Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

* These authors contributed equally
Genetics
 

Summary

Nyopdagede oxideret former for 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) kan udgøre særskilte DNA ændringer med unikke funktionelle roller. Her er en semi-kvantitative arbejdsproces for visualisering af oxi-mCs' geografiske fordeling, signal intensitet profilering og colocalization beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramsawhook, A. H., Lewis, L. C., Eleftheriou, M., Abakir, A., Durczak, P., Markus, R., Rajani, S., Hannan, N. R., Coyle, B., Ruzov, A. Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images. J. Vis. Exp. (127), e56318, doi:10.3791/56318 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I flere årtier, har 5-methylcytosine (5mC) været tænkt til at være den eneste DNA ændring med en funktionel betydning i metazoans. Opdagelsen af enzymatisk iltning af 5mC til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) og 5-carboxylcytosine (5caC) samt påvisning af N6-methyladenine (6mA) i DNA af flercellede organismer leveres yderligere grader af kompleksitet til den epigenetiske forskning. Ifølge en voksende mængde af eksperimentelle bevismateriale, kan disse roman DNA ændringer spille specifikke roller i forskellige cellulære og udviklingsmæssige processer. Vigtigere, som nogle af disse varemærker (e. g. 5hmC, 5fC og 5caC) udstille væv- og udviklingsmæssige fase-specifik forekomst i hvirveldyr, repræsenterer immunochemistry et vigtigt redskab, der giver mulighed for vurdering af rumlige fordeling af DNA ændringer i forskellige biologiske sammenhænge. Her beskrives metoder til beregningsmæssige analyse af DNA ændringer visualiseret ved immunfarvning efterfulgt af Konfokal mikroskopi. Specifikt, generation af 2,5 dimension (2.5 D) signal intensitet parceller, signal intensitet profiler, kvantificering af farvning intensitet i flere celler og bestemmelse af signal colocalization koefficienter er vist. Kollektivt, kan disse teknikker være operationelt i evaluering af niveauer og lokaliseringen af disse DNA ændringer i kernen, bidrager til at belyse deres biologiske roller i metazoans.

Introduction

DNA methylering, en veldokumenteret mekanisme tilknyttet transkriptionel regulering indebærer ændring af cytosin rester i en 5'-cytosin-fosfat-guanin-3' (CpG) dinucleotid forbindelse via tilføjelsen af en methylgruppe (-CH3) til 5 - carbonatom af cytosin pyrimidin ring til at danne 5-methylcytosine (5mC)1. Hos pattedyr, er ca. 70% af CpGs methylerede som udgør kun 1% af deres genomer, som de er forarmet af denne palindromiske sekvens på grund af 5mC mutagene tilbøjelighed til spontant deaminate thymin2. Tilstedeværelsen af methylgrupper på gensekvenser promotor viser stærke korrelation med transcriptional undertrykkelse i hvirveldyr3,4,5. Tilføjelsen af disse methylgrupper er katalyseret af stærkt bevarede DNA methyltransferase (DNMT) enzymer DNMT3a, 3b og 3 L og DNMT1, som ændrer CpG cytosines i de novo og vedligeholdelse methylering sammenhænge henholdsvis6. DNMT3A/B udtryk er forhøjet i løbet af udvikling i embryonale stamceller og epiblast; men dens formindsket udtryk er observeret efter pluripotente celle afstamning engagement til somatiske skæbner under differentiering8. Samtidig deler funktionel redundans, skærm DNMT3a og 3b væv-specifikke udtryk mønstre, med 3a opdaget ensartet i mus embryoner men 3b overvejende lokaliseret til neuroectoderm og chorion ectoderm væv8.

Methylering signaturer kan være nedarvet under mitose og meiose10. Vedligeholdelse methylering indebærer DNMT1 lettes ændring af CpG cytosin restkoncentrationer i hemi-methylerede palindromes på dobbelt-strenget DNA11. DNMT1 bindes DNA på replikering gafler11 og derfor genomisk methylering niveauer peak i cellecyklus12S fase. DNMT1 methylates uændret cytosines dermed adskille nyligt syntetiserede DNA-strenge, fremme x-kromosom Inaktiveringen og opretholde transcriptional undertrykkelse profiler13. Gennem anerkendelse af hemi-methylerede DNA CpG sekvenser vedligeholder DNMT1 etablerede mønstre af methylering afgrænses af de novo methylering fx repression af lange afbrudt nukleare Element 1 (LINE1) retrotransposon initiativtagere til at hæmme dets potentielt kræftfremkaldende formering14. Selvom besidder hemi-methylerede DNA præferentielle bindingsaffinitet, kan DNMT1 methylate unmethylated CpG ø (CGI) sekvenser i DNMT3a/b - / - muterede celler, opfylde en nødsituation de novo methylering rolle15 . Således på grund af DNA replikation16semi-konservativ karakter kan vedligeholdelse methylering trofast sammenfatte methylering underskrifter fra forælder til datter celle17.

Men for gen udtryk for at være dynamisk moduleret, repressive methylering ændring skal slettes, som kan opnås af passive og aktive demetylering mekanismer18. Ti-elleve Translocase (TET) proteiner tilhører en bevarede familie af dioxygenase proteiner er i stand til at iterativ oxidation af methylgrupper på CpG restkoncentrationer19. Disse Tet proteiner, homologe til J-Base bindende proteiner (JBP) opdaget i Trypanosome bruceii, anerkende og binde modificerede DNA baserer fx 5mC og oxygenat disse restprodukter til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) og 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Tet protein lettet oxidation af 5mC resultater i trinvis kropsbygning ændring fra methyl hydroxyl, carbonyl og carboxylat konfigurationer, men 5fC og 5caC ændringer kan syntetiseres direkte fra 5mC oxidation21, 22 , 23 , 24.

En informativ angivelse af TET protein aktivitet med at forstå deres forordning undersøger distribution og overflod af oxi-methyl-cytosin mærker. Betydelig 5mC tilstedeværelse på CpG fattige initiativtagere kan påvises i modsætning til unmethylated CpG rige regioner, sidstnævnte er karakteristisk for CpG øer25. På tværs af væv, højeste væv specifik methylering er observeret i hjernen, testiklerne og blod, mens mundslimhinden udviser størst hypomethylation, der angiver en differentieret methylering mønster, som opstår i væv specifikke initiativtagere26.

Gennem udnytter følsomme anti-5mC og anti-5hmC demonstreret antistoffer i selektiv methyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) og efterfølgende høj overførselshastighed sekventering, Ficz et al. høj 5hmC belægning på initiativtagere, exons og LINE-1 retrotransposon sekvenser, der korreleret med reduceret 5mC niveauer på disse steder i mus embryonale stamceller celler27. Største 5mC berigelse konstateredes omvendt, hos gentagne satellit sekvenser, hvor 5hmC tilstedeværelse var begrænset28. Undersøgelser udført på menneskelige frontallappen hjernevæv afsløre meget betydelige 5hmC berigelse, fire gange højere end i mus embryonale stamceller28. I overensstemmelse med tidligere bemærkninger, høje overførselshastighed sekventering af frontallappen væv illustreret flertal 55-59% af 5hmC signal er lokaliseret på lav densitet CpG promotor regioner, 35-38% inden for gen organer og cirka 6% belægning på intergenic regioner. Derimod 5mC blev beriget på intergenic regioner (25-26%) og højere inden for gen organer (52-55%), men reduceret (22-24%) på promotor sekvenser29. Disse undersøgelser viser overflod af 5hmC i embryonale stamceller og somatiske væv, især hjernen, men undersøgelser på 5fC og 5caC distributioner er begrænset.

Interessant, for nylig opdaget i eukaryoter, methylering af adenin rester på holdning 6 nitrogen (N6) (6mA) display en genomisk overflod profil omvendt til at 5mC30. Observationer fra væskekromatografi kombineret tandem massespektrometri afsløre 6mA absolutte niveau at eksistere i overskud i zebra fisk og svin tidlige embryoner i forhold til sædceller med sin niveauer (0,003% af genomisk adenines) støt stigende efter befrugtning, toppede morula udviklingsstadiet (33 gange højere end sæd) og at nå frem til steady state somatiske niveauer af 0,004% af genomisk adenines31. Immunoprecipitation af 6mA beriget DNA-sekvenser er påvist fremherskende belægning (ca 80% berigelse) af dette mærke på gentagne element regioner og transcriptional start websteder32. Disse observationer kontekstualisere og validere opdagelsen af 6mA demethylase-null embryonic stamceller udstiller akkumulerede 6mA medieret linje-1 retrotransposon hæmning i forhold til transcriptionally aktive elementer i vildtype celler. Disse data tyder på en transcriptional regulerende funktion for 6mA33.

Mens konjugeret biokemiske tags koblet til efterfølgende DUKKERT assays indikere tilstedeværelsen eller fraværet af oxideret methylcytosine derivater (oxi-mCs), kan ikke de give geografiske fordeling eller kvantificerede oplysninger af disse mærker34, 35. en protokol for følsomme immunokemisk påvisning af 5hmC og 5caC var nyligt udviklede36. Denne fluorophore konjugeret sekundær antistof-baserede immunfarvning metode kombineret med udnytter scanning laser Konfokal mikroskopi besidder den unikke fordel visuelle lokalisering af ændringerne DNA i cellerne, således fremhæve enkelte farvet positivt eller negativt celler svarer med heterogene tilstedeværelsen af disse mærker. De 5hmC og 5caC absolutte signal intensiteter aktiverer som forstærkes af de konjugerede antistoffer semi-kvantitative fortolkninger vil blive foreslået om omfanget og placeringen af disse mærker i kernen fx heterochromatic og euchromatic regioner 37 , 38. her en teknik til beregningsmæssige analyse af konfokalmikroskopi billeder er beskrevet. Generation af 2.5D rumlige fordeling grunde til at vise forskellige 5hmC og 5caC signalspidser pr. pixel og deres placeringer i kerner er påvist. Histogram grunde af 5hmC og 5caC signal intensitet profiler kan illustrere tendenser i overflod af disse mærker som toppene og trug afbildet som separate ikke-overlappende kanaler. Endelig, ved at gennemføre funktionen colocalization, grad af nærhed af et signal til en anden kan bestemmes og som følge heraf er deres respektive genomisk koordinater kan identificeres.

Protocol

1. generation af Konfokal billeder

  1. i forberedelse til analyse af modificerede former for cytosin, udføre immunhistokemiske farvning som beskrevet af Abakir et al. 34.
  2. udføre billeddannelse af dias ud ved hjælp af et mikroskop og gemme filer i et format, LSM.
    Bemærk: Når man sammenligner intensitet profiler mellem prøver værdierne, der bruges til laser magt og vinding for hver kanal skal opretholdes hele billedet tager procedure at muliggøre direkte sammenligning på stadiet billede analyse.

2. Generation af 2.5D intensitet grunde

  1. Open software (f.eks. Zen sort) og vælg ' Image Processing '.
  2. Gå til menuen filer og vælg åben. Vælg det billede, der kræver behandling.
  3. Skal du klikke på ' Vis alle ' under billedet for at synliggøre alle grafiske objekter. I den nederste halvdel af skærmen er der tre faner; ' Dimensioner ', ' Display ' og ' grafik ', skal du vælge den ' grafik ' tab.
    1. Vælg den ' rektangel ' værktøj til at vælge kerner/område af interesse.
    2. Vælg ' skære region ' til at beskære billedet. Dette vil generere et nyt billede i det beskårne område i en separat tab.
    3. Gå til menuen fil og vælg Gem som. Give filen et navn og gemme den som en fil LSM eller CZI.
  4. Open software (f.eks. Zen blå) og vælge den ' Zen skrivebord '.
  5. Send det beskårne billede fra Zen sort til Zen blå ved at vælge filen og klikke på menuen filer og vælge Send til Zen 2012-blå udgave. Det beskårne billede vil derefter åbne i det relevante program.
    Bemærk: Billedfilen overføres, fordi funktionen 2.5D intensitet plot i Zen sort 2012 ikke viser flere kanal billeder samtidigt.
  6. i venstre side af billedet, vælge fanen mærket ' 2.5D ', dette giver mulighed for visualisering af billedet i 2.5 D. Klik på ' Vis alle ' til at synliggøre alle grafiske objekter.
  7. Alter visualisering indstillinger ved hjælp af fire grå barer ligger til venstre og under billedet.
    Bemærk: venstre hånd bar, toppen af skærmen = zoom. Venstre hånd bar, bunden af skærmen = Drej billede på aksen. Bunden af skærmen, venstre hånd bar = rotation af billedet. Bunden af skærmen, højre hånd bar = udvide og kontrakt skala barer.
  8. Sikrer at render mode valgt er overflade, da dette giver den bedste visualisering af de enkelte toppe.
  9. Ændre gitteret afstand ved at ændre procentdelen, jo lavere procentdelen mere defineret hver enkelt top.
  10. At gemme billedet 2.5D første skjule listen på højre side og de grafiske værktøjer under billedet ved at klikke på den grå pil under 2.5D plot (siden ' viser alle '), dette vil skjule fanerne grafisk giver mulighed for billedet for at udvide til at fylde uren n. Hvis du vil gemme handlingen 2.5D, tryk på den ' PrtSc ' tasten på tastaturet. Dette vil tage et skærmbillede på displayet. Indsæt screenshot i Microsoft Paint og beskære billedet før du gemmer.

3. Intensitet profilering

  1. Open software (f.eks. Zen sort) og vælg Image Processing.
  2. Gå til menuen filer og vælg åben. Vælg det billede, der kræver behandling.
  3. Som billedet vises på skærmen, på venstre side af billedet Vælg fanen mærket ' profil '.
  4. i nederst halvdel af skærmen sluttet (krydse af) den ' Vis alle ' fane. Dette vil give adgang til alle formateringsindstillinger.
  5. i den nederste halvdel af skærmen der er tre faner; ' dimensioner ', ' Display ' og ' ProfileƆ Vælg ' profil ' og sluttet (krydse af) den ' tabel ' boks. Vælg den ' pil ' knappen.
  6. På billedet bruge musen til at vælge et startpunkt og træk musen hen over en sammenhængende række celler. Slip museknappen for at producere en intensitet plot for celler langs linjen; Desuden tabellen vil være befolket af intensitet måledata til pixel langs linjen for hver bølgelængde.
    Bemærk: Tabellen vil give afstanden (µm) på hvilke pixel intensitet er læse for de røde, grønne og blå fluorescens.
  7. Du eksporterer dataene, skal du højreklikke på tabellen, Vælg ' Gem tabel … ' og gemme til en passende placering som en .txt-fil.
  8. At gemme den valgte intensitet profilbillede skal du vælge menuen filer og vælg ' eksportere … '. Vælg i pop-up-vinduet ' Tagged Image File (Format) ' og ' Image vinduet indhold - enkelt rude (Data) ' efterfulgt af at klikke på ' Vælg filnavnet og gemme … ' Vælg en passende placering, og klik på ' Gem '.
  9. Gentag processen for hvert enkelt intensitet profil afhængigt af antallet af profiler til at analysere og synsfelter.
  10. Import intensitet profiler data gemt (Se 3.7) og analysere i et regneark, efterfulgt af statistisk analyse.

4. Co lokalisering analyse

  1. du åbne softwaren og vælge ' billedbehandling '.
  2. Gå til menuen filer og vælg åben. Vælg det billede, der kræver behandling.
  3. Som billedet vises på skærmen, på venstre side af billedet Vælg fanen mærket ' Coloc '.
  4. i nederst halvdel af skærmen sluttet (krydse af) den ' Vis alle ' fane. Dette vil give adgang til alle formateringsindstillinger.
  5. i den nederste halvdel af skærmen er der fire faner; ' dimensioner ', ' Display ', ' grafik ' og ' ColocalizationƆ Vælg ' Colocalization ' og krydse af boksen til ' tabel ' og ' billede '.
    1. Vælg den tredje ikon langs toppen af denne fane (tæt Bezier tekst vises, når musen placeres over værktøjet) derefter bruge dette værktøj til at omringe en enkelt kerner, værdier for dette kerner vil derefter vises i tabel.
      Bemærk: For hver omringede kerner fremstilles en scatter plot for rød versus grøn fluorescens, der er visualiseret i venstre panel på skærmen. Aksen er derefter flyttet for at gate ud celler afhængigt af tærsklen. Som kerner af interesse er valgt manuelt i billeder, er justere gating tærsklerne over nul ikke påkrævet. Alle pixel intensitetsværdier overholdes inden for de nukleare perimetre betragtes som positive signal.
  6. Gentage denne proces ved at vælge den tredje ikon i fanen og omkranser efterfølgende kerner datasættet er fuldført.
  7. Du eksporterer dataene, skal du højreklikke på tabellen, Vælg Gem tabel og gemme til en passende placering.
  8. At gemme colocalization billede, Vælg menuen fil og vælg ' eksportere … ' derefter vælge; Tagged Image File (Format) og ' indholdet af billedvinduet – enkelt fly (Data) ' efterfulgt af at klikke på ' Vælg filnavnet og gemme … ', Vælg en passende placering, og klik på ' Gem '.
  9. Plot colocalization data i et regneark, efterfulgt af statistisk analyse.

Representative Results

For at bestemme den geografiske fordeling af 5hmC og 5caC i differentiere hepatisk stamfaderen immunostained dias for disse DNA ændringer blev afbildet ved hjælp af et mikroskop.

Indledende analyse af den geografiske fordeling af disse oxi-mCs blev udført gennem generation af 2.5D intensitet parceller (figur 1A, 1B). De røde og grønne toppe syntes at være veldefineret med begrænset tilstedeværelsen af orange toppe der viser kun et lille overlapning af 5caC og 5hmC signalerne. Efter aftale med disse resultater sammenfaldende profiler for 5hmC og 5caC støtteintensiteter i den tilsvarende celle ikke stærkt med hinanden (figur 1 c). Dette illustrerer, at 5caC og 5hmC udviser forskellige mønstre af nukleare distribution i hepatisk stamfaderen tyder på, at Tet-afhængige oxidation af 5mC fører til generation af forskellige oxideret derivater af dette DNA ændring i specifikke kromatin regioner.

Hvis du vil sammenligne indholdet af 5caC og 5hmC i Daoy medulloblastom og BXD-1425EPN ependymoma celler, foretog immunfarvning for disse oxi-mCs på begge prøver under identiske forsøgsbetingelser. Intensiteter af 5caC og 5hmC signaler blev derefter sammenlignet i 20 profiler genereres hen over 3-5 celler registreres for hver cellelinje (figur 2A-2D). Kvantificering af disse resultater viste, at BXD-1425EPN celler udviser betydeligt lavere niveauer af både 5hmC og 5caC immunfarvning sammenlignet med Daoy celler (figur 2D).

I betragtning af de to kanaler rød (5hmC) og grønne (5caC) som kan blive betegnet som R og G henholdsvis Pearsons korrelationskoefficient (PCC) beskriver graden af rumlige overlapning og co adskillelse af R & G forudsat at begge mærker findes i en lineær forhold til hinanden, betegnes med R statistik34. Cirklens PCC værdi, betegnes med R2 muliggør måling af grønne signal intensitet variation, som er påvirket af rødt signal intensitet34. Det er overflødigt for vores 5caC vs 5hmC Co lokalisering analyse.

For at undersøge den geografiske fordeling af 5caC og 5hmC i udifferentierede (Undiff) hiPSCs og hepatiske endoderm 24 timer (HE24) efter induktion, blev colocalization analyse af disse DNA ændringer foretaget på de samme Konfokal billeder med R-værdierne for 20 kerner analyseret for hver cellelinje (figur 3A-3 C).

Kvantificering af disse resultater viste, at graden af colocalization er væsentligt højere (P < 0,05) i HE24 i forhold til Undiff (figur 3 c). Dette kan være tilskrives reducerede omfanget af 5caC tilstedeværelse og dermed reduceret signal intensiteten i Undiff celler.

Figure 1
Figur 1: immunhistokemisk farvning af hepatisk endoderm stamfaderen på 72 timer post induktion af differentiering. (A) Co farvning af 5hmC (rød), 5caC (grøn) og DAPI nukleare counter pletter (blå). Den hvide stiplet pil 'B' betegner retning af profilering stikprøven gennem kernen, illustreret i 1 C. Skalalinjen repræsenterer 5 µm. røde kanal: få 800, laser 1%. Grøn kanal: få 750, laser 2,4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (B) 2.5 D intensitet plot af 5hmC, 5caC og DAPI signaler. Enkelte toppe repræsenterer absolutte signal intensiteter for hver pixel. Flettede visninger og individuelle kanaler er vist. (C) intensiteten profiler af 5hmC, 5caC og DAPI signaler i hepatisk stamfaderen på 72 timer post induktion af differentiering. Peak støtteintensiteter blev registreret langs dimensionerne af den hvide stiplet pil 'B' og er angivet langs x-aksen med intensitet profil med en sort stiplet pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: analyse af 5hmC og 5caC signal intensiteter i Daoy medulloblastom og BXD-1425EPN ependymoma cellelinjer. (A) immunfluorescent farvning af 5hmC (rød) og 5caC (grønne) i Daoy og BXD-1425EPN celler. Billeder blev taget med 63 x olie fordybelse mål linse, både på de samme indstillinger. Flettede visninger og individuelle kanaler er vist. Skala søjler repræsenterer 10 µm. røde kanal: få 746, laser 1%. Grøn kanal: få 750, laser 2,4%. Individuelle (B) Daoy og (C) BXD-1425EPN celler er udvidet i tilstødende tal. Skalere barer til (B) og (C) repræsenterer 5 µm. (D) betyder fluorescens intensiteten af 5hmC vs 5caC signaler i Daoy og BXD-1425EPN celler (n = 20, SD). Betydning blev vurderet ved hjælp af en F-test og to stikprøver t-Test. stjerner betegne statistisk signifikant p-værdier af ** som p < 0,01 og *** som p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Colocalization analyse af 5hmC og 5caC absolutte signaler i udifferentierede hiPSCs (Undiff) i forhold til hepatisk endoderm 24 timer efter differentierede stamceller (HE24). Konfokal mikroskopi billeder af (A) udifferentierede hiPSCs og (B) HE24 celler farvet for 5hmC (rød), 5caC (grøn) og DAPI (blå). Celler blev afbildet med 63 X olie fordybelse linse på identiske indstillinger. 20 omringede kerner illustrere de celler, der er udtaget til colocalization analyse. Skala søjler repræsenterer 20 µm. røde kanal: få 800, laser 1%. Grøn kanal: få 750, laser 2,4%. DAPI kanal: få 750, laser 2,6%. (C) Colocalization analyse af tilstedeværelsen af 5caC signal inden for rækkevidde af 5hmC nærhed i undiff og HE24 (n = 20, SD). Betydning blev vurderet ved hjælp af en F-test og to stikprøver t-Test. stjerner betegne statistisk signifikant p-værdier af * p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver den trinvis proces til at generere visuelle repræsentationer af DNA ændringer inden for kerner. Mens følsomme og slagkraftige, disse teknikker besidder en række begrænsninger.

Det er nødvendigt at understrege, at de data, der genereres fra 2.5D parceller, signal intensitet profiler og colocalization analyse er semi-kvantitative i naturen. På grund af punkt for punkt belysningen af prøven under image erhvervelse på laser scanning Konfokal mikroskop, registreres absolutte signal intensiteter af hver kanal. Men disse er ikke absolutte størrelser af 5hmC og 5caC at blive opdaget og kun repræsenterer angivelser af tilstedeværelsen, fraværet eller omfanget af disse epigenetiske mærker.

På grund af signal klarlægger repetitive karakter forvirre begrænsninger i overensstemmelse med omfanget af maskiner anvendt til at forbedre signalet uundgåeligt tilnærmelser af sande fysiske genomisk belægning af disse mærker34. Den sande genomiske lokalisering af disse mærker kan skjules af disse klodsede proteiner, som fysisk besætte områder uløselige selv ved optimal Konfokal opløsning grænserne for 200-300 nm34. Derudover kan ikke signal intensiteten af de individuelle kanaler for hver mark sammenlignes med hinanden på grund af forskelle i antistof følsomhed og fluorophore konjugation34. Men oplysninger indhentet med imaging kaster lys over den rumlige og tidsmæssige tilrettelæggelse af genomisk varemærker.

For nøjagtig kvantificering af 5hmC og 5caC signaler, er kerner fremhævet og omringede mod DAPI kontrastfarve, tydeligt afgrænser området der skal analyseres. Denne procedure giver afkald på kravet om kalibrering gating tærskler som baggrundsstøj er bort gennem den manuelle proces at vælge kerner1. En automatisering af denne proces kan opnås i den nyeste software, som giver mulighed for nukleare segmenteringen skal udføres. Mens gratis alternative software pakker såsom FIJI er tilgængelig for colocalization analyse, ulemper såsom kravet om at konvertere billeder til binære 8 bit formater, afmaske billeder og indrykke størrelse udstødelse dataene til at markere områder af interesse grænse i bruger-tilgængelighed af dette program. Derudover introducerer overvejer samlet begrænset niveauer af 5hmC og 5caC i genomet kombineret med deres fremherskende placering på euchromatic regioner og udtynding af genomisk CpG sekvenser i almindelighed, manuel omkranser af kerner brugeren-bias. Derfor, fremhævelse af kerner automatisk antager alle hændelser, som forekommer i det demarkerede region at være positiv og ignorerer eventuelle baggrundspixel, som kan være til stede. Således kan analysere billeder baseret på pixel intensitet være mere meningsfuld. Disse faktorer er vigtige, når de overvejer brugen af Mander's colocalization koefficienten, analysere graden af rumlige overlapning mellem to signaler, uanset deres signal intensiteter som modsætter sig at Pearsons korrelationskoefficient, der forudsætter en lineær sammenhæng mellem signaler.

Samlet set bære de teknikker, der er skitseret her tema af visuel repræsentation af biologiske data i en intuitiv format. Mens semi-kvantitative billedanalyse ikke kan erstatter kraftfulde teknikker såsom massespektrometri følsomhed eller enkelt base opløsning genom bred sekventering, det giver supplerende data så slutninger og hypoteser til at være udtænkt af analyse af billeder med præcision.

Disclosures

Ingen potentielle interessekonflikter blev offentliggjort.

Acknowledgments

Arbejdet var støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council [BB/N005759/1 til A.R.]. NRFH blev finansieret af The Rosetrees Trust og The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Zeiss Elyra PS.1 mikroskop, forarbejdning computere og software blev finansieret af BBSRC BB/L013827/1 (tværfaglig Super opløsning mikroskopi facilitet ved Nottingham University grant)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head Zeiss NA
Zeiss Zen Black 2012 Zeiss NA
Zen Blue 2012 Zeiss NA
Microsoft Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern. J Mol Biol. 118, (1), 49-60 (1978).
  2. Youssoufian, H., et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature. 324, (6095), 380-382 (1985).
  3. Holliday, R., Pugh, J. E. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).
  4. Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells. European J Biochem. 81, (1), 53-61 (1977).
  5. Bird, A. P., Southern, E. M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol. 118, (1), 27-47 (1978).
  6. Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J. 21, (15), 4183-4195 (2002).
  7. Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. Dissecting de novo methylation. Nature genetics. 23, (4), 380-382 (1999).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Eckhardt, F., et al. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet. 38, (12), 1378-1385 (2006).
  10. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321, (1), 238-250 (2008).
  11. Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 71, (5), 865-873 (1992).
  12. Jones, P. A., Taylor, S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell. 20, (1), 85-93 (1980).
  13. DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. Jähner, D., Jaenisch, R. Springer. 189-219 (1984).
  14. Chalitchagorn, K., et al. Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene. 23, (54), 8841-8846 (2004).
  15. Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA. Eur J Biochem. 269, (20), 4981-4984 (2002).
  16. Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase. Nature. 295, (5850), 620-622 (1982).
  17. Dean, W., Santos, F., Reik, W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer. Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14, (1), 93-100 (2003).
  18. Wu, S. C., Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (9), 607-620 (2010).
  19. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  20. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, (5929), 930-935 (2009).
  21. Bachman, M., et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. Nat Chem Biol. 11, (8), 555-557 (2015).
  22. Bachman, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification. Nat Chem. 6, (12), 1049-1055 (2014).
  23. Lurlaro, M., et al. In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine. Genome Biol. 17, (1), 141 (2016).
  24. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. J Am Chem Soc. 138, (30), 9345-9348 (2016).
  25. He, Y. -F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, (6047), 1303-1307 (2011).
  26. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 93, (18), 9821-9826 (1996).
  27. Nagae, G., et al. Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation. Hum Mol Genet. 20, (14), 2710-2721 (2011).
  28. Ficz, G., et al. Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature. 473, (7347), 398-402 (2011).
  29. Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain. Nucleic Acids Res. 39, (12), 5015-5024 (2011).
  30. Liu, J., et al. Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig. Nat Commun. 7, (2016).
  31. Wu, T. P., et al. DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells. Nature. 532, (7599), 329-333 (2016).
  32. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, (5929), 929-930 (2009).
  33. Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 5, (12), e15367 (2010).
  34. Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. Springer. 125-137 (2016).
  35. Alioui, A., et al. 5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary. Nucleus. 3, (6), 565-569 (2012).
  36. Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. Diversity of two forms of DNA methylation in the brain. Front Genet. 5, 46 (2014).
  37. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  38. Lachmanovich, E., et al. Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies. J Microsc. 212, (Pt 2), 122-131 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics