Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Wij bieden een protocol voor imaging intracellulaire pH van een geslacht epitheliale cel van de stam in levende Drosophila eierstokweefsel. We beschrijven de methoden voor het genereren van transgene vliegen uiten een pH biosensor, mCherry::pHluorin, image de biosensor met behulp van kwantitatieve fluorescentie imaging, standaard curven genereren en fluorescentie intensiteitswaarden omzetten in pH-waarden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tatapudy, S., Benitez, M., Nystul, T. Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue. J. Vis. Exp. (127), e56316, doi:10.3791/56316 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Veranderingen in de intracellulaire pH (pHi) een belangrijke rol spelen bij de regulering van vele cellulaire functies, met inbegrip van het metabolisme, proliferatie en differentiatie. Typisch, pHi dynamiek zijn bepaald in gekweekte cellen, die zich lenen voor het meten en manipuleren van experimenteel pHi. Echter heeft de recente ontwikkeling van nieuwe instrumenten en methodologieën het mogelijk gemaakt om te studeren pHi dynamiek binnen intact, levend weefsel. Voor onderzoek van de Drosophila , was een belangrijke ontwikkeling de generatie van een transgene lijn uitvoering een pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Hier beschrijven we een protocol die we regelmatig voor imaging live Drosophila ovarioles gebruiken voor het meten van pHi in de bloedlijn van de cel van de stam (FSC) epitheliale follikel in mCherry::pHluorin transgene wild type lijnen; de hier beschreven methoden kunnen echter gemakkelijk aan te passen voor andere weefsels, inclusief de vleugel schijven en oog epitheel. We beschrijven technieken voor het uitdrukken van mCherry::pHluorin in de bloedlijn van de FSC, handhaven van eierstokweefsel tijdens live imaging, verwerven en analyseren van beelden om te verkrijgen van pHi waarden.

Introduction

Recente studies bleek een rol voor veranderingen in pHi tijdens cellulaire differentiatie en dysplasie in vivo1,2. Deze studies gevonden dat die pHi strookt opmerkelijk in cellen van hetzelfde type dezelfde stadium van differentiatie, maar dat verandert als de overgang van één fase naar de andere cellen. In sommige gevallen verstoort gedeeltelijk blokkeren van de veranderingen in pHi differentiatie, suggereren dat de verandering in pHi niet alleen een gevolg van veranderingen in het lot van de cel is, maar in plaats daarvan draagt bij tot de bevordering van de verandering in het lot van de cel, misschien via effecten op pH-gevoelige regelgevende eiwitten of chemische reacties die nodig zijn voor differentiatie. Toekomstige studies hebben het potentieel om te onthullen meer inzicht in de vele verschillende rollen van pHi dynamiek in vivo. Echter, een van de uitdagingen van het bestuderen van pHi tijdens differentiatie in vivo is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van pHi. In tegenstelling tot andere functies van differentiatie, zoals veranderingen in de morfologie van de cellulaire en genexpressie, is pHi een onstabiele chemische eigenschap van de cel die wordt niet bewaard in cellen die zijn vastgesteld en met standaardmethoden permeabel. Bovendien, pHi mogelijk niet stabiel in cellen die zijn beklemtoond of sterven als gevolg van experimentele manipulatie. Het is dus belangrijk om te houden van cellen in levend en zo gezond mogelijk in bij het meten van pHi. Verschillende essentiële kleurstoffen zijn beschikbaar dat werk goed voor het meten van de pHi van cellen in cultuur-3, maar in veel gevallen zij zijn niet geschikt voor in vivo studies omdat zij doen niet het weefsel doordringen, diep of gelijkmatig voldoende om nauwkeurige metingen .

Om te omzeilen het probleem van de arme kleurstofpenetratie, hebben wij en anderen gebruikt een genetisch gecodeerde sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, dat kan worden uitgedrukt specifiek in de cel soorten belang en verbeelde in levend weefsel. pHluorin is een variant van GFP met een hogere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) dat past beter bij een hogere pH; Zo verhoogt de intensiteit van de fluorescentie totaal uitgestoten uit een populatie van pHluorin moleculen in de cel met de toenemende pHi8. Nog belangrijker is, is de fluorescentie lineaire binnen de normale cytosolische waardebereik pHi. In contrast, de fluorescentie van mCherry (pKa ~ 4.5) is ongevoelig voor pH veranderingen binnen het cytosolische bereik. Deze twee verslaggevers zijn covalent samen als een enkele chimeer eiwit, gecodeerd door een enkele open leesraam, zodat ze altijd in gelijke hoeveelheden aanwezig gekoppeld. De verhouding van pHluorin naar mCherry fluorescentie intensiteit biedt daarom een meting van pHi dat is genormaliseerd naar de concentratie van de sonde in elke cel. De ratio's kunnen vervolgens worden geconverteerd naar raming van pHi waarden met behulp van een standaard curve die wordt gegenereerd door het verkrijgen van de pHluorin te mCherry ratio's van weefsels die bekende pH waarden hebben zijn geëquilibreerd.

Hier beschrijven we de methoden voor het gebruik van mCherry::pHluorin voor het meten van de pHi van de epitheliale FSC overdrachtslijn in de Drosophila eierstok. Dit goed gekarakteriseerd weefsel is gebruikt om het model van de vele verschillende aspecten van de epitheliale biologie, zoals de cel van de stam zelf-vernieuwing en differentiatie9,10,11, collectieve cel migratie12 , en de ontwikkeling en het onderhoud van13,14van de polariteit van de cel. Het epitheel van de follikel wordt geproduceerd door twee FSCs die zich op de voorste rand van het weefsel in een structuur genaamd de germarium15,16 bevinden. Deze cellen verdelen regelmatig tijdens volwassenheid zichzelf vernieuwen en produceren nakomelingen, oftewel prefollicle cellen (PFK's), die kunnen de niche opnieuw in te voeren en geworden een FSC of in een van drie verschillende follikel celtypes te differentiëren: polar cellen, cellen van de stengel, of hoofdtekst follikel cellen. We bleek eerder dat in wildtype weefsel, de pHi gestaag toeneemt tijdens de vroege stadia van differentiatie, vanuit een pHi van ongeveer 6,8 in FSCs naar 7.0 in PFK's, tot 7.3 in follikel cellen2. Het blokkeren van deze stijging door RNAi knockdown van een overal uitgedrukt natrium/proton-wisselaar, DNhe2, ernstig schaadt pFC differentiatie, overwegende dat de toenemende pHi door overexpressie van DNhe2 veroorzaakt een milde overtollige differentiatie fenotype. Deze bevindingen tonen aan dat pHi stabiel in de vroege FSC bloedlijn wordt gehandhaafd en dat het experimenteel kan worden verhoogd of verlaagd in vivo. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor het meten van pHi wildtype weefsel of verschillende vormen van mutant weefsel, met inbegrip van RNAi knockdown of overexpressie met behulp van een Gal4 van belang, en de mitotische klonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: voor het meten van pHi in de bloedlijn van de FSC, wij berekenen van de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie van pHluorin naar mCherry in FSCs, PFK's en follikel cellen in fysiologische omstandigheden en zet de verhoudingen in pHi waarden met standaard kalibratiekrommen voor elke cel type 7. Eerste, levende imaging experimenten worden uitgevoerd voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van pHluorin en mCherry in germaria ontleed in een buffer met NaHCO 3, die fysiologische omstandigheden 1 , bootst 7. volgende, standaard curven worden gegenereerd door het meten van pHluorin en mCherry fluorescentie-intensiteiten in een nb +-gratis, K + buffer met de nigericin van de ionophore aangepast aan twee verschillende pH-waarden, 6.5 en 7.5. In aanwezigheid van nigericin equilibrates pHi met de pH van de buffer in het plasma-membraan, pHi aan de extracellulaire pH veroorzaken. Tot slot, de standaard curven worden gebruikt voor het converteren van pHluorin naar mCherry ratio's geschatte pHi waarden.

1. pre-trial: voorbereiding voor het meten van pHi In Vivo

Opmerking: voor het meten van pHi in vivo, de mCherry::pHluorin transgenic moet worden uitgedruct in het celtype van belang. Hieronder staan enkele gangbare manieren voor het genereren van transgene pHluorin vliegt in de bloedlijn van FSC. Genereren van mCherry::pHluorin klonen is vooral handig voor het identificeren van FSCs, die zich op de voorste rand van een FSC-kloon bevinden. Weefsel specifieke mCherry::pHluorin uitdrukking is nuttig voor het meten van pHi over het hele weefsel en is ook handiger bij het combineren met de uitdrukking van een RNAi of transgenic.

  1. Generatie transgene pHluorin vliegt
    1. mCherry::pHluorin-met het label FSC klonen
      1. om mCherry::pHluorin FSC klonen, steken UAS-mCherry::pHluorin 1 naar een Act-Gal4 uit voorraad of andere voorraad met een Flp/FRT afleidbare Gal4.
      2. Om heatshock afleidbare klonen, heatshock volwassen F1s voor 2 dagen post eclosion in lege flesjes gedurende 1 uur in een waterbad 37 ° C, vier keer ongeveer elke 12 h.
      3. Om te zorgen voor normale groei en maximale stijgingspercentages van de oögenese tijdens deze periode, vliegen te handhaven door middel van verse natte gist (ongeveer gelijke delen droog baker ' s gist en water) dagelijks gedurende ten minste 6 dagen na kloon inductie.
    2. Weefsel specifieke mCherry::pHluorin expressie
    3. UAS-mCherry::pHluorin 1 te steken naar een follikel cel specifieke driver, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
    4. 3 dagen na het vliegen beginnen eclosing, verzamelen en plaats ze in flesjes met natte gist, gedurende ten minste 24 uur vóór de dissectie.
  2. Oplossingen maken
    Opmerking: het is belangrijk om de volgende buffers voor te bereiden op de dag van het experiment omdat de pH en de opgeloste stof concentraties in de buffer na verloop van tijd veranderen kunnen.
    1. Voorbereiden bicarbonaat, nigericin en dissectie buffers. Voeg de onderdelen in de volgorde weergegeven om te voorkomen dat de vorming van precipitaten (verwijs naar tabel 1 tabel 2 en tabel 3).

2. Trial: Meten van pHi in de bloedlijn van FSC

Opmerking: de dissectie, montage-, en live imaging stappen voor de buffer bicarbonaat en de twee nigericin buffer voorwaarden kunnen moeten worden uitgevoerd tweemaal: om te bepalen van de Microscoop instellingen en een tweede keer voor het verzamelen van experimentele gegevens. Zie de sectie 2.2 hieronder voor meer informatie.

  1. Dissectie en montage
    Opmerking: voor de materialen die zijn vereist voor het uitvoeren van deze stap verwezen naar Figuur 1 en Tabel van materialen. Voor 3D gedrukte montage chambers, worden 3D-printerbestanden geleverd als aanvullend bestand 1 en aanvullende bestand 2.
    1. Dissectie:
      1. voorbereiden montage kamers door toepassing van een dunne laag vacuüm vet op de platte kant van de 3D-afgedrukt montage kamer. Plaats die kant op een dekglaasje 22 x 40 mM aan te verzegelen het dekglaasje aan aan de montage kamer.
    2. Ontleden eierstokken van vrouwelijke volwassen vliegen in 500 µL dissectie buffer (bicarbonaat of nigericin buffer, tabel 3)
      1. Anesthetize 3-4 vliegen met behulp van CO 2 gas en overdracht vliegt op een vlieg pad geperfundeerd met CO 2 gas.
      2. Halen een narcose fly met pincet en plaats in de media van de dissectie.
      3. Knijpen de thorax van de vlieg met een forcep, terwijl het trekken op het puntje van haar buik, totdat haar eierstokken blootstaan.
      4. Na het loskoppelen van de eierstokken van andere organen, plagen uit elkaar de ovarioles gebruik van 22 1/2 spuit naalden. Zorgvuldig aparte de spier schede van de eierstokken en de afzonderlijke individuele ovarioles uit het cluster van ovarioles. Een effectieve techniek om te isoleren van het omhulsel van de spier is het gebruik van één naald van de spuit te houden van het cluster van ovarioles op hun plaats aan de voorste einde lijn naar beneden langs de lengte van één ovarioles.
      5. Broeden de ontleed eierstokken in dissectie media gedurende precies 10 minuten voordat u de montage stap zodat er genoeg tijd voor de pHi van cellen volledig equilibreer met de pH van de media van de dissectie nigericin.
        Opmerking: Zorg ervoor dat het omhulsel van de spier wordt verwijderd uit de ovarioles. Het omhulsel van de spier kan verzachten de fluorescentie-signaal, waardoor het moeilijk om te bepalen van individuele cellen met behulp van Concanavilin-A, en kan leiden tot ovarioles om te gaan spontaan tijdens live imaging.
    3. Montage
      1. een kleine daling van de dissectie media op het glas dekglaasje aan plaats binnen de montage kamer.
      2. Overdracht gescheiden ovarioles met behulp van de verlostang.
      3. Scheiden later stadium ei kamers van germaria die zijn gekoppeld aan eerdere fase ei kamers, en proberen ervoor te zorgen dat de ontleed germaria worden geplaatst in het midden van de daling van de media van de dissectie.
      4. Toevoegen van twee kleine druppels nagellak aan weerszijden van een ronde 12-mm dekglaasje aan en laat het lucht droog is voor ongeveer 10 s.
      5. Plaats de ronde dekglaasje aan op de daling van de dissectie media met gescheiden germaria zodanig dat die kant met nagellak naar beneden gezichten en contacten van de dissectie-media. Druk naar beneden op de delen van de rand met nagellak afvlakken en beveiligen van de germaria in positie. Raden we oudere nagellak omdat het minder over het oppervlak van het dekglaasje aan als het op zijn plaats wordt beveiligd uitstrijkjes.
      6. Vullen de montage kamer met aanvullende dissectie media. Voorwaarde specifieke buffer die geen Concanavalin-A kleurstof bevat kan worden gebruikt voor het vullen van de kamer.
        Opmerking: De totale tijd doorgebracht ontleden en montage mag niet hoger zijn dan 15 min. Dit is belangrijk voor het minimaliseren van de effecten van weefselschade en cel dood.
  2. Live beeldvorming:
    Opmerking: In deze stap eerst verzamelen beelden uit de bicarbonaat voorwaarde en de twee voorwaarden van de nigericin om te bepalen van de juiste Microscoop instellingen; de Microscoop instellingen aanpassen als dit nodig is, en dan het verzamelen van beelden voor de experimentele gegevens. Gebruik een confocal microscoop staat voor imaging in 3 kanalen: GFP (475 excitatie/509 emissie), mCherry (575 excitatie/610 emissie), en far-red (633 excitatie/647 emissie).
    Opmerking: De instellingen van de Set Microscoop: de intensiteiten van de pixel van de beelden verzameld zal worden gekwantificeerd om te bepalen van de raming van de pHi, dus is het belangrijk dat de intensiteitswaarden van het signaal in elke afbeelding set is niet te laag of verzadigd. Het bereik van intensiteit, die kan worden vastgelegd in een afbeelding is gedefinieerd door de bitdiepte van de afbeelding. In veel gevallen, 8-bits afbeeldingen worden gegenereerd door standaard, maar we raden het verwerven van de gegevens als 16-bits afbeeldingen, die een bredere dynamische waaier hebben. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de Overspraak tussen fluorescerende kanalen wordt geminimaliseerd, zodat de instellingen moeten worden aangepast zodat het emissiespectrum verzameld uit elke fluorophore niet overlapt. Om te testen deze instellingen, neem een voorbeeldafbeelding gebruik van het spectrum van excitatie voor GFP en verzamelen in de emissie spectrum voor mCherry en vice versa. Als de instellingen correct zijn gecorrigeerd, moet er geen signaal in beide gevallen. De instellingen van de Microscoop (dat wil zeggen, spanning instellingen op het scannen van een laser confocal, laser macht en pinhole grootte) ingesteld zodat de intensiteiten van de pixel van het signaal in alle drie afbeelding sets binnen het dynamische bereik van het afbeeldingsbestand zijn. Voor alle onze experimenten gebruikten we een witte lichte laser scannen confocal microscoop met een 40 x doelstelling aan te schaffen van 16-bits afbeeldingen in 1024 × 1024-indeling, terwijl we geoptimaliseerd spanning winst voor elk experiment zo nodig. Bijvoorbeeld in één experiment, stellen we de spanning winst voor GFP, mCherry, en far-red als 37,8%, 72.9% en 260%, respectievelijk.
    1. Beeld van ovarioles in nigericin dissectie buffer met een pH van 6.5 en instellingen aanpassen, zodat de pixel intensiteiten van de pHluorin en mCherry beelden zijn laag, maar niet onder de grenzen van de detectie van de camera.
    2. Beeld van een andere set van ovarioles in nigericin dissectie buffer met een pH 7.5 en pas de instellingen zodanig dat de pixel intensiteiten van de pHluorin en mCherry beelden hoog, maar niet verzadigd zijn.
    3. Afbeelding eierstokken in bicarbonaat dissectie buffer en ervoor te zorgen dat de pixel intensiteiten van de pHluorin en mCherry beelden niet zijn verzadigd met de gekozen instellingen. Als de pixels zijn verzadigd, de instellingen aanpassen als dit nodig is.
      Opmerking: Microscoop instelling parameters kunnen verschillen op basis van de exacte Microscoop setup wordt gebruikt, en voor elk experiment moet worden geoptimaliseerd. Nadat Microscoop instellingen zijn ingesteld, niet wijzigt voor de rest van het experiment. De instellingen moeten consistent over controle en experimentele omstandigheden. In onze eerste pHi experimenten, we 2 en 3 punt nigericin kalibratiekrommen gegenereerd en vond geen significant verschil tussen de berekende pHi met behulp van beide methoden. Echter in het algemeen, de toevoeging van meer punten in de kalibratiekromme zou worden verwacht dat verbetering van de nauwkeurigheid. Daarom raden we genereren van krommen met verschillende aantallen punten om te bepalen hoeveel er nodig voor een bepaalde set van proefomstandigheden.
  3. Gegevensverzameling:
    1. dissectie, montage, en beeldvorming van de monsters onder de buffer bicarbonaat en nigericin uitvoeren. Na dissectie en montage, de maximale tijd doorgebracht imaging één set monsters mag niet meer dan 45 min om ervoor te zorgen dat de fluorescentie intensiteit zijn metingen in live, gezonde weefsel.
    2. Voor elke voorwaarde, verwerven beelden voor ten minste 5 germaria.

3. Na trial: Beeldanalyse

  1. maatregel fluorescentie intensiteiten in FSCs, PFK's, en follikel cellen
    1. achtergrond aftrekken:
      1. Open onbewerkte beelden in FIJI met elk kanaal in een afzonderlijk venster ( figuur 4C).
      2. Gebruik van het rechthoekgereedschap om te tekenen van een regio van belang (ROI) in het venster kanaal pHluorin in een deel van de afbeelding zonder signaal.
      3. Optioneel stap: instellen van de ondergrens van de drempel, zodat pixels met intensiteitswaarden onder achtergrond zijn uitgesloten en de bovengrens van de drempel tot maximum ingesteld. Wanneer de drempel is ingesteld op deze manier, de gebieden van de afbeelding zonder signaal zijn meestal blauw en het signaal is duidelijk zichtbaar ( figuur 4A).
      4. De intensiteit van de fluorescentie van het
      5. maatregel het gemiddelde in de ROI. Als de drempel was ingesteld in stap 3, zorg ervoor om de " limiet aan drempel " vak in het dialoogvenster Set metingen.
      6. Aftrekken van de intensiteit van de gemeten achtergrond van elk kanaal en het segment van de afbeelding met behulp van de functie van aftrekken, gevonden in het proces → Math menu.
      7. Herhaal stappen 3.1.1.2-6
      8. voor het mCherry kanaal venster behalve dat in stap 3.1.1.2, gebruiken in plaats van een nieuwe rechthoek met het rechthoekgereedschap, de selectie van de herstelfunctie, gevonden in het Edit → keuzemenu, toe te voegen een rechthoek met dezelfde afmetingen en positie op de afbeelding.
    2. Identificeren FSCs, PFK's en follikel cellen:
      1. identificeren de FSCs, PFK's en follikel cellen door morfologie en locatie met behulp van de Concanavalin-A kleuring te vinden celbegrenzing ( Figuur 2).
      2. FSCs zijn dunne driehoekige cellen gelegen aan de rand van de germarium aan de grens van de regio 2a/2b. Als mCherry::pHluorin wordt uitgedrukt in een FSC-kloon, FSC kan ook worden geïdentificeerd als de anterior meeste cel van de kloon.
      3. PFK's zijn onregelmatig gevormde cellen in regio 2b, direct grenzend aan en "downstream" van FSCs.
      4. Follikel cellen zijn vierkant of zuilvormige cellen rondom de geslachtscellen cyste in gebied 3.
    3. Verkrijgen van fluorescentie intensiteit ratio's
      1. kiest een of meerdere segmenten waarin de cel van belang hoogste intensiteit van de fluorescentie in het mCherry-kanaal heeft en zorg ervoor dat de Concanavalin-A kleuring, gezien in het far-red kanaal, in foc ons binnen het geselecteerde segment.
      2. Tekenen rond elke FSC en de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van pHluorin en mCherry in alle segmenten voor metingen gekozen maatregel ROI.
      3. Verdelen van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het pHluorin-kanaal door de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het kanaal van de mCherry voor de berekening van een ratio van pHluorin naar mCherry fluorescentie.
  2. Afleiden pHi waarden en pseudocolored afbeeldingen genereren
    1. afleiden pHi waarden
      1. In alle gevallen de lineaire regressie curve moet worden gegenereerd met behulp van de eierstokken van vliegen dezelfde genotype voor beide experimentele encontrole voorwaarden. Het genereren van een lineaire regressie curve voor elk celtype met de gegevens uit twee nigericin buffer voorwaarden ( Figuur 3). In Excel, kan dit worden gedaan door het uitzetten van de gegevens in een grafiek en een lineaire trendlijn toe te voegen. Afwisselend, zie:
      2. Gebruik de richtingscoëfficiënt en het y-snijpunt van de lineaire regressie curve berekend op basis van de voorwaarden van de nigericin en de vergelijking van een lijn (y = mx + b) de pHluorin omzetten in mCherry verhouding waarden berekend op basis van de monsters in het bicarbonaat voorwaarde voor pH-waarden. In deze vergelijking, de helling vorm (het y-snijpunt) in plaats van b, zet de waarde van de verhouding in voor x en op te lossen voor y.
    2. Een pseudocolored image als gevolg van de waarden van de verhouding in FIJI.
      1. Volg de bovenstaande procedure voor achtergrond aftrekken (stap 3.1.1 en Figuur 4).
      2. Verdelen het kanaal van de pHluorin van het mCherry-kanaal met behulp van de functie voor het berekenen van de afbeelding, gevonden in het menu proces. Zorg ervoor dat de " maken nieuw venster " en " 32-bits (float) resultaat " beide selectievakjes zijn ingeschakeld. Wijzigen van de opzoektabel (LUT), te vinden onder het menu afbeelding, thermische of LUT van keuze. Zie Figuur 4 voor andere geschikte opties.
      3. In het dialoogvenster aanpassen helderheid en contrast (Image → aanpassen → Helderheid/Contrast), klikt u op de " Set " knop. Set de Minimum waarde aan 0 weergegeven en de maximale waarde wordt weergegeven naar een verhouding die het beste vangt in de gegevens, meestal 1.0-2.0 ( Figuur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier hebben we het proces voor het meten van pHi in de follikel epitheel, waarbij verschillende stappen beschreven. Eerst worden de eierstokken ontleed van vliegen genotype de juiste hulpprogramma's voor ontleden en montage (Figuur 1). De ovarioles zijn dan beeld met behulp van kwantitatieve fluorescentie microscopie en de beelden worden geanalyseerd om te verkrijgen van de metingen van pHi. Voor elke afbeelding, worden de celtypes van belang geïdentificeerd, zoals beschreven in sectie 3.1 (Figuur 2). De verhouding van de intensiteit van de fluorescentie in de GFP en mCherry kanalen wordt geconverteerd naar pHi waarden met een standaard curve (figuur 3A) zoals beschreven in punt 3.2. Met behulp van deze methode, vonden we dat pHi verhoogt met differentiatie in de vroege FSC geslacht, van 6,8 in FSCs, aan 7.0 in prefollicle cellen, voor 7,3 in follikel cellen (figuur 3B). De pHi-waarden van elk celtype kunnen grafisch worden weergegeven zoals in figuur 3B, of als een pseudocolored opname toont dat de verschillen in pHluorin te mCherry ratio's (Figuur 4 en Figuur 5). In deze beelden, worden verschillen in de pHluorin tot mCherry ratio's weergegeven als de verschillen in kleur, zoals gedefinieerd door een LUT. Het is belangrijk om een LUT en maximale en minimale waarden voor het bereik van kleuren om een afbeelding produceert die meeste representatief is voor de gegevens te selecteren. Hoewel, in het algemeen, de keuze van LUT en bereik instellingen zal niet geven van verschillen die niet in het beeld aanwezig zijn, kan een minder geschikt keuze van LUTs duistere pHi verschillen aanwezig in de opname (Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: Materialen voor dissectie en montage Drosophila ovarioles. (A) een afbeelding weergegeven:: nagellak (1); (2) vacuüm vet en bekerglas en Pipetteer tip gebruikt voor het toepassen van vet; (3) 23-gauge syringe naalden; (4) Dumont Inox pincet, grootte 5; (5) 3D afgedrukt montage kamer; (6) 22 x 40 mM glas coverslips; (7) ronde glazen Coverslips, diameter 12 mm, 0.13-0,16 mm dikte; en (8) 9-well glas ontrafeling schotel. (B) een close-up beeld van de 3D-afgedrukt montage kamer. (C) een afbeelding toont een ontleed paar van wildtype eierstokken. (D) een afbeelding weergegeven: goed gescheiden ovarioles. (E) A beeld van de 3D kamer met ontleed eierstokken gemonteerd onder een dekglaasje ronde glazen aan. De zwarte stippen zijn druppels nagellak gebruikt om de ronde dekglaasje aan op zijn plaats houden. (F) een beeld van ontleed ovarioles onder een ronde glazen dekglaasje aan na montage. De zwarte doos geeft een provincie aan de afbeelding met een enkele ontleed ovariole. Schaal staven ongeveer 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: identificatie van FSCs, PFK's en follikel cellen. Twee voorbeelden van germaria met UAS-mCherry::pHluorin en 10930-Gal4 gekleurd met Concanavilin-A. Een overzicht van een FSC, een pFC en een follikel cel ROI wordt weergegeven in elke afbeelding. De intensiteit van de gemiddelde fluorescentie in de kanalen van pHluorin en mCherry worden gebruikt voor het berekenen van de pHluorin te mCherry ratio's. Schaal staven ongeveer 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: pHi toeneemt tijdens de differentiatie in de bloedlijn van de FSC. Representatieve resultaten ontleend aan Ulmschneider et al. 2 weergegeven:: (A) een lineaire regressie met typische kromme gebruikt voor het berekenen van de pH waarden van pHluorin tot mCherry de verhoudingen; en (B) de berekende pHi-waarden met de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor FSCs, PFK's en follikel cellen. Dit cijfer is aangepast na toestemming, van Ulmschneider et al. 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: met behulp van FIJI voor het genereren van een afbeelding van de pseudocolored ratiometric. (A) afbeeldingen tonen de resultaten van elke stap in de achtergrond aftrekken proces. Beginnend met een onbewerkte afbeelding (links panelen), is de eerste stap de drempelwaarden instellen zodat pixels met intensiteitswaarden onder achtergrond zijn uitgesloten. De bovengrens van de drempel is tot maximaal ingesteld. FIJI zal kleuren de uitgesloten pixels blauw, wat resulteert in een afbeelding met een blauwe achtergrond en een duidelijk zichtbare germarium (middelste panelen). Opmerking, deze stap is optioneel. De tweede stap is afgetrokken te trekken een ROI in een deel van de afbeelding mateloos signaal (rode vierkantjes in Midden panelen), de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de ROI, aftrekken dat bedrag van het hele beeld, wat resulteert in een achtergrond afbeelding (juiste panelen). De derde stap is de afbeelding berekening functie gebruiken om delen van de afbeelding in het pHluorin-kanaal door het beeld in het mCherry-kanaal. Het resultaat zal zijn van een afbeelding met de opzoektabel Greys weergegeven en de afbeelding weergegeven waarden ingesteld op beslaan het gehele dynamische bereik geboden door de bitdiepte van de afbeelding. De laatste stap is het aanpassen van de weergave-instellingen voor beeld, naar een passender bereik en selecteer een opzoektabel. (B) monster beelden tonen van het resultaat van de berekening van een afbeelding met een minimum waarde ingesteld op 0 en de weergavewaarde van de maximale ingesteld op 2,5 met behulp van vier verschillende opzoektabellen weergeven. De rechthoek naast elke afbeelding toont de kleuren binnen het dynamisch bereik voor elke opzoektabel gebruikt. Merk op dat voor HiLo, 16 kleuren en thermische, verschillende kleuren worden gebruikt voor pixels met een intensiteitswaarde van 0 of maximum (b.v., blauw en rood, respectievelijk in HiLo). Dit biedt een eenvoudige visuele referentie van de grenzen van het dynamisch bereik, waardoor de kijker om te zien dat het signaal binnen het dynamisch bereik. (C) Screen shot tonen van de opties geselecteerd wanneer u een bestand in ImageJ importeert met behulp van de Bio-formaten importeren Plug-In. schaal staven 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

lass = "jove_content" fo:keep-together.within-pagina = "1" >Figure 5
Figuur 5: instellen van de afbeelding weergegeven waarden van beelden van de pseudocolored ratiometric. De minimale en maximale beeld weergegeven waarden moeten worden ingesteld, zodat het signaal in beelden uit de bicarbonaat voorwaarde en beide nigericin voorwaarden zijn binnen het dynamisch bereik. Ter illustratie van dit punt, twee beelden uit elk van de drie voorwaarden worden weergegeven met vier verschillende beeld weergave-instellingen (0-0,5, 0-1, 0-2,5 en 0-5) met behulp van de thermische opzoektabel. Merk op dat voor alle drie experimentele omstandigheden, wanneer de beelden worden weergegeven met de maximale weergegeven waarde is ingesteld op 0,5, veel van het signaal op of in de buurt van maximaal op de schaal van de colorimetrische is, en wanneer deze is ingesteld op 5.0, veel van het signaal op of in de buurt van minimaal op de kleur is imetric schaal. In beide gevallen, kunnen niet de verschillen in de pHluorin tot mCherry verhouding in het weefsel gemakkelijk worden gewaardeerd zodat deze instellingen niet ideaal zijn. Maximale weergavewaarden 1.0 of 2.5 zijn daarentegen veel meer geschikt. Met deze instellingen, de verschillen in de verhoudingen in het weefsel gemakkelijk kunnen worden gewaardeerd, en de signalen in de beelden van alle drie proefomstandigheden worden weergegeven in kleuren die zich binnen het dynamisch bereik van de colorimetrische schaal. Schaal staven ongeveer 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor het meten van de pHi van cellen in de bloedlijn van FSC binnen wildtype weefsel. Dit protocol heeft ontwikkeld en verfijnd in de afgelopen vijf jaar, omdat we eerst begonnen te studeren pHi in Drosophila eierstokweefsel. Gedurende die tijd, het protocol heeft met succes gebruikt door meerdere onderzoekers in ons lab en op ten minste vier verschillende draaiende schijf en laser scannen microscopen. De reproduceerbaarheid van onze oorspronkelijke waarneming, dat pHi verhogingen zoals cellen in de bloedlijn van FSC onderscheiden van de cel van de stam naar de pFC aan de follikel cel staat, over deze meerdere proeven blijkt zowel dat dit biologisch verschijnsel robuust is en dat de methodologie is betrouwbaar. In onze ervaring is dit echter een uitdagende procedure te beheersen. Het vereist veel aandacht voor detail bij elke stap en snelle, zeer bedreven uitvoering van de dissectie, montage en imaging stappen. Zoals in het protocol, de dissectie en montage procedure omvat een 10 minuten incubatie maar mag niet hoger zijn dan 15 min totaal en de beeldvorming procedure moet worden voltooid in 45 min. Onder ideale omstandigheden, Drosophila ovarioles in cultuur voor tot 14 h17kan worden gehandhaafd, maar we vonden dat het weefsel begint te sterven veel sneller in de buffers van de nigericin gebruikt voor het genereren van de standaard curven. Onze richtlijnen voor zorgen dat alle gegevens zijn verzameld terwijl het weefsel is nog goed binnen het venster van de tijd die het gezonde en morfologisch normale wordt weergegeven. Dit laat geen veel tijd voor elke stap, hoewel, dus het is belangrijk om vooruit te plannen om ervoor te zorgen dat alles is klaar om verder te gaan van de ene stap naar de volgende. In feite, is het veel efficiënter als twee mensen samen op de dissectie werken, montage, en procedures, met één persoon, het uitvoeren van een stap terwijl de andere persoon imaging bereidt zich voor op de volgende stap.

Aangezien pHi zijn gevoelig voor de experimentele manipulaties dat nodig is kan om het imago de weefsel ex vivo, zoals temperatuur en buffer samenstelling, werkt deze methode het beste om relatieve veranderingen in pHi te identificeren. Gezien dat de sonde bestaat uit twee verschillende fluorescente proteïnen, hun fluorescentie-eigenschappen zoals quantumrendement, levensduur en opvouwbare eigenschappen anders kunnen worden beïnvloed in verschillende soorten cellen. Daarom, is het essentieel om monsters behandeld met de nigericin buffer voorwaarden en om ze te gebruiken voor het genereren van een nieuwe kalibratiekromme voor elk celtype in elk proces. Oog op het minimaliseren van extra bronnen voor variabiliteit, wordt alle voorwaarden consistent houden in de loop van de beeldvorming benadrukt. Monsters in nigericin buffer voorwaarden moeten worden voorbereid en beeld op dezelfde dag aangezien die in de voorwaarde van de buffer bicarbonaat en de voorbereiding en beeld overname van alle monsters zo consistent mogelijk gehouden moeten worden. Dit is belangrijk omdat de pHi metingen zijn gebaseerd op een vergelijking tussen de afbeelding sets, dus experimentele verschillen die gevolgen hebben voor de opsporing van de mCherry en pHluorin in één of meer van de afbeelding sets kan de nauwkeurigheid van de schattingen van de pHi afnemen. Factoren, zoals wijzigingen in de instellingen van de spanning van de fotomultiplicator buizen (als met behulp van een laser confocale scanning) of belichtingstijden (als u een draaiende schijf confocal) of een vuile lens die vermindert de hoeveelheid licht die het bereiken van de camera, zal duidelijk invloed op het resultaat . Maar er zijn een groot aantal andere meer subtiele factoren die kan variëren van dag tot dag en kan ook invloed hebben op de resultaten, bijvoorbeeld als de vliegen zijn goed gevoed, de leeftijd van de vliegen, en hoe lang de lasers geweest op voorafgaand aan de beeldvorming. Voorbereiding en imaging alle drie voorwaarden op dezelfde dag minimaliseert deze verschillen en zo de meest consistente resultaten zal opleveren. Met name, telkens wanneer wij overgestapt naar een nieuwe Microscoop of onderdelen van de Microscoop werden opgewaardeerd, bleek het noodzakelijk om de instellingen op de nieuwe apparatuur afbeeldingsinstellingen. Dit leidde vaak tot een verandering in de gemiddelde waarden van de individuele metingen, maar zolang nieuwe kalibratiekrommen werden gegenereerd met elke proef, de wijzigingen in de apparatuur had een minimale impact op de pHi ramingen. Bovendien, wordt de relevante vergelijking vaak tussen verschillende soorten cellen die binnen de dezelfde weefsel (bvde FSCs, PFK's en follikel cellen) en dus zijn intern gecontroleerd voor experimentele variaties.

Hoewel dit protocol is gericht op het meten van pHi van wildtype weefsel, is de methodologie compatibel met standaard Drosophila methoden voor het manipuleren van genexpressie, zoals expressie van RNAi of een transgenic met UAS/Gal4 en analyse van de mozaïek. Aangezien mCherry::pHluorin wordt aangedreven door een UAS promotor, het zal altijd mede uitgedrukt met de RNAi of transgenic en MARCM18 kunnen worden gebruikt voor het genereren van homozygoot mutant klonen met mCherry::pHluorin als klonen markering. Omwille van de hierboven beschreven moet wildtype weefsel worden geanalyseerd als een controle naast elke proef met een mutant genotype. Tot slot, de algemene beginselen die hier beschreven kunnen worden toegepast op het gebruik van mCherry::pHluorin voor het meten van pHi in andere weefsels zo goed. Inderdaad, dit protocol werd aangepast van een protocol voor het gebruik van mCherry::pHluorin voor het meten van pHi in de Drosophila oog7, en we hebben soortgelijke methodologie gebruikt om het imago van de mCherry::pHluorin in de larvale hersenen. Over het geheel genomen bieden de hulpmiddelen en de hier beschreven methoden nieuwe mogelijkheden te onderzoeken van de vele uiteenlopende functies van pHi in vivo binnen levend, intact weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Wij danken Bryne Ulmschneider voor bijdragen aan het protocol en Diane Barber voor suggesties over het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een nationaal instituut van gezondheid subsidie GM116384 T.G. Nystul en D.L. kapper.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO Bloomington Stock Center 7023
Act-Gal4 flipout stock Bloomington Stock Center 4409
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl Sigma Aldrich S5886
KCl Sigma Aldrich P-3911
glucose Mallinckrodt 4912
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310
MgSO4 Thermo Fisher Scientific M63
CaCl2 Sigma Aldrich C-5080
HCO3 Sigma Aldrich S-5761
MgCl2 Sigma Aldrich M-9272
NMDG+ Sigma Aldrich M-2004
K2HPO4 Mallinckrodt 7088 Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4 Thermo Fisher Scientific BP362 Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific C21421 0.25 mg/ml dilution
Nigericin Thermo Fisher Scientific N1495
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5) Thermo Fisher Scientific NC9473431
2 23-gauge syringe needles Sigma Aldrich Z192457
9-well glass dissecting dish Thermo Fisher Scientific 13-748B
Vacuum Grease Dow Corning 1018817
22 X 40 mM glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness Ted Pella, Inc. 26023
3-D mounting chamber custom manufactured .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name Company Catalog Number Comments
Other equipment
pH meter Thermo Fisher Scientific 13-620-183A Model: Accumet AB15
Dissection microscope Olympus Corporation 0H11436 Model: SZ2-ST
Confocal Microscope Leica Biosystems SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
  2. Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215, (3), 345-355 (2016).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110, (5), 2709-2728 (2010).
  4. Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188, (4), 547-563 (2010).
  5. Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202, (6), 849-859 (2013).
  6. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591, (7), 1691-1706 (2013).
  7. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
  8. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, (6689), 192-195 (1998).
  9. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17, (1), 15-25 (2007).
  10. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  11. Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21, (1), 159-171 (2011).
  12. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
  13. St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141, (5), 757-774 (2010).
  14. Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
  15. Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121, (11), 3797-3807 (1995).
  16. Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1, (3), 277-285 (2007).
  17. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  18. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24, (5), 251-254 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics