 591 385 345 186,5 1095.4 20,84 470 878.4
SD 12 44 74.72 41.17 50,83 33,44 40 204.63
CV4 2 12 21,66 22.07 4,64 160.48 8,5 23,29
1 Varje värde presenteras som den medelvärde ± SD (n = 3). Värden som följt av olika bokstäver är signifikant (p < 0,05).
2 Procent volymökning från spöstraff 100 mL kikärtor juice.
3 Totala skum volym per kan
4 Variationskoefficient (%)

Tabell 2: Kvantitativa värden av kikärtor kan.

Kan innehåll
(g)
Kikärt fwt
(g)
Frön /
kan
Juice volym
(mL)
Juice densitet
(kg/m3)
Juice viskositet
(cP)
Vfcan
(mL / kan) 1
Kan innehåll (g) 1
Kikärt fwt (g) –0.172 1
Frön/kan –0.442 0.664* * 1
Juice volym (mL) 0,600 – 0.878* * – 0.739* * 1
Juice densitet (kg/m3) – 0.647* * 0,519 0.339 – 0.705* * 1
Juice viskositet (cP) –0.002 0.890* * 0.474 – 0.657* * 0.512 1
Vfcan (mL / kan)1 0.483 – 0.818* * – 0.639* * 0.927* * – 0.728* * –0.568 1
1 Totala skum volym från en burk med produkten.
Obs: Det fanns inga signifikanta korrelationer som avser andra parametrar Vf100 .

Tabell 3: korrelationskoefficienten.

Funktionella egenskaper aquafaba från dessa 10 kommersiella produkter, särskilt skum volym och skum stabilitet, varierade avsevärt (figur 1). Den högsta Vfcan inträffade i varumärken B, F, I och J med volymer över 1 000 mL. Den högsta tätheten av juice och lägsta volym ökning förhållandet observerades hos varumärket D. Trots enhetliga avkastningen av skum per 100 mL aquafaba i alla material stabiliteten i skummet varierade kraftigt. Efter 1 h hade vätska separerat från alla produkter utom från märket H (figur 1). Efter en ytterligare 14 h lagring skummet var i stort sett borta från alla märken utom D och H. intressant varumärken D och H hade ett antal särskiljande egenskaper inklusive: 1) de högsta kikärtor massa per kan; (2) den lägsta aquafaba avkastningen per kan; (3) den högsta aquafaba tätheten; och 4) högsta aquafaba viskositet. Etiketterna på produkter D och H visade att inga tillsatser ingår än vatten och kikärter.

Figure 1
Figur 1 : Aquafaba skum och juice från 10 kommersiella kikärter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kikärt frön innehöll 63,2-69,9% fukt och 45,6-46,5% kol (tabell 4). Högsta och lägsta protein innehållet observerades i varumärkena J (22,4%) och B (18,2%), respektive.

Varumärket kod Fukt (%) Kol (%) Protein (%)
A 67,3 ± 0,2cd 46.47 ± 0,01f 19.04 ± 0,18b
B 66,4 ± 0,4f.Kr. 46.24 ± 0.00e 18.24 ± 0,19en
C 67,6 ± 0,2d 45.73 ± 0,01b 18.38 ± 0,07en
D 69,9 ± 0,7e 46.43 ± 0,02f 21.99 ± 0,23f
E 66,8 ± 0,5cd 45.63 ± 0,04en 20.71 ± 0,01d
F 67,1 ± 0,2cd 46.24 ± 0.00e 22,05 ± 0,03fg
G 63,2 ± 0,4en 46.15 ± 0,01de 19,53 ± 0,08c
H 69,3 ± 0,3e 46.49 ± 0,05f 21.53 ± 0,28e
Jag 66,9 ± 1,5cd 46.09 ± 0,09cd 19.82 ± 0,07c
JANSSON 65,4 ± 0,8b 46.04 ± 0,04c 22.37 ± 0,11g
Genomsnitt ± SD (CV) 67,0 ± 1,87 (2,79) 46,20 ± 0,29 (0,63) 20,40 ± 1,57 (7.70)
Varje värde presenteras som den medelvärde ± SD (n = 3). Värden som följt av olika bokstäver är signifikant (p < 0,05).

Tabell 4: Sammansättning av kikärtor utsäde.

Varumärket E hade högsta frystorkad massan (17,9 g) (tabell 5). Aquafaba erhålls från märket D hade det högsta proteinet (26,8%) och kol (39,2%) innehållet och varumärke E innehöll den lägsta proteinhalten (23,3%).

Varumärket kod Frystorkad massa (g) Fukt (%) Kol (%) Protein (%)
A 12,4 94.39 ± 0,02f.Kr. 35.46 ± 0,59de 24.91 ± 0,55cd
B NA 94.06 ± 0,01abc ND ND
C 15,7 94.41 ± 1,89f.Kr. 35.09 ± 0,06cd 22.65 ± 0,30en
D 11 94.07 ± 0,47abc 39.22 ± 0,02g 26,83 ± 0,06e
E 17,9 93.59 ± 0,01ab 31.28 ± 0,12en 23,36 ± 0,19b
F 15,6 94.28 ± 0,02f.Kr. 34.66 ± 0,06c 24.61 ± 0,15cd
G 12,7 94.70 ± 0,03f.Kr. 33.78 ± 0,13b 22.75 ± 0,19ab
H 15,1 92.98 ± 0.00en 37.30 ± 0,10f 24.49 ± 0,26c
Jag 16,3 93.63 ± 0.00ab 35.85 ± 0.00e 23,20 ± 0,02ab
JANSSON 13.1 95.12 ± 0.00c 34.77 ± 0,05c 25,22 ± 0,44d
Varje värde presenteras som den medelvärde ± SD (n = 3) förutom frysa torkade massan. Värden som följt av olika bokstäver är signifikant (p < 0,05). NA = ej tillgängligt. ND = ej fastställt

Tabell 5: Sammansättningen av aquafaba.

Varumärke D hade det högsta L -värdet som är kopplat till utsäde lätthet följt av kikärter av märket H, däremot, varumärket J hade det lägsta värdet som anger att fröet är mörkare (tabell 6). Detta kan relateras till ökade värden av tillagningstid och utsädeskvalitet. Detta kan dessutom vara associerade med fysiska kvaliteten av det resulterande skummet. Det är uppenbart att en lättare produkt är mer önskvärda för användning som förtjockningsmedel.

Varumärket kod L en b
A 58.02 ± 0,96cd 8,64 ± 0,95abc 27.23 ± 1,14ab
B 57.66 ± 1,92bcd 8,66 ± 0,97abc 24.84 ± 1,64en
C 58.45 ± 0,93cde 10.31 ± 0,70d 29.62 ± 2.18b
D 60.49 ± 0,55e 7,95 ± 0,69en 27.74 ± 0,87b
E 55.65 ± 1.16ab 9.92 ± 0,28cd 27.39 ± 0,87ab
F 57,25 ± 0,52bcd 8.51 ± 0,58ab 28.09 ± 1.16b
G 59.02 ± 1,20de (kr) 7,58 ± 0,34en 28.80 ± 1,58b
H 56.63 ± 1,78abc 10.44 ± 0,57d 26.77 ± 0,74ab
Jag 56.25 ± 1,34abc 9.71 ± 1,02bcd 28,87 ± 2.51b
JANSSON 54.94 ± 0,90en 9.34 ± 0,09bcd 28.29 ± 0,64b
Varje värde presenteras som den medelvärde ± SD (n = 3). Värden som följt av olika bokstäver är signifikant (p < 0,05).

Tabell 6: Färg parametrar av kikärtor utsäde.

Protein innehållet i supernatanten ökade när MWCO ökade (tabell 7). När ett 3 kDa MWCO membran användes för aquafaba filtrering, hittades inga protein i supernatanten bekräftar att proteiner finns i kikärtor saften hade MWs större än 3 kDa. Som membran MWCO ökade, observerades vissa proteiner i supernatanten. Retentate efter diafiltration var en gel-liknande pellet, därför det upplöstes i 0,02 M Tris HCl vid pH 7,4 eller PBS vid pH 7,4 buffert.

Fraktion MWCO (kDa)
3 10 50
Supernatanten 0,05 ± 0.00 g/L 0.17 ± 0,01 g/L 0.89 ± 0,01 g/L
Retentate1 0,88 ± 0,01 g/L 1.36 ± 0.00 g/L 0,82 ± 0,02 g/L
1 Retentate upplöstes i 0,02 M Tris HCl vid pH 7,4. Liknande trend och resultat erhölls när PBS vid pH 7,4 användes som lösningsmedel.

Tabell 7: Protein innehåll (g/L) i supernatanten från filtrering varumärke H juice med hjälp av olika MWCO.

Aquafaba från 10 kommersiellt tillgängliga kikärtor produkter var analyseras med DPFSE -1H-NMR. En typisk kommenterade aquafaba 1H-NMR-spektrum avbildas i figur 2. Resonanser av väljare tilldelades enligt de tidigare publikationer21. Sammanlagt 20 föreningar identifierades bland annat alkoholer (isopropanol, etanol, metanol), organiska syror (mjölksyra, ättiksyra, bärnstenssyra, citrat, formate, malat), socker (glukos, sackaros), aminosyror (alaninaminotransferas) och nukleosider (inosin, adenosin).

Figure 2
Figur 2 : Representativa 1 H-NMR spectrumen av regionen totalt i aquafaba. 1, Isopropanol; 2, etanol; 3, mjölksyra; 4, alanin; 5, ättiksyra; 6, glutamin; 7, bärnstenssyra; 8, citrat; 9, malate; 10, kolin; 11, phosphocholine; 12, metanol; 13, sackaros; 14, glukos; 15, β-glukos; 16, α-glukos; 17, sackaros; 18, inosin; 19, adenosin; 20, formate. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De flesta av de 1H-NMR-spektra av aquafaba från kommersiella prover (utom märken E, G och J) visade en triplett på 1,2 ppm från etanol metylgrupp (figur 3). Ättiksyra jäsning i aquafaba kan även verifieras genom acetat signal på 1,95 ppm. Aquafaba från märket F visar hög nivå av mjölksyra (1,35 ppm), medan aquafaba från Visa hög mjölksyra och bärnstenssyra (2.48 ppm). Linne på 3,2 ppm i 1H-NMR spektret för alla aquafaba som undersökt anger förekomsten av kolin. Det är sannolikt att etanol, ättiksyra och mjölksyra produceras under stöpning av kikärterna före konservering. Sackaros, kolin och andra molekyler kan uppstå från kikärter som normala metaboliter.

Figure 3
Figur 3 : 1 H-NMR spectrumen av aquafaba från olika kommersiella produkt. 2, etanol; 3, mjölksyra; 5, ättiksyra; 8, citrat; 9, malate; 10, kolin; och 11, phosphocholine. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att förstå skum sammansättning, 1H-NMR spectrumen av vätskan separeras från skummet efter 12 h från märke A jämfördes med ett spektrum av skum (figur 4). Proton signaler i regionen (5,0-5,4 ppm) var höganrikat i skum spektrumet. Sackaroshalten (3,63 ppm) var större i skum än i vätskan. Flyktiga komponenter såsom metanol (3.40 ppm), etanol (1.20 ppm), mjölksyra (1,35 ppm), ättiksyra (1,95 ppm) och bärnstenssyra (2.48 ppm) minskade i skum lagret, sannolikt på grund av avdunstning. Proton signaler av proteiner (0,5-3,0 ppm, protonsna av alifatiska aminosyror sidokedjan) finns i skummet.

Figure 4
Figur 4 : 1 H-NMR spectrumen av aquafaba skum och juice från märket A. 1, Isopropanol; 2, etanol; 3, mjölksyra; 4, alanin; 5, ättiksyra; 6, glutamin; 7, bärnstenssyra; 8, citrat; 9, malate; 10, kolin; 11, phosphocholine; 12, metanol; 13, sackaros; 14, glukos; 15, β-glukos; 16, α-glukos; 17, sackaros; 18, inosin; 19, adenosin; 20, formate; och *, polysackarid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Aquafaba saften från märket H utsattes för ultrafiltrering med tre olika MWCO membran och 1H spektra jämfördes (figur 5). 10 kDa membranet separerade en uppenbar polynucleotide (6,5-8,5 ppm), medan polysackarider, bidrar topparna av 5.0-5,2 ppm, antogs av 50 kDa membranet. Peptid signaler (0,5-2,5 ppm) upptäcktes i 3 kDa filtratet.

Figure 5
Figur 5 : 1 H-NMR spectrumen av aquafaba genomgått membranfiltrering. 16, α-glukos; 17, sackaros; *, polysackarid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Anrikning av proteiner från produkten H, den som ger det mest stabila skummet av membranfiltrering följd av SDS-PAGE av retentate visade tydliga band av värme lösliga proteiner med MWs större än 3 kDa (figur 6A). Märkligt nog tycktes fem identifierade proteinet band innehåller proteiner från kikärt patogena svampen Didymella rabiei. De flesta av de andra proteinerna tillhörde kända värme lösliga proteiner såsom sena embryogenes riklig proteiner och dehydrins (figur 6B). Identifierade proteiner också omfattade heat shock protein defensin, Histon, icke-specifik lipid transfer protein och superoxid dismutase. Det fanns också stora lagring proteiner provicillin och leguminin.

Figure 6
Figur 6 : (A) SDS-PAGE Separation av kikärtor juice protein; (B) potentiella protein identifiering per band. Fem identifierade proteinet band är markerade. LEAP = sena embryogenes förekommande proteinet, HSP = Heat shock protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna forskning har vi funnit att kikärtor aquafaba från olika kommersiella källor producerar skum som varierar i både egenskaper (volym och stabilitet av skum) och kemisk sammansättning. Det var en positiv korrelation mellan aquafaba viskositet och vattenhalt. Skum volymökning (Vf100) var inte relaterad till dessa parametrar. Tillsatser som salt och dinatrium EDTA kan undertrycka viskositet och skum stabilitet som aquafaba från kikärtor på burk med dessa tillsatser hade lägre viskositet och producerade skum med lägre skum stabilitet. Detta resultat skiljer sig från Behera et al. (2014) 22 där rapporterades det att micellar skum volym minskade i närvaro av salt och att skum kollapsa rate bromsades av salt. Kikärt aquafaba erhållits från kokta med salt hade också högre fukt och lägre kolinnehåll jämfört med aquafaba från kikärtor på burk med salt. Att lägga salt före tillagning kikärtor kan ha begränsad stärkelse och protein svullnad23.

Protein separationer av membranfiltrering följt av SDS-PAGE och peptid massa fingeravtryck visade att aquafaba proteiner var till stor del kända värme lösliga hydrofil arter. Märkligt nog fanns det också bevis av tryptic fragment som föreslog detta material var förorenade med ascochyta fördärv. NMR analysen visade upp till 20 små organiska föroreningar inklusive alkoholer, acetat, mjölksyra och bärnstenssyra. Dessa resultat verkar indikera att jäsning produkter har ackumulerats i aquafaba. Dessa föreningar kan ha producerats av mikroorganismer under stöpning av utsäde före konservering. Proton NMR-spektra av skum och juice som visade att isoflavoner och flyktiga komponenter var närvarande i juice medan skummet innehöll främst polysackarider, sackaros och protein. Också av intresse anger 1H-NMR förekomsten av nukleinsyror (möjligen DNA).

Klart processer används i konservering drabbade aquafaba egenskaper och kvalitet. Det är möjligt att en konsument kan identifiera bättre källor av aquafaba baserat på lösning koncentration. Primärt en källa kan väljas som var konserverade utan tillsatt salt eller EDTA. Efter en kan öppnas kunde konsumenten mäta förhållandet mellan massan av kikärter och aquafaba att bestämma koncentrationen. Dock kunde en tillverkare standardisera bearbetningsförhållandena och producera standardiserade aquafaba som en kommersiell produkt.

I denna forskning peptid användes massa fingeravtryck och 1H-NMR att analysera sammansättningen av aquafaba. Peptid massan fingeravtryck identifierade aquafaba proteiner bidrar till löddrande egenskaper. Termostabiliteten hos de proteiner som identifierades är väl känt. Tekniken tillräckligt kräsna för att identifiera närvaron av proteiner associerade med utsäde svamp organismer. Olika faktorer kan dock påverka resultat24. De kritiska steg är provberedning, protein rening, separation före gelelektrofores, trypsin matsmältning och massa Sök som leder till identifiering. Programvara databassökningar tryptic fragment överväga förekomsten av många peptid ändringar inklusive carbamylated lysin, oxiderade metionin, pyroglutamic syra, deamidated asparagin, fosforyleras serin, treonin och tyrosin som variabel ändringar. De validerade träffarna från tvåstegs analysen är sedan sökte med hjälp av en semi trypsin ospecifika C-terminus och semi trypsin ospecifika N-terminalen. Efter en iterativ analys tillhandahålls validering för peptid och proteiner med en 1% falsk upptäckten hastighet.

Proton NMR användes för att fastställa förekomsten av organiska små molekyler i aquafaba. Flera föreningar har identifierats genom deras spektra. Filtrering och centrifugering av aquafaba prover utfördes för att eliminera olösliga partiklar som kan störa NMR peak former och lägre känslighet. Dessutom anställdes lösningsmedel dämpning att förbättra NMR detektorkänslighet för molekyler som överlappar med bred baslinjen orsakas av stark vatten resonansen.

Proton NMR är ett etablerat verktyg i kvalitetskontroll av livsmedelsprodukter. Jämfört med kromatografiska metoder såsom GC/MS, är LC/UV och LC/MS, 1H-NMR-metoden vanligtvis mindre känsliga. Men denna metod kräver mycket lite prov preparat och uppnår snabba resultat och bred information i en mätning25. Där tillräckligt material är närvarande 1H-NMR är också en mycket pålitlig metod för kvantitativ analys och förtydligandet av kemisk struktur av okänd föreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av de internationella Lärarhögskolans Scholar räddningsfond (IIE-SRF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Freeze Dryer
Stoppering Tray Dryer Labconco Inc. 7948040
Mixer 
Stainless steel hand mixer  Loblaws PC2200MR
Viscosity Measurement 
Shell cup No. 2  Norcross Corp.
Color Measurement 
Colorflex HunterLab spectrophotometer  Hunter Associates Laboratory Inc.
Protein and Carbon Contents 
Elemental analyzer   LECO Corp. CN628
NMR Spectrometry
Spectrafuge 24D   Labnet International Inc.
Syringe filters  VWR International CA28145-497 25 mm, with 0.45 µm PTFE membrane
Deuterium oxide  Cambridge Isotope Laboratories Inc. 7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid sodium salt Sigma-Aldrich 169913-1G
Bruker Avance 500 MHz NMR spectrometer  Bruker BioSpin
TopSpin 3.2 software  Bruker BioSpin GmbH
Electrophoresis 
Regenerated cellulose membrane  Millipore Corp. 3, 10, 50 kDa (MWCO)
Centrifugal filter unit  Millipore Corp.
Benchtop centrifuge  Allegra X-22R, Beckman Coulter Canada Inc.
Mixer Mill MM 300  bead mill  F. Kurt Retsch GmbH & Co. KG
Eppendorf centrifuge 5417C Eppendorf
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813-10PAK
Tris-HCl buffer pH 7.4  Sigma-Aldrich T6789-10PAK
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fisher Scientific
Mini-Protein Tetra Cell system BioRad
Peptide Mass Fingerprinting
Thermo-Savant SpeedVac BioSurplus Centrifugal vacuum evaporator 
Trypsin buffer  20 µL trypsin in 1 mM hydrochloric acid and 200 mM NH4HCO3
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149-5 g
Trifluoroacetic acid  Fluka BB360P050
Acetonitrile Fisher Scientific  L14734
Formic acid  Sigma-Aldrich 33015-500mL
Mass spectrometry vial  Agilent Technologies Canada Ltd.
Agilent 6550 iFunnel quadrupole time-of-flight mass spectrometer  Agilent Technologies Canada Ltd. Agilent 1260 series LC instrument and Agilent Chip Cube LC-MS interface
HPLC-Chip II: G4240-62030 Polaris-HR-Chip_3C18  360 nL enrichment column and 75 µm × 150 mm analytical column, both packed with Polaris C18-A, 180Å, 3 µm stationary phase. 
Agilent MassHunter Qualitative Analysis Software Agilent Technologies Canada Ltd.
SpectrumMill data extractors Agilent Technologies Canada Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, M., Busch, C., Rödiger, M., Hamm, U. Motives of consumers following a vegan diet and their attitudes towards animal agriculture. Appetite. 105, 643-651 (2016).
  2. Cision PR Newswire. Egg Replacement Ingredient Market: Global Industry Analysis and Opportunity Assessment, 2016-2026. Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/egg-replacement-ingredient-market-global-industry-analysis-and-opportunity-assessment-2016-2026-300370861.html (2016).
  3. Joshi, P. K., Parthasarathy Rao, P. Global and regional pulse economies current trends and outlook. IFPRI Discussion Paper 01544. 149 (2016).
  4. Oomah, B. D., Patras, A., Rawson, A., Singh, N., Compos-Vega, R. Chemistry of pulses. Pulse Foods. Tiwari, B. K., Gowen, A., Mckenna, B. Academic Press. Oxford. 9-55 (2011).
  5. Legume-based dairy substitute and consumable food products incorporating same. United States Patent Application. Gugger, E. T., Galuska, P., Tremaine, A. A1 20160309732 (2016).
  6. Aquafaba Science. Available from: http://aquafaba.com/science.html (2016).
  7. Tetrick, J., et al. Plant-based egg substitute and method of manufacture. World Patent. WO 2013067453 A1 (2013).
  8. Singh, G. D., Wani, A. A., Kaur, D., Sogi, D. S. Characterisation and functional properties of proteins of some Indian chickpea (Cicer arietinum) cultivars. J. Sci. Food Agric. 88, (5), 778-786 (2008).
  9. Nleya, T. M., Arganosa, G. C., Vandenberg, A., Tyler, R. T. Genotype and environment effect on canning quality of kabuli chickpea. Can. J. Plant Sci. 82, (2), 267-272 (2002).
  10. Vaz Patto, M. C., et al. Achievements and Challenges in Improving the Nutritional Quality of Food Legumes. Crit. Rev. Plant Sci. 34, 105-143 (2015).
  11. Ratanapariyanuch, K., Clancy, J., Emami, S., Cutler, J., Reaney, M. J. T. Physical, chemical, and lubricant properties of Brassicaceae oil. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 115, 1005-1012 (2013).
  12. Hunter, R. S. Photoelectric color-difference meter. J. Opt. Soc. Am. 48, 985-995 (1958).
  13. Sweeney, R. A., Rexroad, P. R. Comparison of LECO FP-228 'N Determinator' with AOAC copper catalyst Kjeldahl method for crude protein. JAOAC. 70, 1028-1032 (1987).
  14. Boye, J. I., et al. Comparison of the functional properties of pea, chickpea and lentil protein concentrates processed using ultrafiltration and isoelectric precipitation techniques. Food Res Int. 43, 537-546 (2010).
  15. Ratanapariyanuch, K., Shim, Y. Y., Emami, S., Reaney, M. J. T. Protein concentrate production from thin stillage. J. Agric. Food Chem. 64, 9488-9496 (2016).
  16. Ratanapariyanuch, K., et al. Rapid NMR method for the quantification of organic compounds in thin stillage. J. Agric. Food Chem. 59, 10454-10460 (2011).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  18. Burnett, P. G. G., Olivia, C. M., Okinyo-Owiti, D. P., Reaney, M. J. T. Orbitide composition of the flax core collection (FCC). J. Agric. Food Chem. 64, 5197-5206 (2016).
  19. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  20. Ratanapariyanuch, K., Tyler, R. T., Shim, Y. Y., Reaney, M. J. T. Biorefinery process for protein extraction from oriental mustard (Brassica juncea L., Czern.) meal using ethanol stillage. AMB Express. 2, 1-9 (2012).
  21. Lv, Q., Yang, Y., Zhao, Y., Gu, D. Comparative study on separation and purification of isoflavones from the seeds and sprouts of chickpea by HSCCC. J. Liq Chromatogr Relat. Technol. 32, 2879-2892 (2009).
  22. Behera, M. R., Varade, S. R., Ghosh, P., Paul, P., Negi, A. S. Foaming in micellar solutions: effects of surfactant, salt, and oil concentrations. Ind. Eng. Chem. Res. 53, 18497-18507 (2014).
  23. Tan, S. H., Mailer, R. J., Blanchard, C. L., Agboola, S. O. Canola proteins for human consumption: Extraction, profile, and functional properties. J. Food Sci. 76, R16-R28 (2011).
  24. Thiede, B., et al. Peptide mass fingerprinting. Methods. 35, 237-247 (2005).
  25. Hwang, H. S. Application of NMR spectroscopy for foods and lipids. Advances in NMR spectroscopy for lipid oxidation assessment. SpringerBriefs in Food, Health, and Nutrition 11-13 (2017).

Comments

3 Comments

  1. Aquafaba, the water produced by canning chick peas, is widely described on the internet but little is known of its rheology, its cooking properties have not previously been reported in a peer reviewed forum, and it is not known if this material is stable. There is just one peer-reviewed publication using the term aquafaba (Shim et al., 2018).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 15, 2018 - 5:35 PM
  2. Which five bands are from Didymella? The yellow bands or the purple ones?

    Reply
    Posted by: c V.
    February 20, 2018 - 3:49 PM
  3. Thank you for your interest in our paper and for your comments.
    Five accession numbers in yellow highlighting are ones associated with Didymella rabiei. Please visit http://www.uniprot.org/uniprot/A0A163DU27

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 21, 2018 - 8:34 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics