ميكرورنا استناداً إلى خزعة سائلة: تجربة ميرنا البلازما التوقيع المصنف (MSC) "فحص سرطان الرئة"

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

هنا، نقدم البروتوكول التفصيلية المعتمدة في بيوميلد فحص المحاكمة إجراء اختبار المصنف التوقيع microRNA المتداولة للكشف المبكر عن سرطان في الرئة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تطوير اختبار كسبها، مثل خزعة سائلة، للكشف المبكر عن سرطان الرئة في مرحلته السريرية أمر حاسم لتحسين نتائج هذا المرض القاتل. ميكرورناس (ميرناس) نسيج معين، صغيرة، غير الترميز الكشف تنظيم التعبير الجيني، والتي قد تكون بمثابة رسل خارج الخلية الإشارات البيولوجية المستمدة من عبر الحديث بين الورم والمكرويه المحيطة به. وهكذا أنها يمكن أن تمثل مرشحا مثاليا للكشف المبكر عن الإصابة بسرطان الرئة. ويقترح في هذا العمل، سير عمل منهجي للمصادقة اختبار ميرنا تعميم استخدام بطاقات مخصصة موائع جزيئية الصنع وكمية Real-Time PCR في عينات البلازما المتطوعين المسجلين في سرطان الرئة فحص المحاكمة المرتقبة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الإفراج عن ميرناس المتعلقة بانحلال الدم وأعم المسائل التقنية قد تؤثر على التحليل، كما تعرض الخطوات مراقبة الجودة التي شملت في إجراءات التشغيل الموحدة. البروتوكول هو استنساخه ويعطي نتائج كمية يمكن الاعتماد عليها؛ ومع ذلك، عند استخدام سلسلة السريرية كبيرة، ميزات كل قبل التحليلية والتحليلية ينبغي حذر تقييم.

Introduction

سرطان الرئة الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في جميع أنحاء العالم، تستأثر بحوالي 25 في المائة من جميع التشخيصات سرطان1. على الرغم من انخفاض مطرد في معدل وفيات سرطان الرئة على مدى العقدين الماضيين، أساسا بسبب تعاطي التبغ مخفضة، يبقى سرطان الرئة السبب الرئيسي للوفاة السرطان في الرجال والنساء على حد سواء. في عام 2017، ومن المتوقع أن تستأثر بحوالي 25% و 20% من وفيات سرطان الكلي في الولايات المتحدة وأوروبا، على التوالي1،2.

منذ الأعراض لا تحدث عادة في بداية المرض، ويتم تشخيص معظم سرطانات الرئة في المراحل المتأخرة. وهذا يؤدي إلى إمكانية محدودة للتدخل العلاجي، وضعف فعالية العلاجات3. ولذلك، تهدف العديد من الجهود العلمية في تحديد إجراء اختبار فعال للكشف المبكر عن سرطان في الرئة.

مجموعة متنوعة من فحص المحاكمات يبين أن تصوير الصدر بالأشعة لا قيمة له في الكشف عن سرطان الرئة، بينما تحسب جرعة منخفضة التصوير المقطعي (لدكت) أداة أفضل مقارنة بالأشعة السينية للكشف عن سرطان الرئة المرحلة المبكرة4. وعلاوة على ذلك، قد ثبت ثاتسكرينينج باستخدام لدكت تخفيض وفيات سرطان الرئة يصل إلى 20% بين المدخنات الثقيلة الحالية والسابقة5. تدعم هذه البيانات الاستخدام للكشف عن سرطان الرئة في مجموعة سكانية عالية مخاطر كما حددتها عدة جمعيات مهنية4،6في المبادئ التوجيهية.

تجدر الإشارة، من بين الشواغل الرئيسية المتعلقة بالفحص لدكت، هناك ارتفاع معدل نتائج إيجابية كاذبة والتشخيص المفرط. أن يجري ذلك، المجتمع العلمي تبحث عن استراتيجية للتغلب على هذه المشكلات وزيادة الطابع الخاص لاختبار فحص لدكت. تطوير المؤشرات الحيوية التكميلية غير الغازية يمكن أن تكون مفيدة هنا. وحتى الآن، هناك قائمة واسعة من المؤشرات الحيوية المرشح قيد التحقيق، مثل ميرناس، خالية من خلايا الحمض النووي، مثلايشن الجينات، والبروتينات الصغيرة وغيرها7.

المؤشرات الحيوية على أساس الدم، بما في ذلك المؤشرات الحيوية الاستجابة المناعية، وتعميم ميرناس، هي تلك التي تصل إلى مرحلة التحقق من الصحة الأكثر تقدما8. وتستند المؤشرات الحيوية الاستجابة المناعية العلم بأن الاستجابات المناعية ضد المستضدات الورم داخل الخلايا والسطحية على حد سواء، تراكمت في مرضى سرطان الرئة9. على سبيل المثال، أيونا et al. تقييم دور C4d، نتاج تدهور مسار تكملة الكلاسيكية، في التشخيص والتشخيص ل سرطان الرئة10. خلاف ذلك، اختبار مصل الأجسام المضادة متاحة تجارياً دراسة تم التحقق من صحتها في مرضى سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة وأظهر 36% حساسية و 91 في المائة من خصوصية11المستضدات السبعة المتصلة بالورم. المؤشرات الحيوية الاستجابة المناعية مثيرة للاهتمام، ولكن هناك حاجة إلى إجراء مزيد من الدراسات التحقق من صحة لعلى إمكانية تطبيق سريرية.

ميرناس هي الذاتية الصغيرة غير الترميز الكشف مع إليه المصانة وأهمية وظيفية كبيرة في جميع أنحاء الممالك الحيوانية والنباتية. دور ميرناس تنظيم ترجمة البروتين: أنهم قمع التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات المستهدفة12. أنه تم توثيقه جيدا أن تعبير أوفميرناس التعديلات تساهم في الآلية المرضية لمعظم البشرية السرطان12،،من1314. وبالإضافة إلى ذلك، كل من الورم والخلايا اللحمية الإفراج عن ميرناس، استقرت بإدماجها في ميكروفيسيكليس أو عن طريق الرابطة للحمض النووي الريبي ملزم البروتينات، إلى سوائل الجسم مثل البلازما والمصل15،16، البول17 ، واللعاب18. تعميم ميرناس قد تعكس استجابة المضيف والتفاعل الدينامي بين الورم وبه المكروية19. معا هذه الملاحظات جعلت ميرناس المتداولة فئة واعدة من المؤشرات الحيوية للكشف عن السرطان البشري.

تعميم ميرناس يمكن الكشف عنها باستخدام أساليب مختلفة: ميكرواري منصات20، الكمية عكس النسخ بكر (RT-qPCR)21، والتسلسل (خ ع) الجيل القادم14،22. وقد وضعت دراسات مختلفة التعبير الشخصية على أساس التقنيات المذكورة أعلاه في السنوات الأخيرة. ميكرواري تكنولوجيا الفائق، قادرة على تحليل تصل إلى آلاف ميرناس في مقايسة واحدة واحدة. ومع ذلك، أنها أقل من النطاق الديناميكي وخصوصية بالمقارنة مع الرايت قبكر أو خ ع. وباﻹضافة إلى ذلك، ميكرواري أسلوب غير كمي، ولذلك مطلوب مواصلة التحقق التجريبي. الأساليب المستندة إلى تسلسل يمكن أن تسمح بتحديد ميرناس غير معروف وهي مناسبة لا سيما في مرحلة اكتشاف. من ناحية أخرى، خ ع الأساليب لا تزال مكلفة وتتطلب معدات خاصة وخبراء بيوينفورماتيسيانس، مما يحد من استخدامها في أفواج كبيرة من التحقق من الصحة وإعدادات السريرية23. في هذه اللحظة، هو RT qPCR منهاج آخر اعتمد تعميم الكشف ميرنا في سياق التشخيص العملي24. هناك مختلفة RT qPCR التكنولوجيات المتاحة للتحليل ميرناس، ولكن RT الاسترجاع الجذعية-تليها بكر تكمان25الأكثر استخداماً. هذا الأسلوب حساسة للغاية ودقيقة (التمييز النوكليوتيدات واحدة)، ومجموعة ديناميكية عالية؛ ومع ذلك، فإنه يسمح الكشف عن ميرناس المعروفة فقط.

دراسة مراقبة الجودة ميكرورنا (دراسة ميرقك) قبل ميستداغ et al. على نطاق واسع بحث خصائص بعض المنابر المتاحة تجارياً ميرناس التنميط القائم على ثلاث تكنولوجيات السالف الذكر26. من خلال تحليل ميرناس 196 في عينات مصل الدم والأنسجة، وكان تقييم أداء منصات مختلفة فيما يتعلق بإمكانية تكرار نتائج وحساسية ودقة، وخصوصية والتوافق للتعبير التفاضلية. أظهرت النتائج أن منصات استناداً إلى خ ع والتكنولوجيات ميكرواري كان أعلى من إمكانية تكرار نتائج وخصوصية، لكن منصات RT-قبكر كانت أكثر دقة وحساسية، وكان معدل كشف أعلى، خاصة بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي الإدخال المنخفضة، مثل الهيئة السوائل. وهكذا يبدو RT qPCR الأسلوب الأكثر ملاءمة لتطبيق محتملة في التشخيص السريري الروتيني.

في عام 2011، Sozzi et al. حلل الشخصية ميرنا البلازما العينات التي تم جمعها من المتطوعين المسجلين في لدكت سكرينينجتريال (INT IEO محاكمة) أول27 وأربعة تواقيع ميرنا تتألف من نسب متبادلة بين 24 المتداولة ميرناس وقد تولدت. هذه التوقيعات وكانت قادرة على تميز المرض تحرير الأفراد من المرضى الذين يعانون من أي أو قاتلة سرطان الرئة في الوقت أو يصل إلى 2 السنوات قبل الكشف عن المرض لدكت28. في ورقة أخرى، نفس المجموعة المذكورة للأول مرة المصنف التوقيع ميرنا (MSC)، التي تم الحصول عليها عن طريق الجمع بين تواقيع ميرنا الأربعة من أجل التجهيزة المرضى في ثلاثة مستويات من المخاطر: عالية ومتوسطة ومنخفضة. تم التحقق من صحة فائدتها السريرية في مجموعة استعادية كبيرة من أكثر من 1000 شخص المسجلين في المحاكمة فحص معتدل، ودراسة معشاة ذات شواهد مقارنة الأسلحة لدكت سنوياً أو كل سنتين مع ذراع مراقبة29. في الواقع، المزيج من لجنة السلامة البحرية ولدكت إلى خفض معدل إيجابية كاذبة لدكت بحوالي 5 مرات وكانت ثلاث مجموعات المخاطر ماجستيرالمرتبطة بالبقاء على قيد الحياة عموما.

وفي وقت لاحق في عام 2013 في "مؤسسة إيرككس Istituto Nazionale dei توموري" (ميلان، أنها) المحتملين فحص تجريبي (بيوميلد) تنفيذ لدكت مع البلازما وبدأ استناداً إلى لجنة السلامة البحرية اختبار. المتطوعين المسجلين في محاكمة بيوميلد الخضوع لسحب الدم ولدكت التي يتم معالجتها فورا لفصل البلازما لميرنا التنميط باستخدام بطاقات موائع جزيئية الصنع مخصصة. يعرف الجمع بين نتائج لدكت ولجنة السلامة البحرية المحددة الفرز الخوارزمية24.

في هذا العمل، ويرد وصف كامل البروتوكول المنهجية المستخدمة في المحاكمة بيوميلد، بدءاً من جمع عينة الدم، إلى عزل البلازما، استخراج الحمض النووي الريبي، والتعبير ميرناس 24 تحديد سمات مخصصة باستخدام بطاقات موائع جزيئية RT-قبكر. نظراً لارتفاع الاتساق وإمكانية تكرار نتائج، يمكن أيضا استخدام هذه الإجراءات لتطوير القائم على ميرنا خزعات السائلة في أمراض أخرى.

Protocol

البروتوكول أقرته لجنة أخلاقيات البحوث مؤسستنا.

1-"جمع عينات البلازما"

عينة
  1. جمع 10 مل من الدم كله في أنابيب فاكوتينير مع مخزن في درجة حرارة الغرفة والمغلفة بالرذاذ يدتا 2 ك.
    ملاحظة: للتقليل إلى أدنى حد انحلال الدم، بفصل البلازما ضمن ح 2. لا تقم بتخزين الدم كله في درجة حرارة منخفضة (أي، 4 درجات مئوية) تفادي صدمة حرارية وخلية تفسخ أن تؤدي إلى إطلاق سراح ميرنا غير محدد-
  2. ضمن 1 ح، فصل البلازما بأول خطوة الطرد المركزي في 1,258 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10
  3. نقل البلازما طافية في أنبوب 15 مل، بعناية تجنب الاتصال مع عصابة اللمفاوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي البلازما مرة ثانية في 1,258 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10
  5. الكوة 1 مل من البلازما إلى 1.5 مل كريوفيالس، تجنب جمع الكسر البلازما عند قاعدة الأنبوب.
  6. تخزين كافة مختبرين في − 80 درجة مئوية، ما عدا واحدة للتقييم لانحلال الدم. يجب إجراء التحليل الجزيئي في غضون أسابيع 5.

2. تقييم لانحلال الدم "القياس سبيكتروفوتوميتريك"

  1. مباشرة بعد خطوة فصل البلازما، في ومبومو لكانت، تجعل من 01:10 إضعاف العينة البلازما في برنامج تلفزيوني X 1 (مثلاً 100 ميليلتر من البلازما في ميليلتر 900 1 X برنامج تلفزيوني)، ومزيج لمجانسة إجرائه.
    ملاحظة: عينة البلازما ينبغي أن لا تكون مجمدة قبل القياسات سبيكتروفوتوميتريك، كما التجميد-ذوبان الجليد للعينة (وخاصة في عينات ليبيميك)، يمكن أن تشكل فلوككولاتيس التي تتداخل مع التحليل سبيكتروفوتوميتريك-
  2. قراءة امتصاص في 375 نانومتر، 414 نانومتر، 541 نانومتر، و 576 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية، مع تصحيح أساس استقر في 750 نانومتر وطول مسار من 10 مم. القيام بقياس فارغة باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x.
  3. حساب النسبة بين امتصاص في 414 نيوتن متر و 375 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ وإذا كان أعلى من 1.4، النظر في نموذج هيموليزيد وكرر سحب الدم (QC1 في الجدول 1).

3. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع البلازما

  1. تحضير حلاً 1-ثيوجليسيرول/تجانس (OMG) مع 20 ميليلتر من 1-ثيوجليسيرول الواحد مل من "محلول التجانس". ولما لزج 1-ثيوجليسيرول، بعناية "الماصة؛" للقياس الدقيق. البرد حل OMG على الجليد أو في 2-10 درجة مئوية قبل استخدام ذلك
    ملاحظة: الحل العامل مستقر في 2-10 درجة مئوية لمدة شهر-
  2. تعليق
  3. الدناز المجففة بالتبريد الأول بإضافة ميليلتر 275 من خالية نوكلاس الماء في القنينة وتخلط بلطف (لا دوامة). كمساعدات البصرية، إضافة 5 ميليلتر الأزرق صبغ إلى الدناز المعاد تشكيلها أنا والاستغناء عن الحل إلى مختبرين تستخدم مرة واحدة في أنابيب نوكلاس مجاناً. تخزين المعاد تشكيلها الدناز أنا عند-30 درجة مئوية إلى-10 درجة مئوية.
  4. بدءاً من 200 ميليلتر من البلازما، إضافة 200 ميليلتر من حل OMG المثلجة.
  5. دوامة 15-30 ثانية لضمان تجانس كامل. في حالة حدوث رغوة، اسمحوا العينة تسوية على مدت
  6. إضافة 200 ميليلتر من "تحلل المخزن المؤقت" و 25 ميليلتر من "البروتيناز ك" بعينه المتجانس ودوامه ل 20 س.
  7. إينكوباتي عينات لمدة 15 دقيقة في ثيرموميكسير يسخن في 37 درجة مئوية.
  8. تحميل خرطوشة لكل عينة على علبة سطح السفينة للصك ووضع قطع قطع في المكان الصحيح.
  9. نقل إلى الموضع المناسب في خرطوشة الصك.
  10. إضافة 5 ميليلتر من الدناز أنا الحل إلى الموضع المناسب في الخرطوشة.
  11. إضافة 60 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس لقاعدة لكل أنبوب شطف.
  12. حدد " مركز الخدمات الإقليمي ميرنا الأنسجة " الأسلوب وتبدأ تنقية الآلي تشغيل. ويمكن تخزين عينات الحمض النووي الريبي المجموع في − 80 درجة مئوية.

4. RT المستندة إلى تق

  1. استخدام "تجمع التمهيدي RT بوليميراز" مع ميرناس الفائدة لتحويل الجيش الملكي النيبالي لكدنا مع "بوليميراز MicroRNA عكس النسخ كيت".
  2. ميليلتر إعداد 12 RT رد فعل المزيج على الجليد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وفقا لتعليمات كيت، استخدام ميليلتر 6 تجمع التمهيدي RT بوليميراز مخصص-
  3. إضافة 3 ميليلتر من مجموع الجيش الملكي النيبالي لوحدة تخزين نهائي من 15 ميليلتر واحتضان في الجليد للحد الأدنى 5
  4. تحميل
  5. رد فعل RT على حرارية-cycler تكوين كما يلي: 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 4 ° C.
    ملاحظة: يمكن كدنا مخزن في-15 إلى-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.

5. قبل التضخيم

  1. ميليلتر ميكس 2.5 لكل منتج RT مع ميليلتر 12.5 2 x وتجمع "مخصص بوليميراز" ميليلتر 3.75 6.25 ميليلتر خالية نوكلاس المياه، لإجمالي حجم 25 ميليلتر ميكس ماجستير بوليميراز.
  2. إجراء رد فعل التضخيم قبل استخدام حرارية cycler وفقا للتشكيل الجانبي الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 55 درجة مئوية لمدة دقيقة 2, 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 12 دورة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 ، ثم اضغط مع الاستمرار على 99.9 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والساعة 4 ° C.
  3. تمييع المنتج عن طريق إضافة 175 ميليلتر من 0.1 X TE، pH 8.0.
    ملاحظة: يمكن المنتج المخفف مخزن في-15 إلى-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.

6. RT-قبكر رد فعل على "العرف بوليميراز الصفيف MicroRNA بطاقات"

  1. استخدام ميكروفلويديككوستوم 384-جيدا بوليميراز الصفيف MicroRNA بطاقة لقياس مستويات البلازما ميرناس محددة 24 (رصدت في التكرارات) في 8 عينات في وقت واحد. معرف ميرباسي (v21) ميرناس 24: ف له-مير-101-3، ف قد-مير-106a-5 س، وقد-مير-126-3، ف قد مير-133a-3 ف، قد-مير-140-3، ف له-مير-140-5، ف له-مير-142-3، ف قد-مير-145-5، قد مير-148b-3 ف، ف قد-مير-15 باء-5 س، وقد-مير-16-5، ف قد-مير-17-5، ف قد-مير-197-3 ف قد مير-19b-3 ف، وقد-مير-21-5، ف قد-مير-221-3، ف قد-مير-28-3، قد-مير-30b-5 ف، قد-مير-ج 30-5 ف، 320a مير قد، 451a مير قد، قد-مير-486-5 ف، قد-مير-660-5 ف وقد-مير-92a-3 ص
  2. ميليلتر 1.13 مزيج من العينة PreAmp المخفف مع 56.25 ميليلتر من 2 × بوليميراز مزيج الرئيسي العالمي وميليلتر 55.69 المياه خالية من نوكلاس في أنبوب 0.5 مل.
  3. تحميل بكر رد فعل مزيج يصل إلى 8 على "بطاقات MicroRNA صفيف بوليميراز مخصص"-
  4. أجهزة الطرد المركزي في 311 س ز 2 دقيقة
  5. ختم بطاقة مخصصة مع السدادة بطاقة الصفيف.
  6. تشغيل الرد باستخدام "نظام PCR الوقت الحقيقي" تعديل المعلمات الدراجات كما يتبع في الوقت الحقيقي: 94.5 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، دورات 40 من 97 درجة مئوية لمدة 30 ق، و 59.7 درجة مئوية مقابل 60 س.

7. استقراء البيانات وتوليد نسب

  1. استخدام البرنامج للحصول على قيم Ct الخام، إعداد أساس تلقائي لإزالة الإشارات الخلفية وعتبة ثابتة من 0.15 لجميع الاختبارات والعينات. إزالة البقع مع منحنيات التضخيم الفقراء و/أو إشارات إشارة سلبية الفقراء.
  2. قيم Ct الخام في الصادرات ".xls " تنسيق واستخدام قيمة "الأشعة المقطعية يعني" نسختين لمزيد من التحليل.
  3. ربط ميرناس ' مستويات التعبير للقياسات التاريخية على عينات الدراسة السريرية (الجدول 2). إذا كان ينتج 50 في المائة على الأقل من العينات في كل بطاقة موائع جزيئية الصنع مخصصة بيرسون ' ارتباط s < 97.5، كرر البطاقة (QC2 في الجدول 1).
  4. حساب − ΔCts بين جميع ميرناس، أي ما يعادل قيم نسب ميرنا log2.

8. تقييم لانحلال الدم بميرنا المتصلة توقيع

  1. إنشاء التوقيع ميرنا المتعلقة بانحلال الدم باستخدام نسب ميرنا التالية مع انقطاع كل منهما (قيم log2) لعينات البلازما تخزين قصيرة (1-5 أسابيع في − 80 درجة مئوية): مير-126/451 < − 0.07، 15b/451 < − 3.67، 221/451 < − 3.18، 30b/451 < − 1-1، 126/486-5 ف < − 0.33، 15b/486-5 ف < − 3.86، ف 221/486-5 < − 3.17، 30b/486-5 ف < − 1.42، 126/92a < 1.8، 15 باء/92a < − 1.8، 221/92a < − 1.04، 30b/92a < 0.87، 126/16 < − 2.85، 15b/16 < − 6.33، 221/16 < − 5.9، 30b/16 < − 3.68.
  2. Classify كعينات هيموليزيد حيث تتجاوز 50 في المائة على الأقل من نسب (8 من أصل 16) إنتاج كل منها (QC3 في الجدول 1).

9. تعريف مستوى المخاطرة: عالية ومتوسطة ومنخفضة

  1. تعريف أربعة تواقيع ميرنا نسب تأليف لجنة السلامة البحرية كما ورد في الشكل 3: خطر الإصابة بالمرض (RD)، خطر الإصابة بالمرض العدوانية (RAD)، وجود المرض (PD)، ووجود المرض العدوانية (PAD).
  2. لكل توقيع، تعريف نسب تتجاوز قيمة إنتاج كل منها لتخزين قصيرة عينات البلازما (1-5 أسابيع في − 80 درجة مئوية). هو عدد يتجاوز النسب يلزم النظر إيجابيا في 9 من أصل 27 RD وشعبة المشتريات، و 14 من أصل 28 راد ولوحة ( الشكل 3 أ)-
  3. سمة لكل عينة مستوى المخاطر ماجستير كل منها على النحو التالي: منخفضة المخاطر إذا RD الراتب ∩ PD الراتب ∩ راد الراتب ∩ لوح الراتب؛ والمخاطر المتوسطة إذا كان RD pos ∪ PD pos ∩ راد الراتب ∩ لوح الراتب؛ أو عالية المخاطر إذا راد pos ∪ ( الشكل 3 ب) لوح pos.

Representative Results

محاكمة بيوميلد دراسة مستقبلية للكشف المبكر عن سرطان الرئة غرض اختبار كفاءة لاتباع نهج لدكت-ماجستير مجتمعة كاختبارات الفحص الخط الأول في مجموعة كبيرة من الأفراد المدخن الثقيل. فئة المخاطر يعزى إلى كل متطوع على أساس الاختبار ميرنا، الذي يقيم النسب بين 24 البلازما ميرناس المتداولة. كما تم الإبلاغ عنها إلى حد كبير30،،من3132، انحلال الدم مسألة حاسمة لتحليل تعميم ميرنا، حيث يمكن الحصول على نتائج خاطئة بسبب إصدار غير محدد من ميرناس خلايا الدم. في سير العمل المنهجية المقترحة، مراقبة الجودة تحليلية قبل الخطوة (QC1 في الجدول 1) لتحديد هيموليزيد وغير أناليزابلي على ذلك، وصفت بعينات البلازما. الشكل 1 التقارير تحليلاً سبيكتروفوتوميتريك هيموليزيد (الشكل 1أ) وغير هيموليزيد في عينات البلازما (الشكل 1ب) مع كل منها A414/A375 القيم. وفي سياق سريرية كانت نتيجة لاختبار الجزيئية أمر حاسم لإدارة المتطوعين، يسمح هذا QC1 مكرر أخذ عينات من الدم، وفي معظم الحالات، استعادة العينة.

بعد المعالجة الجزيئية، ينبغي تقييم أداء RT-قبكر بدقة التعرف على أي مشاكل فنية. الشكل 2 أ يظهر الرايت قبكر ذات أداء منخفض بسبب إشارة إشارة سلبية فقراء. ويوصي في هذه الحالة إعادة شحن المنتج قبل التضخيم لبطاقة موائع جزيئية جديدة. عند RT-قبكر أداء جيدا، كما هو الحال في الشكل 2ب، عائدات البطاقة إلى وظيفة مراقبة الجودة التحليلية الخطوة الأولى لضمان أن قيم التعبير ميرنا قابلة للمقارنة مع القياس التاريخية (QC2 في الجدول 1). إذا فشل الخطوة QC2، قد تكون حدثت مشكلة فنية أثناء النسخ العكسي أو في ردود الفعل قبل التضخيم، وأنها ملائمة لتكرار تجهيز الجزيئية الكامل بدءاً من النسخ العكسي.

آخر خطوة مراقبة الجودة (QC3 في الجدول 1) يقيم في انحلال الدم أيضا على المستوى الجزيئي. مقارنة مستويات التعبير من 4 ميرناس الخاصة بكرات الدم الحمراء (16 مير مير-451، مير-486-5 ف و 92a مير) لأولئك 4 ميرناس ذات الصلة غير انحلال الدم (مير-126 ومير-15b، مير-221 ومير-30b)، توليد التوقيع ميرنا المتعلقة بانحلال الدم يتكون من 16 (4 × 4) نسب ميرنا. عينات إيجابية تصنف هيموليزيد، بينما تستمر عينات سلبية لتصنيف مستوى المخاطر ماجستير النهائي كما هو موضح في البروتوكول الباب 9 و الرقم 3.

Figure 1
رقم 1: تحليل عينات البلازما الطازجة سبيكتروفوتوميتريك- ملامح سبيكتروفوتوميتريك (A) 2 هيموليزيد وعينات البلازما غير هيموليزيد 2 (ب)، وقياس نسبة امتصاص بين أطوال موجية A414 و A375. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : بطاقات الأداء RT-qPCR في موائع جزيئية التحليل. التضخيم ومولتيكومبونينت المؤامرات الفقراء مقارنة (A) وبطاقات موائع جزيئية ذات نوعية جيدة (ب). جميع ميرناس 24 وميرنا اكسيمبليفيينج واحد من ترد في كل فريق. قطع متعددة المكونات توضيح إشارات الإشارة السلبية التي تحدث في هذه التفاعلات RT-قبكر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الخوارزمية لجنة السلامة البحرية لخطر التقسيم الطبقي. الممثل نتائج النظر في عينات البلازما 6 من المتطوعين المسجلين في بيوميلد فحص المحاكمة. (A) تواقيع ميرنا-نسب من خطر الإصابة بالمرض (RD)، خطر الإصابة بالمرض العدوانية (RAD)، وجود المرض (PD)، وجود المرض العدوانية (PAD)، ووقف إنتاج القيم المناظرة (log2) لعينات البلازما المخزنة في-80 درجة مئوية للساعة أقل من أسبوع، وتصل إلى 5 أسابيع. (ب) مجموعة التواقيع الأربعة التجهيزة عينات أناليزابل في ارتفاع (H)، المخاطر المتوسطة (ط)، ومنخفضة (L) ماجستير المستوى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

المخاطر والتحديات التي تواجه سير العمل المنهجي
بيوميلد هو أول دراسة مستقبلية تحليل ميرناس المتداولة كأداة تشخيصية، تولدت العتبات وانقطاع المستخدمة لتحليل البيانات من سلسلة أثر رجعي. وللتغلب على مسألة فترة تخزين مختلفة من عينات البلازما، يمكن أن تكون المعلمات المكرر ربما الحصول على زيادة أداء لجنة السلامة البحرية. ومع ذلك، قبل البدء في تحليل ميرناس، عدة جوانب من عملية عموما بحاجة إلى تقييم بعناية، مثل معايير الاشتمال، وجمع العينات وتجهيزها، واعتمدت الخوارزمية المعلوماتية الحيوية لتحليل البيانات. المقاطع التالية ستركز على معظم النقاط الحرجة لسير العمل المبينة في هذه الورقة، معالجة القضايا الرئيسية المتعلقة بكل خطوة واحدة وثم اقتراح استراتيجيات للتغلب عليها.

دراسة السكان
معايير الالتحاق بيوميلد فحص المحاكمة: 50-75 سنة القديمة والثقيلة المدخنين الحاليين أو السابقين (أقل من 10 سنوات) مع حزمة مالا يقل عن 30 سنة ولا يوجد تاريخ مسبق من السرطان خلال 5 سنوات. في هذه الفئة من السكان، انتشار سرطان الرئة المقدرة والإصابة في السنة بحوالي 1 في المائة و 0.7 في المائة، على التوالي. من أجل تطبيق الاختبار MSC كما هو موضح في البروتوكول المقترح، ينبغي الحفاظ على السكان تحليل خصائص مماثلة. على وجه الخصوص، تنطوي الخطوة QC2 الموصوفة أعلاه مقارنة مع البيانات التاريخية معين التي تم الحصول عليها من عدد سكان مماثلة. بينما يمكن أن يكون ارتباط أدناه 97.5 الإرشادية لمشاكل تقنية، من ناحية أخرى، معظم الأفراد مع تغير مستويات ميرنا المتداولة التي تعكس خطر الإصابة بسرطان الرئة في الواقع تلك العتبة. وبعبارة أخرى، إذا تم تطبيق الخطوة QC2 مع المعلمات وذكرت هنا أن عدد سكان في ارتفاع خطر الإصابة بسرطان الرئة النامية، أنه يجوز استبعاد العينات المقبولة. معلمات مرجع جديد وسليم ينبغي ثم تعريف التي محددة لكل السكان تحليلها وفقا للنتائج المتوقعة.

جمع الدم وانحلال الدم
جمع العينات البيولوجية خطوة حاسمة قبل التحليل، نظراً لأنه قد تضر بنوعية العينة وخصائصها، وهكذا تعديل النتائج النهائية للتحاليل. وفيما يتعلق بعينات الدم، من المهم جمع دماء جديدة وتجهيز العينة، في أسرع وقت ممكن. عينات ينبغي إلا المخزنة في 4 درجات مئوية أو المجمدة بعد سحب الدم، منذ تجميد والغاء فقرات قد يحفز تحلل الخلية (انحلال الدم)، وتدهور الجيش الملكي النيبالي. لتقليل عملية انحلال الدم، ويقترح لفصل البلازما داخل ح 2 من جمع الدم31 .

انحلال الدم إلى حد كبير بسبب انهيار خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وما يترتب عليها من الإفراج عن مضمونها في البيئة المحيطة. وهذا يمكن أن يكون مشكلة بالنسبة لتعميم ميرناس الاختبار لأن الإفراج عن محتوى كرات الدم الحمراء داخل الخلية يغير جذريا الشخصية ميكرورنا في الدم، والتي يحتمل أن تؤثر على دقة التحليل القائم على البلازما30.

القدرة على تحديد مستويات دنيا من انحلال الدم في عينات البلازما أيضا أمر حاسم للدراسات استناداً إلى تعميم ميرناس كالمؤشرات الحيوية. في البداية يمكن تقييم انحلال الدم بالفحص البصري، منذ بعد خطوتين الطرد المركزي لون البلازما يمكن أن تتراوح من الأصفر إلى اللون الأحمر للعينات عالية هيموليزيد. ومع ذلك، قد لا يكون مجرد التفتيش البصري حساسة بما يكفي في سياق البحوث العلامات البيولوجية الجزيئية.

طريقة بسيطة، قبل التحليلية التعرف على عينات البلازما هيموليزيد هو قياس سبيكتروفوتوميتريك في الطول الموجي (λ) = 414 نيوتن متر امتصاص ذروة الأوكسي الرئيسية، بعد التعديل المناسب لأي مصدر آخر للتدخل. ولهذا السبب، نحن تطبيع الذروة نانومتر 414 إلى قيمة امتصاص في 375 نيوتن متر، يدل على المحتوى ليبيديك33. وبدلاً من ذلك، أو أفضل، في الجمع، ونقاط ليبيميا-إينديبيندينثيموليسيس (HS) يمكن أن تستخدم34. يمكن تحديد هذا الإجراء على أساس سبيكتروفوتوميتريكالي على الأقل 6.1 مغ/دل الهيموغلوبين مجاناً. وبخلاف ذلك، يمكن تحديد العينات هيموليزيد من خلال الكشف عن ميرناس الخاصة بكرات الدم الحمراء. منذ حتى نسبة مئوية منخفضة جداً من انحلال الدم يمكن الحصول على زيادة كبيرة في مستويات ميرنا الخاصة بكرات الدم الحمراء32، وفورتوناتو et al. تحديد توقيع المتصلة بانحلال الدم محدد استناداً إلى نسب ميرناس 16 التي يمكن كفاءة تصنيف انحلال الدم في عينات البلازما33. جميع فحوصات المذكورة يمكن أن تستخدم في تركيبة منذ أن نسبة امتصاص 414/375 و/أو اعتماد النظام المنسق في مرحلة تحليلية قبل توفير تكاليف إضافية، بينما قياس ميرناس المتعلقة بانحلال الدم يمكن استخدامها في مرحلة ما بعد تحليلية كعنصر تحكم الجودة الخطوة.

تعميم ميرناس العزلة ونقاء الحمض النووي الريبي
استخراج الحمض النووي الريبي الداخلي خطوة مؤثرة جداً لنجاح التحاليل اللاحقة. بدءاً من نموذج إدخال منخفضة، مثل البلازما، استخراج يحتاج إلى أن تكون فعالة قدر الإمكان لضمان القياس الكمي دقيق ميرناس. البلازما تتميز بتركيزات مرتفعة من البروتينات كثيرة، بما في ذلك نوكليسيس، والعناصر الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع التفاعلات الانزيمية المصب من الرايت قبكر ويمكن أن يؤثر على الكشف عن ميرناس المتداولة. وقد استخدمت عدة أساليب الاستخراج في هذه الأنواع من الدراسات، ولكن بشكل عام، يسمح استخراج العضوية تليها تخصيب الجيش الملكي النيبالي على السليكا إزالة مثبطات البلازما أفضل ثم تريزول وحدها35. ومع ذلك، في السنوات القليلة الماضية، تم استبدال الاستخراج اليدوي بالاستخراج الآلي. طفيفة خطر التلوث، وفي إمكانية تكرار نتائج أعلى، واستخدام الوقت الاقتصادية هي المزايا الرئيسية للنظم الآلية مقارنة بالبروتوكولات العزل اليدوي. وعلاوة على ذلك، حققت أساليب الاستخراج الآلي المبالغ ميرنا أعلى من عينات الدم وكفاءة أعلى مقارنة بالبروتوكولات اليدوي36.

مسألة التطبيع
تطبيع مستويات البلازما ميرنا لا تزال مسألة مثيرة للجدل. وفي الواقع، اختلافات في كمية أو نوعية نموذج يمكن أن تتداخل مع تحديد تغييرات حقيقية في مستوى التعبير ميرناس بسبب وجود أو خطر الأمراض، وهكذا تؤدي إلى تفسيرات البيانات غامضة ومضللة الاستنتاجات. حتى الآن، أدى انعدام توافق الآراء بمختلف استراتيجيات التطبيع37.

مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات البلازما عادة دون عتبة أساليب القياس الكمي القياسية مثل كانت الأشعة فوق البنفسجية أو كانت تستند إلى الأسفار، مما حال دون توحيد أسلحة الجيش الملكي النيبالي38. ونتيجة لذلك، ينبغي اختيار وحدة تخزين ثابتة بدلاً من مبلغ محدد من الحمض النووي الريبي التيد كمدخل ل رد فعل RT39.

التدبير المنزلي النصوص المستخدمة لتحليل ميرنا في عينات الأنسجة، مثل RNU48 و RNU6، ليست مناسبة لتطبيع القياسات ميرنا خارج الخلية، كما أنهما لا يمكن كشفها في الدورة الدموية، وسبب تدهور رناسي بوساطة40، دائماً وأيضا رفع الضوابط التنظيمية ب طريقة خاصة بالمرض37. ليس واضحا إذا كان ميرناس تعميم أي فعالية يمكن أن تستخدم كمرجع عناصر التحكم. على سبيل المثال، كثيرا ما يقترح مير-16 للتدبير المنزلي، ولكن دوقد أظهرت الدراسات إيفيرينت هو حرر في عينات البلازما لمرضى السرطان28،37. وعلاوة على ذلك، تتأثر مير-16 مستويات عالية انحلال الدم30.

بينما لفحوصات الفائق هو قياس ميرناس عدة وتطبيع على قيمة التعبير يعني41من المقبول عموما، عند عدد محدود من ميرناس يحتاج إلى تحليل، لا يمكن تطبيق هذا النهج التطبيع. من أجل تجاوز مسألة التطبيع، أثبت موسلي et al. قبل خوارزمية استناداً إلى نسب متبادلة بين 24 ميرناس28. هذا نهج، على الرغم من كونها مفيدة جداً لتطوير أداة التشخيص، لا تسمح بسهولة التمييز بين فعالية غيرت ميرناس التي ربما لها دور في التنمية الورم، وهكذا تحديد ميرناس كإله لفرز عاملة. تستند استراتيجية فعالة أخرى، التي اعتمدها فريق بيانكي et al. أن تطوير مير اختبار مصل الدم للكشف المبكر سرطان الرئة، تطبيع في الوسط الهندسي لمجموعة من 6 "التدبير المنزلي المصل-ميرناس" متفاوتة أقل بين العينات و فئات من المرضى42.

ميزات "خزعة سائلة" و "إمكانية تطبيقها" على أساس ميرنا
لجنة السلامة البحرية على أساس البلازما اختبار غير الغازية جزيئية درس للتشخيص المبكر لسرطان الرئة في المدخنين الثقيلة. لجنة السلامة البحرية اختبار يمكن تحديد مواضيع متوسطة أو عالية الخطورة قبل الكشف عن سرطان الرئة من لدكت، مع حساسية عالية (سراج الدين، 87%) والقيمة التنبؤية السلبية (NPV، 99 ٪). على وجه التحديد، يمكن تنفيذ ماجستير الفرز لدكت بتقليل نتائج إيجابية كاذبة بنسبة 3.7 في المائة، من 19.7 في المائة ل وحدها لدكت29. لجنة السلامة البحرية اختبار أظهرت أيضا أن يكون أداء جيد تشخيصية عند النظر في الرئة فقط مرضى السرطان، ويمكن أن تستخدم كأداة لرصد وحدها أو بالاشتراك مع غيرها43،معلمات المرضية الإكلينيكية44. يحتمل أن تكون، يمكن تمكين لجنة السلامة البحرية اختبار مزيد من الاتساق في الرئة السرطان خوارزميات التشخيص، وبالتالي تقليل فعالية تكاليف الفحص.

وإلى جانب لجنة السلامة البحرية، أبلغ عن غيرها من الاختبارات غير الغازية للكشف المبكر عن سرطان في الرئة. بيانكي وآخرون. واقترح تعميم مير-اختبار استناداً إلى توقيع ميرنا 3445، ثم خفضت إلى توقيع ميرنا 1342. وتم الحصول على عينات المصل فورديسكوفيري والتحقق من صحة الفرز المحاكمة، المنجز من استمرار المراقبة للتدخين في المواضيع (الكون) لدكت في "المؤسسة الأوروبية للأورام" (إييو، ميلانو، إيطاليا). وأظهرت مير-الاختبار دقة 78 في المائة بالنسبة للكشف عن سرطان الرئة في المتطوعين المعرضة للخطر. بين المصل-ميرناس 13 و 24 تأليف لجنة السلامة البحرية، كانت متداخلة ميرناس 5 فقط (92a مير مير-30b، مير-30 ج، مير-148a وف مير-140-5). يمكن أن ترجع إلى نوع مختلف من ابتداء من عينات (المصل مقابل البلازما) وإلى وضع البيانات. في الواقع، مير-الاختبار، ميرناس 6 المحدد المؤلف يتصرف كالتدبير المنزلي في مصل الدم، 3 التي أدرجت أيضا ضمن نسب ميرنا ماجستير (مير-15b و 19b مير مير-197). ومع ذلك، الماجستير في البلازما ومير-الاختبار في عينات مصلية أكثر عميق التحقق من صحة استخدام المستندة إلى ميرنا خزعة سائلة للكشف عن الإصابة بسرطان الرئة.

وقد أجريت ميرناس إنشاء تشكيل جانبي للتعرف على المؤشرات الحيوية سرطان الرئة أيضا في عينات البصاق46. البلغم يمكن جمعها بسهولة، ويبدو أن مستويات التعبير ميرنا مستقرة للغاية في ذلك. ولكن المتطوعين فحص سرطان الرئة تزيد أعمارهم عن 50-55 سنة وهم من المدخنين الثقيلة مع المراضات المشاركة مثل هذا المرض، مما يجعل البصاق يصعب الحصول عليها. وفي الواقع، بين سوائل الجسم المختلفة، البلازما هو واحد من أفضل البدائل للتحقيق في الدور المحتمل ميرناس ك (لكن لا تقتصر على) المؤشرات الحيوية في سرطان الرئة.

وعموما، يمكن أن يكون الإجراء الموضح في هذه الورقة ذات الصلة في سياق الأمراض المختلفة، مع عدم تقييد في نوع الأمراض التحقيق (من السرطان، إلى الجهاز العصبي واضطرابات القلب والأوعية الدموية أو مرض السكري) والغرض من الاستخدام السريري (العلامات البيولوجية للتشخيص، والتشخيص، أو حتى استجابة للعلاج).

Disclosures

غابرييلا Sozzi وموسلي ماتيا فؤاد باستورينو هي المخترعين المشارك من ثلاثة طلبات براءات الاختراع المرخصة "علوم الحياة جينسيجنيا"، فيما يتعلق بتوقيع ميرنا الكشف عنها في هذه المقالة. أن تعلن جميع المؤلفين المتبقية لا تضارب في المصالح فيما يتعلق بالعمل المقدم.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون باولا سواتوني، إيلينا بيرتوكتشي، كارولينا نيني، أنا كالانكا، وبانفي كيارا للتعامل مع المتطوعين في المحاكمات، والمساعدة الإدارية؛ وجاكوميلي كلاوديو وكلاوديو سيتيريو لإدارة البيانات. وأيده العمل "الرابطة الإيطالية" "أبحاث السرطان" [منح المحقق رقم 15928 إلى أعلى، 14318 لفئة الخدمات العامة، و 12162 (البرنامج الخاص "أدوات مبتكرة لتقييم مخاطر السرطان والتشخيص المبكر"، 5 × 1000)]؛ وزارة الصحة الإيطالية [رقم المنحة الترددات اللاسلكية-2010]؛ منح UO1 CA166905 من معهد السرطان الوطني (الولايات المتحدة الأمريكية). وأيد على "زمالة بيزكولير مؤسسة" ميغا بايت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202, (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365, (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63, (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3, (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6, (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105, (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22, (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10, (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4, (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11, (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28, (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15, (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18, (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12, (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38, (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15, (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11, (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362, (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32, (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5, (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19, (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6, (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14, (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37, (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61, (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10, (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50, (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7, (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19, (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20, (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3, (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17, (4), 494 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics