इमेजिंग Intracellular पीएच के लिए तरीके कूप स्टेम सेल वंश के लाइव Drosophila डिम्बग्रंथि ऊतक में

Developmental Biology

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Summary

हम लाइव Drosophila डिम्बग्रंथि ऊतक में एक उपकला स्टेम सेल वंश की इमेजिंग intracellular पीएच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम ट्रांसजेनिक उत्पन्न करने के लिए तरीकों का वर्णन मक्खियों एक पीएच, mCherry::p hluorin, छवि मात्रात्मक प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर सेंसर, मानक घटता उत्पन्न, और पीएच मूल्यों के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों में परिवर्तित व्यक्त.

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Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

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Abstract

intracellular पीएच (फी) में परिवर्तन चयापचय, प्रसार, और भेदभाव सहित कई सेलुलर कार्यों के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । आमतौर पर, फी गतिशीलता का निर्धारण कर रहे हैं, जो मापने के लिए उत्तरदायी और प्रयोग कर रहे हैं फी में प्रसंस्कृत कोशिकाओं. हालांकि, नए उपकरणों और तरीकों के हाल ही के विकास में यह संभव फी गतिशीलता के भीतर बरकरार, जीने के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए बनाया है । Drosophila अनुसंधान के लिए, एक महत्वपूर्ण विकास एक ट्रांसजेनिक लाइन एक फी, mCherry::p hluorin ले जाने की पीढ़ी थी । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि हम नियमित रूप से इमेजिंग लाइव Drosophila ovarioles के लिए उपयोग करने के लिए उपकला कूप स्टेम सेल में फी मापने के लिए (FSC) mCherry में वंश का वर्णन::p hluorin ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार लाइनों; हालांकि, यहां वर्णित तरीकों को आसानी से पंख डिस्क और नेत्र उपकला सहित अंय ऊतकों, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम mCherry व्यक्त करने के लिए तकनीकों का वर्णन: FSC वंश में:p hluorin, लाइव इमेजिंग के दौरान डिंबग्रंथि के ऊतकों को बनाए रखने, और प्राप्त करने और फी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए छवियों का विश्लेषण ।

Introduction

हाल के अध्ययनों ने vivo1,2 मेंसेलुलर भेदभाव और dysplasia के दौरान फी में बदलाव के लिए एक भूमिका का पता चला । इन अध्ययनों में पाया गया है कि ्ही विभेद के एक ही चरण में एक ही प्रकार की कोशिकाओं में उल्लेखनीय अनुरूप है, लेकिन है कि यह एक चरण से दूसरे में कोशिकाओं के संक्रमण के रूप में बदल जाता है । कुछ मामलों में, फी में परिवर्तन को अवरुद्ध करना आंशिक रूप से भेदभाव को बाधित करता है, सुझाव है कि फी में परिवर्तन केवल सेल भाग्य में परिवर्तन का परिणाम नहीं है, लेकिन बजाय सेल भाग्य में परिवर्तन को बढ़ावा देने में मदद करता है, शायद पीएच पर प्रभाव के माध्यम से-संवेदनशील विनियामक प्रोटीन या रासायनिक प्रतिक्रियाओं विभेद के लिए आवश्यक है । भविष्य के अध्ययनों में vivo मेंफी गतिशीलता के कई विभिंन भूमिकाओं में और अधिक जानकारी प्रकट करने की क्षमता है । हालांकि, vivo में भेदभाव के दौरान फी का अध्ययन करने की चुनौतियों में से एक फी की सटीक माप प्राप्त है. इस तरह के सेलुलर आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के रूप में भेदभाव की अन्य सुविधाओं के विपरीत, फी सेल के एक labile रासायनिक गुण है कि कोशिकाओं में संरक्षित नहीं है कि मानक तरीकों के साथ तय किया गया है और permeabilized है. इसके अलावा, फी उन कोशिकाओं में स्थिर नहीं हो सकती जो प्रयोगात्मक हेरफेर के परिणामस्वरूप तनावग्रस्त या मर रही हैं । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए और के रूप में संभव के रूप में स्वस्थ जब फी मापने । कई महत्वपूर्ण रंजक उपलब्ध है कि संस्कृति3में कोशिकाओं के फी मापने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन कई मामलों में वे के लिए उपयुक्त नहीं है vivo अध्ययनों में क्योंकि वे गहराई से ऊतक घुसना नहीं है या समान रूप से पर्याप्त सटीक माप प्रदान करने के लिए .

गरीब डाई पैठ की समस्या को दरकिनार, हम और दूसरों को एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच का इस्तेमाल किया है, mCherry::p hluorin4,5,6,7, कि सेल में विशेष रूप से व्यक्त किया जा सकता है ब्याज के प्रकार और लाइव ऊतक में imaged । pHluorin एक उच्च pKa के साथ GFP के एक संस्करण है (~ ७.० बनाम ~ ४.०) कि अधिक आसानी से गुना अधिक पीएच; अतः कोशिका में pHluorin अणुओं की जनसंख्या से उत्सर्जित कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता फीको बढ़ाने के साथ बढ़ जाती है. महत्वपूर्ण बात, प्रतिदीप्ति फी मूल्यों की सामान्य cytosolic सीमा के भीतर रैखिक है. इसके विपरीत, mCherry के प्रतिदीप्ति (pKa ~ ४.५) cytosolic रेंज के भीतर पीएच परिवर्तन के प्रति असंवेदनशील है । इन दो पत्रकारों को एक एकल chimeric प्रोटीन के रूप में एक साथ जुड़े covalently हैं, एक खुले पढ़ने के फ्रेम द्वारा इनकोडिंग, इसलिए वे हमेशा बराबर मात्रा में मौजूद हैं । इसलिए, pHluorin का अनुपात mCherry प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए फी का एक माप प्रदान करता है कि प्रत्येक कोशिका में जांच एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत है । इसके बाद यह अनुपात एक मानक वक्र का उपयोग कर फी मानों के अनुमान में परिवर्तित किया जा सकता है जो कि ज्ञात पीएच मान को equilibrated गए ऊतकों से mCherry अनुपात को pHluorin प्राप्त करके उत्पन्न होता है.

यहाँ, हम mCherry का उपयोग करने के लिए विधियों का वर्णन::p hluorin Drosophila अंडाशय में उपकला FSC वंश के फी को मापने के लिए । यह अच्छी तरह से पात्र ऊतक के लिए स्टेम सेल स्व नवीकरण और भेदभाव9,10,11, सामूहिक सेल माइग्रेशन 12 के रूप में उपकला जीव विज्ञान के कई विभिंन पहलुओं मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है , और विकास और सेल ध्रुवीयता के रखरखाव13,14। कूप उपकला दो FSCs है कि एक संरचना में ऊतक के पूर्वकाल किनारे पर रहते हैं द्वारा उत्पादित है germarium15,16. इन कोशिकाओं को वयस्कता के दौरान नियमित रूप से विभाजित करने के लिए स्वयं को नवीनीकृत और संतान का उत्पादन, कहा जाता है कूप कोशिकाओं (pFCs), कि या तो फिर से आला दर्ज करें और एक FSC हो या तीन अलग कूप कोशिकाओं के प्रकार में से एक में अंतर कर सकते हैं: ध्रुवीय कक्ष, डंठल कोशिकाओं, या मुख्य शरीर कूप कोशिकाओं । हम पहले से पता चला है कि wildtype ऊतक में, फी अंतर के प्रारंभिक दौर के दौरान तेजी से बढ़ जाती है, लगभग ६.८ के एक फी से FSCs में ७.० pFCs में, कूप कोशिकाओं में ७.३ के लिए2। एक बैरे के RNAi पछाड़ना द्वारा इस वृद्धि को अवरुद्ध सोडियम/प्रोटॉन एक्सचेंजर, DNhe2, गंभीर रूप से प्रभावित पीएफसी भेदभाव, जबकि DNhe2 के व्यक्त द्वारा फी में वृद्धि एक हल्के अतिरिक्त भेदभाव का कारण बनता है phenotype. इन निष्कर्षों का प्रदर्शन है कि फी छुरा जल्दी FSC वंश में बनाए रखा है और कि यह प्रयोग किया जा सकता है या vivo मेंकमी हुई है । यहां वर्णित तरीकों को या तो wildtype ऊतक या उत्परिवर्ती ऊतकों के विभिंन रूपों में फी मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, RNAi पछाड़ना या ब्याज की एक Gal4 का उपयोग कर एक्सप्रेस सहित, और mitotic क्लोन ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: FSC वंश में फी मापने के लिए, हम mCherry, FSCs, और शारीरिक स्थितियों में कूप कोशिकाओं में pFCs के लिए pHluorin की प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात की गणना, और मानक के साथ फी मूल्यों में अनुपात कन्वर्ट प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अंशांकन घटता < सुप वर्ग = "xref" > ७ . सबसे पहले, लाइव इमेजिंग प्रयोगों germaria में pHluorin और mCherry के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए किया जाता है एक बफर जिसमें NaHCO 3 , जिसमें शारीरिक स्थितियों की नकल करते हैं < सुप वर्ग = "xref" > १ , < सुप वर्ग = "xref" > ७ . अगला, मानक घटता pHluorin को मापने और एक Na प्रतिदीप्ति में mCherry तीव्रता से उत्पन्न कर रहे हैं + -free, K + ionophore युक्त nigericin बफर दो अलग पीएच मूल्यों के लिए समायोजित, ६.५ और ७.५. nigericin, फी equilibrates की उपस्थिति में प्लाज्मा झिल्ली भर में बफर के पीएच के साथ, जिससे फी extracellular पीएच मैच के लिए । अन्त में, मानक वक्रों में pHluorin को mCherry अनुपात में परिवर्तित करने के लए अनुमानित फी मूल्यों का उपयोग किया जाता है.

< p class = "jove_title" > 1. प्री-ट्रायल: विवो में फी को मापने से पहले तैयारी करें

< p class = "jove_content" > नोट: वीवो में vivo के उपाय करने के लिए, mCherry::p hluorin transgene हित के सेल प्रकार में व्यक्त किया जाना चाहिए । नीचे FSC वंश में ट्रांसजेनिक pHluorin मक्खियों उत्पंन करने के लिए कुछ आम तरीके हैं । सृजन mCherry::p hluorin क्लोनों FSCs, जो एक FSC क्लोन के पूर्वकाल किनारे पर स्थित है की पहचान करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है । ऊतक विशिष्ट mCherry::p hluorin अभिव्यक्ति पूरे ऊतक भर में फी को मापने के लिए उपयोगी है और यह भी अधिक सुविधाजनक है जब एक RNAi या transgene की अभिव्यक्ति के साथ संयोजन.

  1. जनरेशन की ट्रांसजेनिक pHluorin मक्खियों
    1. mCherry::p hluorin-त्यसपछि FSC क्लोन
      1. बनाने mCherry::p hluorin FSC क्लोन, पार यूएएस-mCherry::p hluorin < सुप क्लास = "xref" > 1 टू ए एक्ट-Gal4 flipout स्टॉक या अन्य Flp/FRT inducible Gal4.
      2. के साथ शेयर
      3. बनाने के लिए heatshock inducible क्लोन, heatshock वयस्क F1s के लिए 2 दिन के बाद खाली शीशियों में 1 ज के लिए eclosion ३७ & #176; ग जल स्नान, चार बार लगभग हर 12 ज.
      4. इस अवधि के दौरान oogenesis की सामांय वृद्धि और अधिकतम दरों को सुनिश्चित करने के लिए, ताजा गीला खमीर प्रदान करके मक्खियों को बनाए रखने (लगभग बराबर भागों सूखी बेकर & #39; एस खमीर और पानी) दैनिक कम 6 दिनों के लिए क्लोन प्रेरण के बाद ।
    2. ऊतक विशिष्ट mCherry::p hluorin अभिव्यक्ति
    3. पार यूएएस-mCherry::p hluorin < सुप वर्ग = "xref" > 1 to a कूप सेल विशिष्ट driver, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (ब्लूमिंगटन ID: ७०२३).
    4. 3 दिनों के बाद मक्खियों शुरू eclosing, इकट्ठा करने और उंहें गीला खमीर युक्त शीशियों में जगह है, के लिए विच्छेदन के लिए पहले से कम 24 ज ।
  2. बहे समाधान
    नोट: यह प्रयोग के दिन पर निम्नलिखित बफ़र्स तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि पीएच और बफर में घुला हुआ सांद्रता समय के साथ बदल सकते हैं ।
    1. तैयार बिकारबोनिट, nigericin, और विच्छेदन बफ़र्स । घटकों के गठन से बचने के लिए सूचीबद्ध क्रम में जोड़ें ( तालिका को देखें 1 , तालिका 2 , और तालिका 3 ).
< p class = "jove_title" > 2. परीक्षण: FSC वंश में फी को मापने

< p class = "jove_content" > नोट: विच्छेदन, बढ़ते और लाइव इमेजिंग चरणों के लिए बिकारबोनिट बफ़र और दो nigericin बफ़र स्थितियों के लिए किया जा करने के लिए आवश्यक हो सकता है एक बार माइक्रोस्कोप का निर्धारण करने के लिए: सेटिंग्स और एक दूसरी बार प्रयोगात्मक डेटा इकट्ठा करने के लिए । अधिक जानकारी के लिए नीचे दिए गए अनुभाग २.२ देखें ।

  1. विच्छेदन और बढ़ते
    नोट: इस चरण को निष्पादित करने के लिए आवश्यक सामग्री के लिए कृपया < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ तथा तालिका सँ । 3 डी मुद्रित बढ़ते चैंबर के लिए, 3 डी प्रिंटर फ़ाइलें पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 के रूप में प्रदान की जाती हैं ।
    1. विच्छेदन:
      1. 3 डी मुद्रित बढ़ते चैंबर के चापलूसी पक्ष को वैक्यूम तेल की एक पतली कोटिंग लागू करने से बढ़ते चैंबर तैयार करते हैं । एक 22 x ४० mM coverslip पर उस तरफ प्लेस के बढ़ते चैंबर को coverslip सील ।
    2. टुकड़े अंडाशय में महिला वयस्क मक्खियों से ५०० & #181; L विच्छेदन बफर (बिकारबोनिट या nigericin बफर, तालिका 3 )
      1. Anesthetize 3-4 सह का उपयोग मक्खियों 2 गैस और हस्तांतरण सह perfused के साथ एक मक्खी पैड पर मक्खियों 2 गैस.
      2. संदंश के साथ एक anesthetized मक्खी उठाओ और विच्छेदन मीडिया में जगह है.
      3. एक forcep के साथ मक्खी के छाती चुटकी, जबकि इसके अंडाशय जब तक अपने पेट की नोक पर tugging उजागर कर रहे हैं ।
      4. अंय अंगों से अंडाशय अलग करने के बाद, ovarioles 22 1/2 सिरिंज सुई का उपयोग कर के अलावा चिढ़ाते हैं । ध्यान से अंडाशय से मांसपेशी म्यान अलग और अलग अलग ovarioles ovarioles के क्लस्टर से । मांसपेशी म्यान को अलग करने के लिए एक प्रभावी तकनीक अपने पूर्वकाल अंत में जगह में ovarioles के क्लस्टर पकड़ करने के लिए एक सिरिंज सुई का उपयोग करने के लिए है, और एकल ovarioles की लंबाई के साथ स्ट्रोक नीचे.
      5. बढ़ते कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले बिल्कुल 10 मिनट के लिए विच्छेदन मीडिया में विच्छेदित अंडाशय की मशीन है ताकि कोशिकाओं के फी के लिए पर्याप्त समय है nigericin विच्छेदन मीडिया के पीएच के साथ पूरी तरह से equilibrate ।
        नोट: सुनिश्चित करें कि ovarioles से मांसपेशी म्यान निकाल दिया जाता है । मांसपेशी म्यान प्रतिदीप्ति संकेत है, जो यह मुश्किल Concanavilin-A का उपयोग कर व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए बनाता है क्षीणन हो सकता है, और ovarioles लाइव इमेजिंग के दौरान अनायास स्थानांतरित करने के लिए कारण हो सकता है.
    3. बढ़ते
      1. बढ़ते चैंबर के अंदर कांच coverslip पर विच्छेदन मीडिया की एक छोटी सी बूंद जगह ।
      2. अंतरण विलग ovarioles प्रयोग संदंश.
      3. पहले चरण अंडा मंडलों के साथ जुड़े germaria से बाद में मंच अंडा मंडलों अलग है, और यह सुनिश्चित करना है कि विच्छेदित germaria मीडिया ड्रॉप के केंद्र में रखा जाता है की कोशिश करो ।
      4. एक दौर 12-mm coverslip के विपरीत पक्षों को नेल पॉलिश की दो छोटी बूंदें जोड़ें और यह के बारे में 10 एस
      5. के लिए शुष्क हवा
      6. जगह विच्छेदन मीडिया के ड्रॉप पर गोल coverslip अलग germaria है कि इस तरह के साथ नेल पॉलिश चेहरे नीचे और विच्छेदन मीडिया संपर्क । समतल और स्थिति में germaria सुरक्षित करने के लिए नेल पॉलिश के साथ बढ़त के भागों पर नीचे दबाएँ । हम पुराने नेल पॉलिश का उपयोग करने की सिफारिश क्योंकि यह जगह में सुरक्षित किया जा रहा है के रूप में coverslip की सतह पर कम धब्बों.
      7. अतिरिक्त विच्छेदन मीडिया के साथ बढ़ते चैंबर भरें । Concanavalin-एक डाई शामिल नहीं है कि हालत विशिष्ट बफर चैंबर को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
        नोट: कुल समय खर्च विदारक और बढ़ते 15 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए । यह ऊतक क्षति के प्रभाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है व सैल ृ.
  2. Live इमेजिंग:
    नोट: इस चरण में, पहले बिकारबोनिट हालत और दो nigericin शर्तों से छवियों को इकट्ठा करने के लिए उचित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का निर्धारण; आवश्यक के रूप में माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को समायोजित करें, और फिर प्रयोगात्मक डेटा के लिए छवियों को इकट्ठा । 3 चैनलों में इमेजिंग में सक्षम एक फोकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें: GFP (४७५ उत्तेजना/509 उत्सर्जन), mCherry (५७५ उत्तेजना/610 उत्सर्जन), और दूर लाल (६३३ उत्तेजना/
    नोट: माइक्रोस्कोप सेटिंग सेट करें: एकत्र की गई छवियों की पिक्सेल तीव्रता फी के अनुमानों को निर्धारित करने के लिए मात्रा की जाएगी, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक छवि सेट में सिग्नल की गहनता मान न तो बहुत कम है और न ही संतृप्त । तीव्रता है कि एक छवि में कब्जा किया जा सकता है की सीमा छवि बिट गहराई से परिभाषित है । कई मामलों में, 8-बिट छवियां डिफ़ॉल्ट रूप से जेनरेट होती हैं, लेकिन हम डेटा को 16-बिट छवियों के रूप में प्राप्त करने की अनुशंसा करते हैं, जिसमें एक व्यापक डायनामिक श्रेणी होती है. यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच crosstalk कम है, इसलिए सेटिंग्स समायोजित किया जाना चाहिए ताकि प्रत्येक fluorophore से एकत्र उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ओवरलैप नहीं है । इन सेटिंग्स का परीक्षण करने के लिए, GFP के लिए उत्तेजना स्पेक्ट्रम का उपयोग कर एक नमूना छवि ले लो और mCherry और उल्टे के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में इकट्ठा । सेटिंग्स ठीक से समायोजित किया गया है, तो किसी भी मामले में कोई संकेत नहीं होना चाहिए । सेट माइक्रोस्कोप सेटिंग्स ( यानी , एक लेज़र स्कैनिंग पर वोल्टेज सेटिंग्स फोकल, लेजर पावर और pinhole आकार) इतना है कि सभी तीन छवि सेट में संकेत की पिक्सेल तीव्रता छवि फ़ाइल की गतिशील रेंज के भीतर हैं. हमारे सभी प्रयोगों के लिए, हम १,०२४ & #215 में 16-bit छवियों को प्राप्त करने के लिए एक 40x उद्देश्य के साथ एक सफेद प्रकाश लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया, १,०२४ प्रारूप, जबकि हम जरूरत के रूप में हर प्रयोग के लिए वोल्टेज लाभ अनुकूलित. उदाहरण के लिए, एक प्रयोग में, हम GFP के लिए वोल्टेज लाभ सेट, mCherry, और दूर-लाल के रूप में ३७.८%, ७२.९%, और २६०%, क्रमशः.
      पीएच ६.५ में nigericin विच्छेदन बफर में
    1. छवि ovarioles, और इस तरह के pHluorin और mCherry छवियों के पिक्सेल तीव्रता कम कर रहे हैं सेटिंग्स समायोजित, लेकिन कैमरे का पता लगाने की सीमा से नीचे नहीं.
    2. छवि पीएच ७.५ में nigericin विच्छेदन बफर में ovarioles का एक और सेट और सेटिंग्स को समायोजित ऐसी है कि pHluorin और mCherry छवियों के पिक्सेल तीव्रता उच्च रहे हैं, लेकिन संतृप्त नहीं.
    3. बिकारबोनिट विच्छेदन बफर में
    4. छवि अंडाशय और सुनिश्चित करें कि pHluorin और mCherry छवियों के पिक्सेल तीव्रता चुना सेटिंग्स के साथ संतृप्त नहीं हैं । पिक्सेल संतृप्त हैं, तो आवश्यक के रूप में सेटिंग्स समायोजित करें ।
      नोट: माइक्रोस्कोप सेटिंग पैरामीटर सटीक माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर अलग किया जा रहा हो सकता है, और प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स सेट किया गया है के बाद, प्रयोग के शेष के लिए उन्हें बदल नहीं है. सेटिंग्स नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों में संगत होना चाहिए । हमारे आरंभिक फी प्रयोगों में हमने 2 और 3 पॉइंट nigericin अंशांकन वक्र्स जेनरेट किए और किसी भी विधि के उपयोग से परिकलित ्ही के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया । हालांकि, सामान्य तौर पर, अंशांकन वक्र में अधिक अंक के अलावा सटीकता में सुधार करने की उम्मीद होगी । इसलिए, हम अंक के विभिंन नंबरों के साथ curves पैदा करने की सिफारिश निर्धारित करने के लिए कितने प्रयोगात्मक शर्तों का एक सेट के लिए आवश्यक हैं ।
  3. डेटा संग्रह:
    1. प्रदर्शन विच्छेदन, बढ़ते, और बिकारबोनिट और nigericin बफ़र स्थितियों में नमूनों की इमेजिंग । विच्छेदन और बढ़ते के बाद, अधिकतम समय खर्च इमेजिंग नमूनों का एक सेट ४५ मिनट से अधिक नहीं है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता माप रहते हैं, स्वस्थ ऊतक में किए जाते है सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए ।
    2. प्रत्येक शर्त के लिए
    3. , कम से 5 germaria.
    4. के लिए छवियों को प्राप्त
< p class = "jove_title" > 3. पोस्ट-परीक्षण: छवि विश्लेषण

  1. उपाय प्रतिदीप्ति में तीव्रता FSCs, pFCs, और कूप कोशिकाओं
    1. पृष्ठभूमि घटाव:
      1. एक अलग विंडो में प्रत्येक चैनल के साथ फिजी में unprocessed छवियों को खोलने ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4c ).
      2. संकेत के बिना छवि के एक हिस्से में pHluorin चैनल विंडो में ब्याज (रॉय) के एक क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए आयत उपकरण का उपयोग करें ।
      3. वैकल्पिक चरण: सीमा की निचली सीमा सेट करें ताकि पृष्ठभूमि के नीचे तीव्रता मानों के साथ पिक्सेल बहिष्कृत न किए जा सके और अधिकतम सीमा की ऊपरी सीमाएं सेट की जा सके. जब दहलीज इस तरह से सेट है, संकेत के बिना छवि के क्षेत्रों में ज्यादातर नीले हैं और संकेत स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4a ).
      4. रॉय में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय । यदि थ्रेशोल्ड चरण 3 में सेट किया गया था, तो माप सेट करें संवाद बॉक्स में & #34; थ्रेशोल्ड करने के लिए सीमा & #34; बॉक्स चेक करना सुनिश्चित करें.
      5. प्रत्येक चैनल और घटाना समारोह का उपयोग कर छवि का टुकड़ा से मापा पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना, प्रक्रिया में पाया & #8594; मठ मेनू.
      6. दोहराएँ चरण 3.1.1.2-6 mCherry चैनल विंडो के लिए सिवाय इसके कि, चरण 3.1.1.2 में, आयत उपकरण के साथ एक नया आयत आरेखण के बजाय, पुनर्स्थापना चयन फ़ंक्शन का उपयोग करें, संपादन & #8594 में मिला; चयन मेनू, समान के साथ कोई आयत जोड़ने के लिए छवि पर आयाम और स्थिति.
    2. FSCs, pFCs, और कूप कोशिकाओं की पहचान:
      1. FSCs, pFCs, और कूप कोशिकाओं की पहचान आकृति विज्ञान और Concanavalin का उपयोग कर स्थान द्वारा-एक दाग सेल सीमाओं को खोजने के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
      2. FSCs के क्षेत्र में germarium के किनारे पर स्थित पतली त्रिकोणीय कोशिकाओं रहे है 2a/ यदि mCherry::p hluorin एक FSC क्लोन में व्यक्त की है, FSC भी क्लोन के पूर्वकाल सबसे सेल के रूप में पहचाना जा सकता है ।
      3. pFCs क्षेत्र बी में अनियमित आकार की कोशिकाओं रहे हैं, तुरंत से सटे और FSCs.
      4. के बहाव
      5. कूप कोशिकाओं वर्ग या स्तंभ कोशिकाओं है कि क्षेत्र में रोगाणु कोशिका पुटी के चारों ओर है 3.
    3. कयने प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात
      1. एक या एक से अधिक स्लाइस चुनें जिनमें प्रतिदीप्ति चैनल में ब्याज की कोशिका उच्चतम mCherry तीव्रता है और यह सुनिश्चित करें कि Concanavalin-एक धुंधला, सुदूर-लाल चैनल में देखा गया है, एफओसी में है हमें चयनित स्लाइस के भीतर.
      2. प्रत्येक FSC के आसपास रॉय आकर्षित और माप के लिए चुना सभी स्लाइस में pHluorin और mCherry का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने.
      3. pHluorin चैनल के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता को mCherry चैनल pHluorin mCherry के अनुपात की गणना करने के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभाजित प्रतिदीप्ति
  2. आमलोगों को ्ही मान और उत्पन्न pseudocolored छवियां
    1. के आमलोगों को ्ही मान
      1. सभी मामलों में, रेखीय प्रतीपगमन वक्र एक ही जीनोटाइप के मक्खियों से अंडाशय का उपयोग कर उत्पन्न किया जाना चाहिए दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण की स्थिति के लिए । दो nigericin बफ़र शर्तों से डेटा का उपयोग कर प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए एक रेखीय प्रतीपगमन वक्र जनरेट करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 3 ) । Excel में, यह एक ग्राफ़ पर डेटा प्लॉट कर रहा है और एक रेखीय ट्रेंडलाइन जोड़ने के द्वारा किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, देखें:
      2. का उपयोग करें ढलान और y-अवरोधन के रेखीय प्रतीपगमन वक्र nigericin शर्तों से परिकलित और एक पंक्ति के समीकरण (y = mx + b) pHluorin mCherry अनुपात मान बिकारबोनिट में नमूनों से परिकलित करने के लिए कनवर्ट करने के लिए पीएच मान के लिए शर्त । इस समीकरण में, b के लिए ढलान प्रपत्र (y-अवरोधन) स्थानापंन, x के लिए अनुपात मान रखें, और y.
      3. के लिए हल
    2. फिजी में अनुपात मानों को दर्शाती एक pseudocolored छवि उत्पन्न करते हैं.
      1. पृष्ठभूमि घटाव (चरण 3 के लिए ऊपर की प्रक्रिया का पालन करें ।१.१ व < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 ).
      2. प्रक्रिया मेनू में पाया छवि कैलकुलेटर समारोह का उपयोग कर mCherry चैनल से pHluorin चैनल विभाजित । सुनिश्चित करें कि & #34; नई विंडो बनाएं & #34; र & #34; ३२-bit (फ्लोट) रिजल्ट & #34; चेक बॉक्स दोनों चेक किए गए हैं । पसंद की थर्मल या LUT करने के लिए छवि मेनू के तहत पाया लुकअप तालिका (LUT), बदलें । < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 अन्य उपयुक्त विकल्पों के लिए देखें.
      3. चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें संवाद बॉक्स में (Image & #8594; समायोजित & #8594; चमक/कंट्रास्ट), क्लिक & #34; सेट & #34; बटन । न्यूनतम प्रदर्शित मान 0 पर सेट करें और अधिकतम प्रदर्शित मान डेटा, आमतौर पर 1.0-2.0 (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 5 ) को कैप्चर करता है एक अनुपात करने के लिए ।

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Representative Results

यहाँ हमने कूप उपकला में फी मापने की प्रक्रिया का वर्णन किया है, जिसमें कई कदम शामिल हैं. सबसे पहले, अंडाशय उपयुक्त जीनोटाइप के मक्खियों से विदारक और बढ़ते (चित्र 1) के लिए उपकरणों का उपयोग कर रहे हैं । ovarioles तो मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवियों का उपयोग कर रहे हैं फी की माप प्राप्त करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. प्रत्येक छवि के लिए, अनुभाग ३.१ (आरेख 2) में बताए गए अनुसार रुचि के कक्ष प्रकार की पहचान की जाती है । GFP और mCherry चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात ३.२ खंड में वर्णित के रूप में एक मानक वक्र (चित्रा 3) का उपयोग कर फी मूल्यों में परिवर्तित हो जाता है । इस विधि का प्रयोग करते हुए हमने पाया कि फी जल्दी FSC वंश में भेदभाव के साथ बढ़ जाती है, FSCs में ६.८ से, के लिए कूप कोशिकाओं में ७.०, कूप कोशिकाओं में ७.३ के लिए (चित्र बी) । प्रत्येक कोशिका प्रकार के फी मानों को रेखांकन भी निरूपित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 3 बीमें, या एक pseudocolored micrograph के रूप में जो pHluorin में अंतर को mCherry अनुपात (चित्रा 4 और चित्रा 5) में दर्शाता है । इन छवियों में, mCherry अनुपात करने के लिए pHluorin में अंतर रंग में अंतर के रूप में प्रदर्शित किए जाते हैं, के रूप में एक LUT द्वारा परिभाषित । यह महत्वपूर्ण है कि रंगों की श्रेणी के लिए एक LUT और अधिकतम और ंयूनतम मान का चयन करना एक छवि है कि डेटा के अधिकांश प्रतिनिधि है उपज । हालांकि, सामांय तौर पर, LUT और रेंज सेटिंग्स के चुनाव मतभेद है कि छवि में मौजूद नहीं है की उपस्थिति नहीं देंगे, लुट्यो के एक कम अनुकूल विकल्प micrograph में उपस्थित फी मतभेद अस्पष्ट हो सकता है (चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन और बढ़ते Drosophila ovarioles के लिए सामग्री । () एक छवि दिखा: (1) नेल पॉलिश; (2) वैक्यूम चर्बी और चोंच और प्लास्टिक टिप तेल लगाने के लिए इस्तेमाल किया; (3) 23-गेज सिरिंज सुई; (4) Dumont आईनॉक्स संदंश, आकार 5; (5) 3 डी मुद्रित बढ़ते चैंबर; (6) 22 X ४० मिमी ग् coverslips; (७) गोल काँच Coverslips, १२ मिमी व्यास, 0.13-0.16 मिमी मोटाई; और (८) ९-खैर काँच विदारक पकवान. (B) 3d मुद्रित बढ़ते चैंबर की एक क्लोज़-अप छवि । () wildtype अंडाशय के एक विच्छेदित जोड़ी दिखा छवि । (D) अच्छी तरह से अलग ovarioles दिखाने वाली छवि । (E) विच्छेदित अंडाशय वाले 3d कक्ष का चित्र एक गोल काँच के coverslip के नीचे रखा गया है । काले डॉट्स नेल पॉलिश की बूंदों के लिए जगह में गोल coverslip पकड़ इस्तेमाल किया जाता है । () बढ़ते जाने के बाद एक गोल गिलास coverslip के नीचे विच्छेदित ovarioles की एक छवि । ब्लैक बॉक्स किसी एकल विच्छेदित ovariole के साथ छवि के किसी क्षेत्र को इंगित करता है । स्केल पट्टियां लगभग ५०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: FSCs, pFCs और कूप कक्षों की पहचान करना. यूएएस-mCherry के साथ germaria के दो उदाहरण::p hluorin और १०९३०-Gal4 सना के साथ Concanavilin-ए. एक रॉय एक FSC, एक पीएफसी रूपरेखा, और एक कूप सेल प्रत्येक छवि में दिखाया गया है । pHluorin और mCherry चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब mCherry अनुपात को pHluorin की गणना करने के लिए किया जाता है । स्केल पट्टियां लगभग 10 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: FSC वंश में भिंनता के दौरान फी बढ़ जाती है । प्रतिनिधि Ulmschneider एट अल से लिया परिणाम । 2 दिखा रहा है: () एक ठेठ रैखिक प्रतिगमन pHluorin से mCherry अनुपात पीएच मूल्यों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया वक्र; और (B) FSCs, pFCs, और कूप कक्षों के लिए ९५% विश्वास अंतरालों के साथ परिकलित फी मान । यह आंकड़ा अनुमति के बाद अनुकूलित किया गया है, Ulmschneider एट अल से । 2. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: pseudocolored ratiometric छवि जनरेट करने के लिए फिजी का उपयोग करना. (A) पृष्ठभूमि घटाव प्रक्रिया में प्रत्येक चरण के परिणाम दिखा छवियां । एक unprocessed छवि (बाएँ पैनलों) के साथ शुरू, पहला कदम सीमा सीमा इतना सेट है कि पृष्ठभूमि के नीचे तीव्रता मूल्यों के साथ पिक्सल बाहर रखा गया है. थ्रेशोल्ड की ऊपरी सीमा अधिकतम पर सेट है । फिजी एक नीली पृष्ठभूमि और एक स्पष्ट रूप से दिखाई germarium (मध्य पैनलों) के साथ एक छवि में जिसके परिणामस्वरूप, बाहर रखा पिक्सल ब्लू रंग जाएगा । नोट, यह चरण वैकल्पिक है । दूसरे कदम के लिए संकेत के बिना छवि के एक हिस्से में रॉय आकर्षित (मध्य पैनलों में लाल चौकों), रॉय का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय है, और पूरी छवि से उस राशि घटाना, एक पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप छवि घटाई (सही पैनल) । mCherry चैनल में छवि द्वारा pHluorin चैनल में छवि को विभाजित करने के लिए छवि परिकलन फ़ंक्शन का उपयोग करने के लिए तीसरा चरण है । परिणाम एक छवि grays लुकअप तालिका के साथ प्रदर्शित किया जाएगा और छवि प्रदर्शन के लिए पूरे गतिशील छवि के बिट गहराई द्वारा प्रदान की रेंज अवधि सेट मूल्यों । अंतिम चरण के लिए छवि प्रदर्शन सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक अधिक उपयुक्त श्रेणी और किसी लुकअप तालिका का चयन करने के लिए है । (B) नमूना छवियां किसी छवि परिकलन के परिणाम को ंयूनतम प्रदर्शन मान 0 पर सेट और चार भिंन लुकअप तालिकाओं का उपयोग कर २.५ पर सेट अधिकतम प्रदर्शन मान के साथ दिखाती है । प्रत्येक छवि के आगे आयत प्रत्येक लुकअप तालिका के लिए डायनेमिक श्रेणी में उपयोग किए गए रंग दिखाता है । ध्यान दें कि हिलो, 16 रंग, और थर्मल, अलग रंग के लिए पिक्सल के लिए उपयोग किया जाता है एक तीव्रता मान के साथ 0 या अधिकतम (उदा, नीला और लाल, क्रमशः, हिलो में) । यह गतिशील रेंज की सीमा का एक आसान दृश्य संदर्भ प्रदान करता है, दर्शक को देखने के लिए अनुमति देता है कि संकेत गतिशील रेंज के भीतर है । (C) स्क्रीन शॉट दिखा रहा है विकल्प चयनित जब ImageJ में एक फ़ाइल आयात जैव स्वरूपों का उपयोग कर प्लग-इन । स्केल बार्स 10 µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

लड़की = "jove_content" के लिए: रख-साथ । भीतर-पृष्ठ = "1" >Figure 5
चित्र 5: pseudocolored ratiometric छवियों की छवि प्रदर्शन मान सेट करना. न्यूनतम और अधिकतम छवि प्रदर्शन मान सेट किया जाना चाहिए ताकि बिकारबोनिट स्थिति और साथ ही दोनों nigericin स्थितियों से छवियों में संकेत डायनेमिक श्रेणी के भीतर हैं । इस बिंदु को समझाने के लिए, तीन स्थितियों में से प्रत्येक से दो छवियों थर्मल लुकअप तालिका का उपयोग चार अलग छवि प्रदर्शन सेटिंग्स (0-0.5, 0-1, 0-2.5, और 0-5) के साथ दिखाया गया है । ध्यान दें कि, सभी तीन प्रायोगिक शर्तों के लिए, जब छवियों को प्रदर्शित अधिकतम ०.५ के लिए सेट मूल्य के साथ प्रदर्शित कर रहे हैं, संकेत के बहुत पर या वर्णमिति पैमाने पर अधिकतम के पास है, और जब यह ५.० के लिए सेट किया गया है, संकेत के बहुत पर या कम के पास रंग पर है imetric केल. इन दोनों मामलों में, ऊतक के पार mCherry अनुपात करने के लिए pHluorin में मतभेद आसानी से सराहना नहीं की जा सकती है तो इन सेटिंग्स आदर्श नहीं हैं । इसके विपरीत, १.० या २.५ के अधिकतम प्रदर्शन मान अधिक उपयुक्त हैं । इन सेटिंग्स के साथ, ऊतक भर में अनुपात में मतभेद आसानी से सराहना की जा सकती है, और सभी तीन प्रयोगात्मक शर्तों से छवियों में संकेत रंग है कि वर्णमिति पैमाने की गतिशील रेंज के भीतर कर रहे हैं में प्रदर्शित कर रहे हैं । स्केल पट्टियां लगभग 10 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम wildtype ऊतक के भीतर FSC वंश में कोशिकाओं के फी को मापने के लिए एक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को विकसित किया गया है और पिछले पांच वर्षों में परिष्कृत, क्योंकि हम पहली बार Drosophila डिम्बग्रंथि ऊतक में फी का अध्ययन करने के लिए शुरू किया । उस समय के दौरान, प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक हमारे प्रयोगशाला में कई जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है और कम से कम चार अलग कताई डिस्क और लेजर स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी पर । हमारे मूल प्रेक्षण के reproducibility, कि फी बढ़ाता है FSC वंश में कोशिकाओं के रूप में स्टेम सेल से पीएफसी को कूप कोशिका राज्य में अंतर है, इन एकाधिक परीक्षणों के पार दोनों को दर्शाता है कि इस जैविक घटना मजबूत है और है कि कार्यप्रणाली विश्वसनीय है । हालांकि, हमारे अनुभव में, यह मास्टर करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है । यह हर कदम पर विस्तार के लिए करीब ध्यान की आवश्यकता है, और तेजी से, विच्छेदन के उच्च कुशल निष्पादन, बढ़ते, और इमेजिंग कदम । के रूप में प्रोटोकॉल में कहा गया है, विच्छेदन और बढ़ते प्रक्रिया एक 10 मिनट की मशीन भी शामिल है, लेकिन 15 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए कुल और इमेजिंग प्रक्रिया ४५ मिनट में पूरा किया जाना चाहिए । आदर्श शर्तों के तहत, Drosophila ovarioles संस्कृति में 14 ज17तक के लिए बनाए रखा जा सकता है, लेकिन हमने पाया है कि ऊतक के लिए मानक curves उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया nigericin बफ़र्स में अधिक तेजी से मरना शुरू होता है । हमारे दिशानिर्देश यह सुनिश्चित करते हैं कि सभी डेटा एकत्र किए जाते हैं, जबकि समय की खिड़की के भीतर ऊतक अभी भी अच्छी तरह से है कि यह स्वस्थ और सामान्य आकृति दिखाई देता है । यह हर कदम के लिए ज्यादा समय नहीं छोड़ करता है, हालांकि, इसलिए यह आगे की योजना के लिए सुनिश्चित करें कि सब कुछ एक कदम से अगले करने के लिए आगे बढ़ने के लिए तैयार है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । वास्तव में, यह बहुत अधिक कुशल है अगर दो लोगों को एक साथ विच्छेदन पर काम करते हैं, बढ़ते, और इमेजिंग प्रक्रियाओं, एक व्यक्ति के साथ एक कदम क्रियांवित जबकि अंय व्यक्ति अगले कदम के लिए तैयार करता है ।

के बाद से फी प्रयोगात्मक, जैसे तापमान और बफर संरचना के रूप में ऊतक पूर्व vivoछवि के लिए आवश्यक हेरफेर करने के लिए संवेदनशील हो सकता है, इस विधि फी में रिश्तेदार परिवर्तन की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा है. यह देखते हुए कि जांच दो अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के होते हैं, उनके क्वांटम उपज, जीवन समय की तरह प्रतिदीप्ति गुण है, और तह गुण अलग सेल प्रकार में भिंन तरीके से प्रभावित हो सकता है । इसलिए, यह nigericin बफ़र शर्तों के साथ इलाज नमूनों को शामिल करने के लिए और प्रत्येक परीक्षण में प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए एक नया अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए उन्हें का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । परिवर्तनशीलता के लिए अतिरिक्त स्रोतों को कम करने के लिए, इमेजिंग के दौरान सभी शर्तों को सुसंगत रखने पर बल दिया जाता है । nigericin बफर स्थितियों में नमूने तैयार किया जाना चाहिए और बिकारबोनिट बफर हालत में उन लोगों के रूप में एक ही दिन पर छवि और तैयारी और सभी नमूनों की छवि अधिग्रहण के रूप में संभव के रूप में संगत रखा जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि फी माप छवि सेट के बीच तुलना पर आधारित होते हैं, इसलिए प्रायोगिक अंतर जो कि एक या अधिक इमेज सेट्स में mCherry और pHluorin का पता लगाने को प्रभावित करते हैं, फी अनुमानों की सटीकता को कम कर सकते हैं । ऐसे photomultiplier ट्यूबों के वोल्टेज सेटिंग्स में परिवर्तन के रूप में कारक (यदि एक लेजर का उपयोग कर फोकल स्कैनिंग) या जोखिम बार (यदि एक कताई डिस्क फोकल का उपयोग कर) या एक गंदा लेंस कि कैमरे तक पहुंचने प्रकाश की मात्रा कम कर देता है, स्पष्ट रूप से परिणाम को प्रभावित करेगा . लेकिन वहां रहे है एक अंय अधिक सूक्ष्म कारकों के असंख्य है कि दिन से भिंन हो सकते है दिन के लिए और भी परिणामों को प्रभावित कर सकता है, जैसे कि अगर मक्खियों अच्छी तरह से खिलाया, मक्खियों की उंर है, और कब तक पराबैंगनीकिरण इमेजिंग करने से पहले पर किया गया है । तैयारी और इमेजिंग एक ही दिन में सभी तीन शर्तों इन मतभेदों को कम करता है और इस प्रकार सबसे सुसंगत परिणाम होगा । विशेष रूप से, हर बार हम एक नया माइक्रोस्कोप या माइक्रोस्कोप के घटकों के लिए बंद उन्नत थे, यह नए उपकरणों पर सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक था. यह अक्सर व्यक्तिगत माप के औसत मूल्यों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप लेकिन, के रूप में लंबे समय के रूप में नए अंशांकन curves प्रत्येक परीक्षण के साथ उत्पंन किया गया, उपकरणों में परिवर्तन फी अनुमान पर एक ंयूनतम प्रभाव था । इसके अलावा, प्रासंगिक तुलना अक्सर एक ही ऊतक के भीतर कर रहे हैं कि विभिन्न कोशिका प्रकार के बीच है (उदा., FSCs, pFCs और कूप कोशिकाओं) और इस तरह प्रयोगात्मक बदलाव के लिए आंतरिक रूप से नियंत्रित कर रहे हैं ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल wildtype ऊतक के फी को मापने पर ध्यान केंद्रित किया है, पद्धति इस तरह के RNAi की अभिव्यक्ति या एक transgene यूएएस का उपयोग कर के रूप में जीन अभिव्यक्ति, हेर-फेर के लिए मानक Drosophila तरीकों के साथ संगत है/Gal4, और मोज़ेक विश्लेषण. mCherry के बाद से::p hluorin एक यूएएस प्रवर्तक से प्रेरित है, यह हमेशा सह होगा RNAi या transgene के साथ व्यक्त किया, और MARCM18 homozygous के साथ mCherry उत्परिवर्ती क्लोनों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता::p hluorin क्लोनल मार्कर के रूप में. ऊपर वर्णित कारणों के लिए, wildtype ऊतक एक उत्परिवर्ती जीनोटाइप के साथ हर परीक्षण के साथ एक नियंत्रण के रूप में विश्लेषण किया जाना चाहिए । अन्त में, यहाँ वर्णित सामान्य सिद्धान्तों को mCherry के उपयोग पर लागू किया जा सकता हैः:p hluorin अन्य ऊतकों में फी मापने के लिए भी. दरअसल, इस प्रोटोकॉल mCherry का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था::p hluorin Drosophila नेत्र7में फी उपाय करने के लिए, और हम छवि mCherry के लिए इसी तरह की पद्धति का इस्तेमाल किया है: hluorin मस्तिष्क में:p लार्वा । कुल मिलाकर, यहां वर्णित उपकरणों और विधियों में vivo में फी के कई विविध कार्यों की जांच करने के लिए जीने के भीतर, बरकरार ऊतक नए अवसर प्रदान करते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

हम पांडुलिपि पर सुझावों के लिए प्रोटोकॉल और Diane नाई के योगदान के लिए Bryne Ulmschneider धंयवाद । यह काम एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा वित्त पोषित T.G. Nystul और D.L. नाई को GM116384 गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

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References

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