Методы визуализации внутриклеточного рН линии фолликула стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы предоставляем протокол для визуализации внутриклеточного рН линии эпителиальных стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы . Мы описываем методы для создания трансгенных мух, выражая биосенсор рН, mCherry::pHluorin, изображение биосенсора с использованием количественных флуоресценции изображений, создания стандартных кривых и преобразовать значения интенсивности флуоресценции в значениях рН.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Изменения в внутриклеточного рН (фи) играют важную роль в регуляции многих клеточных функций, в том числе метаболизма, пролиферации и дифференцировки. Как правило фи динамика определяются в культивируемых клеток, которые поддаются измерения и экспериментально манипулирования фи. Однако недавнее развитие новых инструментов и методологий, стало возможным для изучения динамики фи в пределах нетронутыми, живой ткани. Для исследования дрозофилы , важным событием стало поколение трансгенные линии, перевозящих биосенсор фи, mCherry::pHluorin. Здесь мы описываем протокол, который мы обычно используют для визуализации живой Drosophila ovarioles для измерения фи в линии эпителия фолликула стволовых клеток (FSC) в mCherry::pHluorin трансгенных дикого типа линий; Однако описанные здесь методы могут быть легко адаптированы для других тканей, включая крыло диски и глаз эпителия. Мы описываем методы для выражения mCherry::pHluorin в линии FSC, поддержания тканей яичника во время живых изображений и приобретения и анализ изображений для получения значений фи.

Introduction

Недавние исследования показали определенную роль для изменения в фи в клеточной дифференциации и Дисплазия в естественных условиях1,2. Эти исследования показали, что что фи удивительно последовательна в клетках того же типа на той же стадии дифференцировки, но что меняется как клетки переход от одной стадии к другой. В некоторых случаях блокировка изменения в фи частично разрушает дифференциации, предполагая, что изменения в фи является не только следствием изменения в ячейке судьба, но вместо этого помогает для содействия изменениям в судьбе ячейки, возможно, путем воздействия на рН чувствительных регулирования белки или химические реакции, необходимые для дифференциации. Будущие исследования имеют потенциал, чтобы выявить больше проницательность в много различных ролей фи динамика в естественных условиях. Однако одна из задач изучения pHi во время дифференциация в естественных условиях является получение точных измерений Пхи-Пхи. В отличие от других функций дифференциации, такие как изменения в клеточной морфологии и экспрессии генов фи является лабильным химические свойства ячейки, не сохраняется в клетках, которые были исправлены и permeabilized с стандартными методами. Кроме того фи не может быть стабильным в клетках, которые подчеркнули или умирают в результате экспериментальных манипуляций. Таким образом важно сохранить клетки жив и здоров, как возможно, когда измерения фи. Несколько жизненно важных красителей доступны, что работает хорошо для измерения фи клеток в культуре3, но во многих случаях они подходят не для в vivo исследований потому, что они не проникать в ткани, глубоко или равномерно достаточно, чтобы обеспечить точность измерений .

Чтобы обойти проблемы проникновения красителя бедных, мы и другие использовали генетически закодированный зонд, mCherry::pHluorin4,5,6,7, которое может быть выражено непосредственно в ячейке типы образов в живых тканей и интерес. pHluorin представляет собой вариант GFP с выше pKa (~ 7.0 против ~ 4.0), более легко складывается при более высоких значениях рН; Таким образом общая флуоресценции интенсивности испускаемого от населения pHluorin молекул в ячейке возрастает с увеличением фи8. Важно отметить, что флуоресценции линейной в нормальном цитозольной диапазоне значений фи. В отличие от флуоресценции mCherry (pKa ~ 4.5) является нечувствительным к изменениям рН в цитозольной диапазоне. Эти два Репортеры ковалентно связаны вместе, как единый химерных белков, кодируемых одной открытой чтении кадра, поэтому они всегда присутствуют в равных количествах. Таким образом соотношение pHluorin к интенсивности флуоресценции mCherry обеспечивает измерение фи, нормируется зонд концентрации в каждой ячейке. Коэффициенты затем может быть преобразован оценкам фи значений с помощью стандартной кривой, создаваемый путем получения pHluorin mCherry коэффициенты из тканей, которые были достижение равновесного уровня, к известным рН.

Здесь мы описываем методы для использования mCherry::pHluorin для измерения фи линии эпителиальных FSC в яичнике дрозофилы . Это хорошо изученных ткани был использован для моделирования много различных аспектов эпителиальных биологии, например стволовых клеток самообновления и дифференциации9,10,11, коллективные клетки миграции12 , развития и поддержания клеток полярности13,14. Эпителий фолликула производится двумя FSCs, находящиеся у переднего края ткани в структуре, называемой germarium15,16. Эти клетки делятся регулярно во взрослом возрасте самостоятельно обновить и производят потомство, называемые prefollicle клетки (ПФУ), которые можно заново ввести нишу и стать FSC или дифференцироваться в один из трех типов клеток различных фолликул: полярные клетки, клетки стебля, или основные клетки фолликула. Мы показали ранее в wildtype ткани, pHi увеличивает устойчиво на ранних стадиях дифференцировки от Пхи примерно 6,8 в FSCs 7.0 в ПФУ, 7.3 в фолликул клетки2. Блокирование это увеличение RNAi нокдаун повсеместно выраженной натрия/Протон теплообменника, DNhe2, серьезно ухудшает ПФК дифференциации, тогда как увеличивая Сверхэкспрессия DNhe2 фи вызывает мягкая избыток дифференциация фенотип. Эти результаты демонстрируют фи стабильно сохраняется в начале линии FSC и что это может быть экспериментально увеличивается или уменьшается в естественных условиях. Методы, описанные здесь может использоваться для измерения фи в wildtype ткани или различные виды мутантов тканей, включая RNAi нокдаун или гиперэкспрессия с помощью Gal4 интерес, и митотического клонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: измерения фи в линии FSC, мы рассчитать коэффициент интенсивности флуоресценции pHluorin к mCherry в FSCs и ПФУ, клетки фолликула в физиологических условиях и преобразовать соотношения в фи значения с стандартом калибровочные кривые для каждой ячейки введите 7. Во-первых, живые изображения являются эксперименты для измерения интенсивности флуоресценции pHluorin и mCherry в germaria, расчлененный в буфер, содержащий NaHCO 3, которая имитирует физиологических условиях 1 , 7. Далее, стандартные кривые формируются путем измерения интенсивности флуоресценции pHluorin и mCherry в Na +-бесплатно, K + буфер, содержащий ionophore nigericin с учетом двух различных рН, 6.5 и 7.5. При наличии nigericin фи уравновешивает с pH буфера через плазматическую мембрану, вызывая фи соответствовать внеклеточного pH. И наконец, стандартные кривые используются для преобразования pHluorin в mCherry соотношения значений оценкам фи.

1. предварительного: подготовка до измерения фи In Vivo

Примечание: измерения фи в естественных условиях, mCherry::pHluorin трансген должны быть выражены в тип ячейки интереса. Ниже приведены несколько распространенных способов создания трансгенных pHluorin летит в линии FSC. Создание клонов mCherry::pHluorin особенно полезен для выявления FSCs, которые расположены на передней кромке клон FSC. Ткани конкретных mCherry::pHluorin выражение полезен для измерения фи по всей ткани и также более удобен при объединении с выражением RNAi или трансген.

  1. Летит поколения трансгенных pHluorin
    1. mCherry::pHluorin меченых FSC клоны
      1. сделать mCherry::pHluorin FSC клоны, крест бла mCherry::pHluorin 1 акт-Gal4 flipout акций или других акций с Flp/FRT индуцибельной Gal4.
      2. Чтобы сделать heatshock индуцибильный клоны, heatshock взрослых F1s за 2 дня пост eclosion в пустые флаконы для 1 h в ванну воды 37 ° C, четыре раза примерно каждые 12 ч.
      3. Для обеспечения нормального роста и максимальных ставок женских в этот период, сохранять мух, предоставляя свежие дрожжи мокрой (примерно равных частей сухой Бейкер ' дрожжи и воду) ежедневно в течение по крайней мере 6 дней после индукции клон.
    2. Ткани конкретных mCherry::pHluorin выражение
    3. крест бла mCherry::pHluorin 1 к фолликул клеток конкретный драйвер, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Блумингтон ID: 7023).
    4. 3 дня после того, как мухи начать eclosing, собрать и поместить их во флаконах, содержащих мокрой дрожжи, по крайней мере за 24 часа до вскрытия.
  2. Принятия решений
    Примечание: важно подготовить следующие буферы в день эксперимента, потому что концентрации рН и массопереноса в буфере могут меняться со временем.
    1. Подготовить бикарбонат, nigericin и рассечение буферов. Добавьте компоненты в порядке перечисленных в том, чтобы избежать образования осадков (см. таблицу 1, в таблице 2 и таблице 3).

2. Триал: Измерения фи в FSC Lineage

Примечание: рассечение, монтаж и жить изображений шаги для буфера бикарбоната и два условия nigericin буфер может необходимо выполнить дважды: один раз, чтобы определить Микроскоп настройки и во второй раз для сбора экспериментальных данных. Смотрите раздел 2.2 ниже для получения дополнительной информации.

  1. Рассечение и монтажа
    Примечание: материалы, необходимые для выполнения этого шага обратитесь к рис. 1 и Таблица материалов. Для 3D печатного монтажа камер 3D принтер файлы предоставляются как дополнительный файл 1 и 2 дополнительных файлов.
    1. Рассечение:
      1. Подготовка монтажа камер, применяя тонким слоем смазки вакуумного на плоской стороне 3D печати монтажа камеры. Место этой стороны на coverslip 22 x 40 мм для уплотнения coverslip для монтажа камеры.
    2. Вскрыть яичников со женский взрослых мух в 500 мкл рассечение буферу (бикарбонат или nigericin, Таблица 3)
      1. анестезировать 3-4 мух с помощью газа CO 2 и передачи летит на лету площадку, увлажненную с CO 2 газ.
      2. Забрать наркотизированных летать с щипцами и место в СМИ диссекции.
      3. Щепотка грудной клетки летать с одной forcep, а дергая на кончике его живота до тех пор, пока ее яичники подвергаются.
      4. После отсоединения яичников от других органов, дразнить друг от друга с помощью иглы для шприцов 22 1/2 ovarioles. Тщательно отдельных мышц оболочка из яичников и отдельных индивидуальных ovarioles из кластера ovarioles. Эффективной техникой изолировать мышечной оболочки является использование одной иглой шприца для хранения кластера ovarioles на месте на своей передней конец и погладить вниз по длине одного ovarioles.
      5. Инкубировать расчлененных яичников в средствах массовой информации рассечение ровно 10 минут прежде чем приступить к этапу установки так, что есть достаточно времени для фи клеток в полной мере сбалансировать с pH nigericin рассечение СМИ.
        Примечание: Убедитесь, что мышечная оболочка удаляется из ovarioles. Мышечная оболочка может смягчить флуоресценции сигнал, что делает его трудно определить отдельные ячейки, используя Concanavilin-A и может вызвать ovarioles переместить спонтанно во время живых изображений.
    3. Установка
      1. место небольшое падение рассечение СМИ на стекло coverslip в камере монтажа.
      2. Передачи отделены с помощью щипцов ovarioles.
      3. Отдельные поздней стадии яйца камеры от germaria, связанные с более ранней стадии яйца камерами и попробуйте обеспечить что расчлененные germaria размещаются в центре падение СМИ рассечение.
      4. Добавить две небольшие капли Лак в противоположных сторонах раунд 12-мм coverslip и дайте ему высохнуть около 10 на воздухе s.
      5. Coverslip
      6. место раунд на падение рассечение сред, содержащих отделены germaria такие что ту сторону с лак обращена вниз и контакты СМИ рассечение. Нажмите вниз на частях края с Лак для выравнивания и защиты germaria в положении. Мы рекомендуем использовать старые лак, потому что она размазывает меньше, на поверхности coverslip, как оно закреплено на месте.
      7. Заполнить монтажной камере с дополнительные рассечение СМИ. Состояния конкретных буфера, не содержащий краситель конканавалина-A может использоваться для заполнения камеры.
        Примечание: Общее время, затраченное рассечения и крепления не должно превышать 15 мин. Это имеет важное значение для сведения к минимуму последствий повреждения тканей и клеточной смерти.
  2. Живых изображений:
    Примечание: В этот шаг, сначала собрать изображения от состояния бикарбоната и два nigericin условия для определения надлежащего Микроскоп параметры; настроить параметры микроскопа при необходимости, а затем собирать образы для экспериментальных данных. Используйте Конфокальный микроскоп способен изображений в 3 канала: GFP (475 возбуждения/509 выбросов), mCherry (575 выбросов возбуждения/610) и far-red (633 выбросов возбуждения/647).
    Примечание: Установить параметры микроскопа: интенсивности пикселей изображения, собранные будет количественно определить оценки фи, поэтому важно, что значения интенсивности сигнала в каждом наборе изображений является слишком низким, ни насыщенных. Спектр света, которые могут быть захвачены в изображении определяется битовую глубину изображения. Во многих случаях 8-битные изображения создаются по умолчанию, но мы рекомендуем приобретать данные как 16-битные изображения, которые имеют более широкий динамический диапазон. Важно, чтобы убедиться, что перекрестных помех между флуоресцентные каналы сводится к минимуму, поэтому параметры следует скорректировать таким образом, что спектр излучения собранные от каждого Флюорофор не перекрываются. Эти параметры тестирования, взять пример изображения с помощью спектр возбуждения, характерный для GFP и собирать в спектре излучения для mCherry и наоборот. Если параметры были скорректированы надлежащим образом, в любом случае должно быть не сигнал. Установите параметры микроскоп (то есть, параметры напряжения на лазерное сканирование конфокальный, лазерной энергии и точечным размер), так что пиксель интенсивности сигнала во всех наборах три изображения находятся в динамический диапазон файла изображения. Для всех наших экспериментов мы использовали белый свет лазерного сканирования Конфокальный микроскоп с 40 x цель приобрести 16-битные изображения в 1024 × 1024 формате, в то время как мы оптимизировали усиления напряжения для каждого эксперимента, при необходимости. Например, в одном эксперименте, мы устанавливаем усиление напряжения для GFP, mCherry и far-red как 37,8%, 72,9% и 260%, соответственно.
    1. Ovarioles в nigericin рассечение буфера при pH 6,5 изображение и настроить параметры таким образом, чтобы интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry являются низкими, но не ниже пределов обнаружения камеры.
    2. Изображение другой набор из ovarioles в nigericin рассечение буфера при pH 7.5 и настроить параметры таким образом, чтобы интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry высокий, но не насыщенными.
    3. Изображений яичников в бикарбонат рассечение буфер и убедитесь, что интенсивность пикселя изображений pHluorin и mCherry не насыщен выбранной настройки. Если точки насыщения, настроить параметры при необходимости.
      Примечание: Микроскоп, параметры могут различаться на основании точного Микроскоп установки используется и должны быть оптимизированы для каждого эксперимента. После того, как Микроскоп настройки, не изменяйте их на оставшуюся часть эксперимента. Параметры должны соответствовать управления и экспериментальных условиях. В наших экспериментах первоначальный фи мы созданы 2 и 3 точки nigericin калибровочных кривых и нашел никакого существенного различия между вычисляемые фи, с использованием либо метода. Однако в целом, добавление больше очков в калибровочной кривой будет ожидать для повышения точности. Поэтому, мы рекомендуем создание кривых с разным количеством точек, чтобы определить, сколько необходимо для данного набора экспериментальных условий.
  3. Сбора данных:
    1. выполнения диссекции, монтаж и изображений образцов в условиях буфера бикарбоната и nigericin. После рассечения и монтажа, максимальное время, затраченное изображений один комплект образцов не должно превышать 45 мин для обеспечения измерений интенсивности флуоресценции в живой, здоровой ткани.
    2. Для каждого условия, приобрести изображений для по крайней мере 5 germaria.

3. После суда: Анализ изображений

  1. мера интенсивности флуоресценции FSCs, ПФУ, и клетки фолликула
    1. фон вычитание:
      1. Открыть необработанных изображений в Фиджи с каждым каналом в отдельном окне ( Рисунок 4 c).
      2. Использовать инструмент прямоугольник для рисования региона интерес (ROI) в окне канала pHluorin в части изображения без сигнала.
      3. Необязательный шаг: установить нижний предел порога, так что пикселей с значения интенсивности ниже фон исключены и установить верхний предел порога максимума. Когда порог устанавливается таким образом, области изображения без сигнала в основном синий и сигнала отчетливо видна ( рис. 4A).
      4. Мера средней интенсивности флуоресценции в ROI. Если на шаге 3 был установлен порог, не забудьте проверить " предел порога " поле в диалоговом окне задать измерения.
      5. Вычесть измеренных фон интенсивности от каждого канала и фрагмент изображения, используя функцию вычитания, найденных в процессе → математике меню.
      6. 3.1.1.2-6 повторить шаги для окна канала mCherry Кроме того, в шаге 3.1.1.2, вместо рисования новый прямоугольник с инструмент прямоугольник, используйте функцию восстановления выбора, в Edit → выбора меню, чтобы добавить прямоугольник с тем же размеры и положение на изображении.
    2. Определить FSCs, ПФУ и клетки фолликула:
      1. определить FSCs, ПФУ и клетки фолликула, морфология и местоположение с помощью окрашивания конканавалина А найти границы ячейки ( рис. 2).
      2. FSCs являются тонкие треугольные клетки, расположенные на краю germarium на границе региона 2a/2b. Если mCherry::pHluorin выражается в клон FSC, FSC, также могут быть определены как передней большинстве ячейки клонов.
      3. ПФУ являются неправильной формы клетки в регионе 2b, непосредственно прилегающих к и вниз по течению от FSCs.
      4. Клетки фолликула являются квадратные или столбчатых клеток, которые окружают зародышевых клеток ганглия в регионе 3.
    3. Получения коэффициенты интенсивности флуоресценции
      1. выбрать один или несколько фрагментов, в которых клетки интерес имеет высокие интенсивности флуоресценции в mCherry канале и убедитесь, что окрашивание конканавалина-A, видели в far-red канале, в ФОЦ нас в пределах выделенного фрагмента.
      2. Нарисовать ROI вокруг каждого FSC и мера означает флуоресценции интенсивность pHluorin и mCherry во всех ломтиков выбранной для измерений.
      3. Разделите среднее флуоресценции интенсивность pHluorin канала, интенсивность средняя флуоресценции mCherry канала рассчитать коэффициент pHluorin mCherry флуоресцирования.
  2. Производные фи значения и генерировать pseudocolored образы
    1. производные фи значения
      1. во всех случаях, линейной регрессии кривая должны создаваться с использованием яичников от мух же генотипа для обеих экспериментальных и контроля условий. Создание кривой линейной регрессии для каждого типа клеток, используя данные из буфера условий двух nigericin ( рис. 3). В Excel это может быть сделано путем добавления линейного тренда и отображения данных на диаграмме. Поочередно, см:
      2. использования, наклон и y пересечение линейной регрессии кривая рассчитывается от условий nigericin и уравнения линии (y = mx + b) для преобразования pHluorin в mCherry соотношение значения рассчитываются от образцов в бикарбонат условие для значения рН. В этом уравнении, заменить форма склона (y пересечение) b, поставьте значение коэффициента в для x и решить для ю.
    2. Создания pseudocolored изображения, отражающие соотношение значения в Фиджи.
      1. Следуйте процедуре выше для вычитание фона (шаг 3.1.1 и рис. 4).
      2. Делят pHluorin канал из mCherry канала, используя функцию калькулятор изображение, в меню процесс. Будьте уверены, " создать новое окно " и " 32-бит (float) результат " флажки проверяются оба. Изменить таблицу подстановки (LUT), находится в меню изображения, для теплоизоляционной или LUT выбора. Смотрите Рисунок 4 для других подходящих вариантов.
      3. Диалогового окна Настройка яркости и контрастности (изображение → Настройка → яркость/контрастность), нажмите кнопку " набор " кнопку. Набор минимум отображается значение 0 и Максимальное отображаемое значение в пропорции, которая наилучшим образом захватывает данные, обычно 1.0-2.0 ( рис. 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы описали процесс измерения фи в эпителий фолликула, который включает несколько этапов. Во-первых яичники разделяются от мух соответствующие генотипа, используя инструменты для рассечения и монтажа (рис. 1). Ovarioles затем отражаются с помощью количественных флуоресцентной микроскопии и образы анализируются, чтобы получить измерения фи. Для каждого изображения типы клеток интерес идентифицируются как описано в разделе 3.1 (рис. 2). Коэффициент интенсивности флуоресценции в каналах GFP и mCherry преобразуется в фи значения с использованием стандартной кривой (Рисунок 3А), как описано в разделе 3.2. С помощью этого метода, мы обнаружили, что Фил увеличивается с дифференциацией в начале FSC родословную, 6,8 в FSCs, до 7.0 в prefollicle клетки, 7.3 в клетки фолликула (рис. 3B). Фи значения каждого типа клеток могут быть представлены графически, как показано на рисунке 3B, или как pseudocolored Микрофотография, показывает различия в pHluorin к mCherry соотношения (рис. 4 и Рисунок 5). В этих образах различия в pHluorin к mCherry соотношения отображаются как различия в цвете, как определено LUT. Важно выбрать LUT и минимальное и максимальное значения для диапазона цветов для создания изображения, которое является представителем большинства данных. Хотя, в общем, выбор параметров LUT и диапазона не даст появление различий, которые не присутствуют в изображении, менее подходит выбор ТМП может заслонить фи различия присутствуют в микрофотография (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1: Материалы для монтажа и dissection Drosophila ovarioles. Показ (A) изображение: (1) Лак для ногтей; (2) вакуумные смазка и стакан и пипетки подсказка используется для нанесения смазки; (3) 23-калибруйте шприц иглы; (4) пинцет из нержавеющей стали Дюмон, размер 5; (5) 3D печатного монтажа камеры; (6) 22 x 40 мм стекла coverslips; (7) раунд стекла Coverslips, диаметр 12 мм, 0,13-0,16 мм толщина; и стекла (8) 9-Ну рассекает блюдо. (B) крупным планом изображение 3D печатного монтажа камеры. (C) изображения показаны расчлененных пара wildtype яичников. (D) изображения показаны хорошо разделенных ovarioles. (E) A изображение 3D камеры с расчлененными яичников монтируется под круглые стекло coverslip. Черные точки являются капли лак используется провести раунд coverslip на месте. (F) изображение расчлененных ovarioles под раунд стекла coverslip после монтажа. Черный ящик указывает область изображения с одной расчлененных ovariole. Масштаб бары представляют приблизительно 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: определение FSCs, ПФУ и клетки фолликула. Два примера germaria с БЛА mCherry::pHluorin и 10930-Gal4 окрашенных с Concanavilin-A. В каждом изображении показан ROI, изложением FSC, pFC и клеток фолликула. Интенсивностью среднее флюоресценции в каналах pHluorin и mCherry используются для вычисления pHluorin mCherry соотношения. Масштаб бары представляют около 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Пхи увеличивается во время дифференциация в линии FSC. Представитель результаты, взятые из Ulmschneider и др. 2 показаны: (A) типичный линейной регрессии кривая используется для вычисления значения рН от pHluorin до mCherry соотношения; и (B) вычисляемые фи значения с 95% доверительными интервалами для FSCs, ПФУ и клетки фолликула. Эта цифра была адаптирована после разрешения, Ulmschneider и др. 2. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: использование Фиджи для создания образа pseudocolored ratiometric. (A) изображения показаны результаты каждого шага в процессе вычитание фона. Начиная с отложенной обработкой изображения (левой панели), первым шагом является установить пороговые пределы, чтобы пикселы со значениями интенсивности ниже фон исключаются. Верхний предел порога устанавливается на максимум. Фиджи будет цвет исключенных пикселей синий, приводит в изображении с синим фоном и ясно видны germarium (средней панели). Обратите внимание, что этот шаг является необязательным. Вторым шагом является рисовать ROI в части изображения без сигнала (красные квадраты в средней панели), мера интенсивности среднее флуоресценции ROI, и вычесть эту сумму из всего изображения, что приводит к на фоне вычитается изображения (правой панели). Третьим шагом является использовать функцию расчета изображения для разделения изображения на pHluorin канале изображения в канале mCherry. Результат будет изображение отображается с таблицей подстановки серых и образ отображения значения охватывают весь динамический диапазон предоставляемых битовую глубину изображения. Последний шаг является для настройки параметров отображения изображения для более соответствующий диапазон и выберите таблицу подстановки. (B) образец изображения показаны в результате расчета изображения с минимальным отображать значение 0, а максимальное отображаемое значение равным 2,5 с использованием четырех различных подстановок таблиц. Прямоугольник рядом с каждого изображения показывает цвета, используемые для динамического диапазона для каждой таблицы подстановки. Обратите внимание, что для HiLo, 16 цветов и тепловой, различных цветов используются для пикселей с интенсивностью значением 0 или максимум (например, синий и красный, соответственно, в приложении HiLo). Это обеспечивает визуальный справочные ограничения динамического диапазона, позволяя зрителю увидеть, что сигнал в пределах динамический диапазон. (C) скриншоте показаны параметры, выбранные при импорте файла в ImageJ с помощью био-форматы импорта Plug-In. Шкала бары представляют 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ласс = «jove_content» fo:keep-together.within-страницы = «1» >Figure 5
Рисунок 5: Установка образ отображения значения изображений pseudocolored ratiometric. Отображаемые значения минимального и максимального изображения следует задать, чтобы сигнал в изображениях от бикарбонат состояния, а также от обоих условий nigericin находятся в пределах динамический диапазон. Чтобы проиллюстрировать это, два изображения от каждого из трех условий указаны с четырьмя параметрами отображения различных изображений (0-0,5, 0-1, 0-2,5 и 0-5) с помощью таблицы тепловой подстановки. Обратите внимание, что для всех трех экспериментальных условиях, когда изображения отображаются с Максимальное отображаемое значение равным 0.5, большая часть сигнала на или вблизи максимума на колориметрической шкале, и когда оно имеет значение 5.0, большая часть сигнала находится на или вблизи минимум на цвет imetric шкала. В обоих этих случаях различия в pHluorin к mCherry отношение всей ткани нельзя высоко легко, поэтому эти параметры не являются идеальными. В отличие от этого максимальная отображения значения 1.0 или 2,5 гораздо более подходящим. С этими параметрами различия в соотношении по всей ткани могут быть легко оценены, и сигналы в образы из всех трех экспериментальных условиях отображаются в цвета, которые находятся в пределах динамический диапазон колориметрическая шкала. Масштаб бары представляют около 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем метод измерения фи клеток в FSC линии в wildtype ткани. Этот протокол разработаны и усовершенствованы за последние пять лет, поскольку мы впервые начали учиться фи в дрозофилы тканей яичника. В это время протокол успешно используется несколько следователей в нашей лаборатории и по крайней мере четыре различных вращающийся диск и лазерные сканирующие микроскопы. Воспроизводимость нашего первоначального наблюдения, что фи увеличивается как клетки в линии FSC дифференцировать от стволовых клеток для ПФК в состояние клеток фолликула, через эти процессы с участием нескольких демонстрирует оба что это биологическое явление является надежной и что методология является надежным. Однако по нашему опыту, это сложная процедура освоить. Она требует пристального внимания к деталям на каждом шагу и быстрое, высококлассных выполнения диссекции, монтаж и изображений шаги. Как указано в протоколе, процедура диссекции и монтажа включает 10 мин инкубации, но не должно превышать 15 мин и визуализации процедура должна быть завершена в 45 мин. В идеальных условиях дрозофила ovarioles может быть сохранен в культуре для до 14 h17, но мы обнаружили, что ткани начинает умирать гораздо более быстрыми темпами в nigericin буферов, используемых для создания стандартных кривых. Наши правила убедиться, что все данные собираются в то время как ткани находится все еще в пределах окна времени, похоже, здоровым и морфологически нормальных. Это не оставляет много времени для каждого шага, хотя, поэтому важно планировать заранее, чтобы убедиться, что все готовы перейти от одного шага к другому. В самом деле это гораздо более эффективно, если два человека работают вместе на вскрытие, монтаж, и изображений процедур, с одним человеком, выполнении шага во время другого человека готовит для следующего шага.

Так как pHi могут быть чувствительны к экспериментальных манипуляций, необходимых для изображения тканей ex vivo, такие как температура и буфера композиции, этот метод является лучшим для определения относительных изменений в Пхи-Пхи. Учитывая, что зонд состоит из двух отдельных флуоресцентных белков, их свойства флуоресценции как квантовый выход, время жизни и складные свойства могут быть затронуты по-разному в различных типов клеток. Таким образом важно включать образцы, относились с условиями nigericin буфер и использовать их для создания нового Калибровочная кривая для каждого типа клеток в каждом испытании. Для того, чтобы свести к минимуму дополнительные источники изменчивости, сохраняя все условия последовательно в течение изображений подчеркивается. Образцы в условиях nigericin буфера должна быть подготовлена и отражаться в тот же день, как тех, кто в состоянии буфера бикарбоната и подготовка и изображения приобретение всех образцов должны храниться как можно более последовательными. Это важно, потому что фи измерения основаны на сравнение наборов изображений, поэтому экспериментальные различия, которые влияют на определение mCherry и pHluorin в одной или более из наборов изображений может уменьшить точность оценок фи. Такие факторы, как изменения в параметры напряжения фотоэлектронный умножитель трубок (если с помощью лазерного сканирования конфокальный) или времени экспозиции (при использовании вращающийся диск конфокальный) или грязный объектив, который уменьшает количество света, достигающего камеры, несомненно повлияет на результаты . Но существует множество других более тонкие факторов, которые могут отличаться от изо дня в день и может также повлиять на результаты, например, если мухи сытых, возраст мух, и как долго лазеры были на до изображений. Подготовка и обработка изображений все три условия в тот же день сводит к минимуму эти различия и таким образом будет производить наиболее последовательные результаты. В частности, каждый раз, когда мы перешли на новый Микроскоп или обновлены компоненты микроскопа, было необходимо повторно оптимизировать параметры на новом оборудовании. Это часто приводят к изменению в средние значения отдельных измерений, но, до тех пор, как с каждого судебного разбирательства были созданы новые калибровочных кривых, изменения в оборудовании имел минимальное влияние на фи оценок. Кроме того соответствующие сравнение часто между типами различных клеток, которые находятся в пределах же ткани (например, FSCs, ПФУ и фолликул клетки) и таким образом внутренне контролируется для экспериментальных вариации.

Хотя этот протокол была сосредоточена на измерении фи wildtype ткани, методологии совместимы со стандартными методами дрозофилы для манипулирования экспрессии генов, такие как выражение RNAi или трансген, используя UAS/Gal4 и мозаика анализа. Поскольку mCherry::pHluorin управляется промоутера UAS, он всегда будет совместно выразили с RNAi или трансген, и MARCM18 может использоваться для получения гомозиготных мутант клоны с mCherry::pHluorin как клоновых маркера. По причинам, описанным выше wildtype ткани должны быть проанализированы как элемент управления вместе с каждого разбирательства с мутант генотипа. Наконец общие принципы, описанные здесь может применяться к использованию mCherry::pHluorin для измерения фи в других тканях. Действительно этот протокол был адаптирован от протокола для использования mCherry::pHluorin для измерения фи в глаз дрозофилы 7, и мы использовали одинаковые методологии для изображения mCherry::pHluorin в личиночной мозга. В целом инструменты и методы, описанные здесь предоставляют новые возможности для изучения многих разнообразных функций фи в естественных условиях в течение жизни, неповрежденной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Мы благодарим Bryne Ulmschneider за вклад в протокол и Диана Парикмахерская для предложения на рукопись. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант GM116384 Nystul т.г. и парикмахерская Д.Л.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
  2. Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215, (3), 345-355 (2016).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  5. Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202, (6), 849-859 (2013).
  6. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  7. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
  8. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  9. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17, (1), 15-25 (2007).
  10. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  11. Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21, (1), 159-171 (2011).
  12. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
  13. St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141, (5), 757-774 (2010).
  14. Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
  15. Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121, (11), 3797-3807 (1995).
  16. Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1, (3), 277-285 (2007).
  17. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  18. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24, (5), 251-254 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics