MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

Burada, BioMILD kabul edilen detaylı Protokolü deneme erken akciğer kanseri teşhis için dolaşımdaki mikroRNA imza Sınıflandırıcısı sınama gerçekleştirmek için eleme mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Minimal invaziv için bir test, sıvı biyopsi gibi erken akciğer kanseri teşhis preklinik aşamasında bu ölümcül hastalık sonucu geliştirmek için çok önemli bir gelişmedir. MikroRNA (miRNAs) küçük, biyolojik sinyaller hücre dışı haberci hareket edebilir gen ifadesinin düzenlenmesine RNA'ların kodlamayan tümör ve onun çevresindeki microenvironment arasında çapraz konuşma türetilmiş belirli doku bulunur. Böylece akciğer kanseri erken teşhis için ideal aday temsil edebilir. Bu çalışmada, metodolojik bir iş akışı plazma numuneleri akciğer kanseri tarama deneme içinde kayıtlı gönüllü olarak özel yapılmış mikrosıvısal kartları ve nicel gerçek zamanlı PCR kullanarak dolaşımdaki miRNA testi potansiyel doğrulama için önerilmiştir. Buna ek olarak, hemoliz ile ilgili miRNAs ve daha genel teknik sorunları analiz etkileyebilir beri standart işletim prosedürleri dahil kalite kontrol adımları da sunulmaktadır. Protokol tekrarlanabilir ve güvenilir sayısal sonuçlar verir; Ancak, büyük klinik serisi kullanırken, önceden analitik ve analitik özellikleri dikkatle değerlendirilmelidir.

Introduction

Akciğer kanseri en sık kanser dünya çapında, tüm kanser tanı1yaklaşık % 25 muhasebe tanısı var. Akciğer kanseri ölüm oranı sürekli azalma azaltılmış Tütün kullanımı, özellikle nedeniyle son 2 yılda rağmen akciğer kanseri kadınlarda ve erkeklerde kanser ölüm önde gelen nedenidir kalır. 2017 yılında yaklaşık % 25 ve Amerika Birleşik Devletleri ve Avrupa, sırasıyla1,2toplam kansere bağlı ölümlerin % 20 için hesabına tahmin edilmektedir.

Belirtiler genellikle erken hastalık meydana gelmez beri akciğer kanserlerinin çoğunluğu geç aşamalarında tanısı vardır. Bu tedavi müdahale ve tedavi3zavallı etkinliği için sınırlı bir olasılık yol açar. Bu nedenle, birçok bilimsel çabaları etkili bir test erken akciğer kanseri teşhis için belirlenmesi hedefleniyor.

Düşük doz hesaplanan tomografi (LDCT) erken aşama akciğer kanseri4algılama Radyografi ile karşılaştırıldığında daha iyi bir araç, ancak çeşitli denemeler eleme göğüs Radyografi akciğer kanseri taraması, hiçbir değeri yoktur gösterir. Ayrıca, thatscreening LDCT kullanımı ile akciğer kanseri ölüm arasında mevcut ve eski ağır Sigara içenler%520 indirimli gösterilmiştir. Bu veri kurallarda birkaç profesyonel toplumlar4,6tarafından tanımlanan bir yüksek riskli nüfus akciğer kanser tarama kullanımını destekler.

Not, LDCT tarama, büyük endişeler arasında yanlış pozitif sonuçları ve aşırı tanı yüksek oranda vardır. Öyle olmak, bilimsel topluluk bu sorunları aşmak ve LDCT tarama testi özgüllüğü artırmak için bir strateji arıyor. Non-invaziv tamamlayıcı biyolojik gelişimi burada yararlı olabilir. Bugüne kadar aday biyolojik miRNAs, boş hücre DNA, gen metilasyonu, küçük proteinler ve diğerleri gibi soruşturma altında geniş bir liste var7.

Kan tabanlı biyolojik, miRNAs, dolaşan ve bağışıklık yanıtı biyolojik dahil olmak üzere daha gelişmiş doğrulama aşaması8ulaşmak bunlar. Bağışıklık yanıtı biyolojik her iki hücre içi ve yüzey tümör antijenleri karşı bağışıklık yanıtı akciğer kanseri hastaları9' inşa edilir bilgi temel alır. Örneğin, Ajona vd. C4d, tanı ve Prognozunda akciğer kanseri10klasik Kompleman yolun bir bozulma ürün rolü değerlendirildi. Aksi takdirde, bir ticari olarak mevcut otoantikorlar serum test yedi tümör ile ilgili antijenleri küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarda doğrulanmış ve % 36'duyarlılık ve özgüllük%1191'i gösterdi. Bağışıklık yanıtı biyolojik ilginçtir ama daha fazla doğrulama çalışmaları için potansiyel bir klinik uygulaması gereklidir.

miRNAs çoğu endojen küçük kodlamayan RNA'ların korunmuş mekanizması ve hayvan ve bitki Krallık tüm büyük fonksiyonel önemi ile. Protein çeviri düzenleyen miRNAs rolü vardır: Onlar hedef genlerin12büyük bir set ifade bastırmak. İyi belgelenmiş değişiklikler ofmiRNAs ifade en insani kanser12,13,14patogenezinde katkıda bulunmak. Buna ek olarak, miRNAs, microvesicles alanlarına veya RNA bağlanıcı proteinler, derneğe vücut sıvıları plazma ve serum15,16, idrar17 gibi içine onların birleşme tarafından stabilize tümör ve stromal hücreler serbest bırakmak ve tükürük18. MiRNAs dolaşan böylece ana bilgisayar yanıt ve tümör ve onun microenvironment19arasındaki dinamik etkileşimi yansıtıyor olabilir. Birlikte ele alındığında bu gözlemler biyolojik insan kanser tespiti için umut verici bir sınıfın dolaşımdaki miRNAs yaptık.

MiRNAs dolaşan tespit farklı yöntemler kullanarak: Mikroarray platformlar20, nicel ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR)21ve sonraki nesil sıralama (NGS)14,22. Söz konusu teknolojilerini temel alan çeşitli ifade profil çalışmalar son yıllarda geliştirilmiştir. Mikroarray kadar binlerce miRNAs tek tek tahlil analiz etmek güçlü bir yüksek-den geçerek teknolojisidir. Ancak, alt dinamik alan ve RT-qPCR ya da NGS ile karşılaştırıldığında özgüllük vardır. Ayrıca, Mikroarray nicel olmayan bir yöntemdir, bu nedenle daha fazla deneysel doğrulama gereklidir. Serisi tabanlı yöntemler bilinmeyen miRNAs tanımlaması izin verebilir ve bir keşif aşamasında özellikle uygundur. Öte yandan, NGS yöntemleri hala pahalı ve özel ekipman ve uzman bioinformaticians, böylece bunların kullanımı büyük doğrulama tabur ve klinik ayarları23sınırlama gerektirebilir. Şu anda RT-qPCR miRNA algılama teşhis/klinik bağlam24içinde dolaşan en kabul edilen platformdur. MiRNAs analiz için farklı RT-qPCR teknolojileri mevcuttur, ancak TaqMan PCR tarafından takip sap-ilmik RT en çok kullanılan25' tir. Bu teknik son derece hassas ve doğru (tek nükleotid ayrımcılık) ve yüksek dinamik Aralık; Ancak, bilinen miRNAs sadece algılanmasını sağlar.

MikroRNA kalite kontrol Mestdagh vd. , kapsamlı miRNAs üç yukarıda belirtilen teknolojileri26tarihinde dayalı profil oluşturma için piyasada bulunan bazı platformlar özellikleri araştırıldı tarafından (miRQC çalışma) çalışma. 196 miRNAs doku ve serum numuneleri analiz ederek, farklı platformlarda performansını tekrarlanabilirlik, hassasiyet, doğruluk, özgüllük ve fark ifade uyumluluk açısından değerlendirildi. Sonuçları platformlar üzerinde NGS dayalı ve Mikroarray teknolojileri daha yüksek bir tekrarlanabilirlik ve özgüllük vardı, ama RT-qPCR platformlar daha doğru duyarlı ve vücut gibi düşük giriş RNA örnekleri için özellikle yüksek hafiye oran vardı olduğunu göstermiştir sıvılar. Böylece RT-qPCR rutin Klinik teşhis potansiyel bir uygulama için en uygun yöntem gibi görünüyor.

2011 yılında Sozzi vd. gönüllü bir ilk LDCT screeningtrial (INT IEO deneme)27 içinde kayıtlı ve dört miRNA imzalar miRNAs dolaşan 24 arasında karşılıklı oranları bestelediği toplanan plazma numuneleri miRNA profil analiz. oluşturulan. Bu imzaları hastalardan herhangi hastalık özgür bireyler ayrımcılık ya da ölümcül akciğer kanseri LDCT hastalığı algılama28önce zaman ya da ilâ 2 yaşında. Başka bir yazıda, ilki için açıklanan aynı grup hastaların risk üç düzeyde tabakalaşmak için dört miRNA imzalar birleştirerek elde miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC), zaman: yüksek, orta ve düşük. Klinik yararını 1.000'den fazla kişi hafif tarama deneme, bir gözlem kol29yıllık veya Bienal LDCT silahlarla karşılaştıran randomize bir çalışma kayıtlı büyük bir retrospektif set doğrulandı. Nitekim, MSC ve LDCT ile birlikte LDCT yanlış pozitif oranı ile yaklaşık 5 kat azalır ve üç MSC risk gruplarıgenel sağkalım ile ilişkili.

Daha sonra "Fondazione IRCCS Istituto Via dei Tumori", 2013 yılında (Milan, o) LDCT göre MSC test yayına başladı plazma ile uygulama bir potansiyel tarama deneme (BioMILD). BioMILD deney sırasında kayıtlı gönüllü plazma için özel yapılmış mikrosıvısal kartlarını kullanarak profil oluşturma miRNA ayırmak için hemen işlenir LDCT ve kan çekilmesi tabi. LDCT ve MSC sonuçları kombinasyonu algoritması24eleme özel tanımlar.

Mevcut çalışmada, kan örnek koleksiyonundan plazma yalıtım için RNA ayıklama, başlangıç BioMILD deney sırasında kullanılan tüm metodolojik Protokolü tanımlanır ve RT-qPCR mikrosıvısal kartları yapılan 24 miRNAs ifade özel kullanarak profil oluşturma. Yüksek tutarlılık ve tekrarlanabilirlik göz önüne alındığında, bu yordamları sıvı biyopsi miRNA tabanlı diğer hastalıklarda gelişimi için de kullanılabilir.

Protocol

protokol kuruluşumuz araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. plazma örnek koleksiyon

K 2 EDTA sprey boyalı ve mağaza oda sıcaklığında tüp tüplerini örnekte
  1. tam kan toplamak 10 mL.
    Not: hemoliz en aza indirmek için 2 h içinde plazma ayırın. Tam kan ve termal şok önlemek için bir belirsiz miRNA sürüme kurşun lizis hücre düşük sıcaklıkta (Yani, 4 ° C) depolamayın.
  2. 1 h, içinde ayrı plazma 1,258 x g ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle ilk Santrifüjü adımda tarafından
  3. Dikkatle lenfositik yüzük ile temas kaçınarak bir 15 mL tüp içine süpernatant plazma transfer.
  4. Santrifüj plazma ikinci kez 1,258 x g ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle
  5. Plazma plazma kesir tüpün dibinde toplama kaçınarak 1.5 mL cryovials içine aliquot 1 mL.
  6. Saklamak, Bütün aliquots − 80 ° C, biri hemoliz değerlendirilmesi için hariç. Moleküler analiz 5 hafta içinde gerçekleştirilmelidir.

2. Hemoliz spektrofotometrik ölçüm tarafından değerlendirilmesi

    hemen spectrophotometry için bir küvet içinde plazma ayrılık adım yaptıktan sonra bir 1:10
  1. 1 X PBS (örneğin, 1 X 900 µL plazmada 100 µL plazma örnekte seyreltme PBS) ve bunu homojenize mix
    Not: spektrofotometrik ölçümler, donma-çözülme olarak örnek (ve özellikle numunelerde örneklerinde) ile spektrofotometrik analiz müdahale flocculates formu önce plazma örnek Dondurulmuş olması değil.
  2. 375 Absorbans okumak nm, 414 nm, 541 nm ve 576 UV-VIS Spektrofotometre ile temel düzeltme kullanarak nm yerleşmiş 750 nm ve yol uzunluğu 10 mm. 1 mL 1 x PBS kullanarak boş bir ölçüm yapmak.
  3. 414 Absorbans arasındaki oran hesaplamak nm ve 375 nm; 1.4, daha yüksek hemolyzed örnek göz önünde bulundurun ve kan çekilmesi tekrar If (QC1, Tablo 1).

3. Plazma toplam RNA çıkarma

1-Thioglycerol mL homojenizasyon çözeltisi başına
  1. hazırla 1-Thioglycerol/homojenizasyon (OMG) çözüm ile 20 µL. 1-Thioglycerol viskoz olduğu için dikkatli bir şekilde doğru ölçüm için pipet. Bunu kullanmadan önce OMG çözüm buz üzerinde veya 2-10 ° c soğuk
    Not: Çalışan çözüm için 1 ay 2-10 ° C'de kararlı.
  2. ben, 275 µL nükleaz ücretsiz ekleyerek şişeyi su ve karışımı yavaşça lyophilized Dnaz askıya (değil girdap yapmak). 5 görsel bir yardım ekleyin µL mavi Sulandırılan Dnaz boya ve tek kullanımlık aliquots nükleaz ücretsiz tüpler içine çözüm dağıtmak. Sulandırılan Dnaz depolamak ben-30 ° c ile -10 ° c
  3. Plazma 200 µL başlayarak, soğutulmuş OMG çözüm 200 µL ekleyin.
  4. Tam bir homojenizasyon sağlamak için
  5. girdap 15-30 s. Köpük oluşursa, buz üzerinde yerleşmek örnek izin
  6. Eklemek 200 µL lizis arabellek ve İndinavir K 25 µL homojenize örnek ve 20 için girdap s.
  7. Örnekleri için bir thermomixer 15 dk 37, ısıtılmış Incubate ° C.
  8. Enstrüman güverte tepsisindeki her örnek için bir kartuş yük ve plugger uygun konumda yer.
  9. Enstrüman kartuş uygun pozisyonda lysate transfer.
  10. Ekleyin 5 µL Dnaz, ben kartuşu uygun konumda çözüm.
  11. Ekleyin 60 µL nükleaz ücretsiz su her elüsyon tüp tabanına.
  12. Select " RSC miRNA doku " yöntemi ve çalıştırın otomatik arıtma başlar. Toplam RNA örnekleri-ebilmek var olmak stok vasıl − 80 ° C.

4. Taq tabanlı RT

  1. RNA cDNA Taq mikroRNA ters transkripsiyon kiti ile dönüştürmek için faiz miRNAs ile Taq RT astar havuzu kullanın.
  2. RT tepki Mix özel Taq RT astar havuzun 6 µL kullanarak kiti talimatlara göre 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde buz üzerinde hazırlamak 12 µL.
  3. RNA 15 µL son hacmi için toplam ve buz 5 dakika süreyle kuluçkaya ekle 3 µL
  4. Yük bir termo-cycler aşağıdaki gibi yapılandırılmış bir RT tepki: 16 ° C 30 dk, 30 dk, 5 dk ve tutun 4 85 ° C için 42 ° C ° C.
    Not: CDNA deposu -15-20 ° c, en az bir hafta olabilir.

5. Öncesi amplifikasyon

  1. her RT ürün Mix 2.5 µL Taq Master Mix 2 x, 3.75 µL özel Taq havuzu ve 6.25 µL nükleaz ücretsiz su, 25 µL toplam hacmi için 12.5 µL ile.
  2. Gerçekleştirmek termo cycler göre aşağıdaki termal profili kullanarak ön amplifikasyon tepki: 10 min, 55 ° C için 2 dk, 72 ° C için 2 dk, 12 devredir 15 95 ° c için 95 ° C s ve 4 dk 60 ° C , sonra 10 dakika için 99,9 ° C'de ve 4 basılı ° C.
  3. 0.1 X TE, pH 8.0 175 µL ekleyerek ürün sulandırmak.
    Not: Seyreltilmiş Ürün için en az bir hafta -15-20 ° c mağazasında olabilir.

6. RT-qPCR reaksiyon özel Taq dizi mikroRNA kartlarındaki

plazma seviyeleri (yinelenen içinde benekli) 24 belirli miRNAs 8 örnekleri üzerinde aynı anda ölçmek için
  1. Kullanım 384-şey microfluidicCustom Taq dizi mikroRNA kartı. MiRBase kimliği (v21) için 24 miRNAs vardır: sahip-miR-101-3 p, vardır-miR-106a - 5p, sahip-miR-126-3 p, vardır-miR-133a - 3p, sahip-miR-140-3 p, vardır-miR-140-5 p, sahip-miR-142-3 p, vardır-miR-145-5 p, vardır-miR-148b - 3p, vardır-miR-15b - 5p, vardır-miR-16-5 p, vardır-miR-17-5 p, sahip-miR-197-3 p, vardır-miR-19b - 3p, vardır-miR-21-5 p, sahip-miR-221-3 p, sahip-miR-28-3 p, vardır-miR-30b - 5p, vardır-miR - 30c - 5p, miR 320a vardır, vardır-miR-451a, vardır-miR-486-5 p, vardır-miR-660-5 p ve vardır-miR-92a - 3 s.
  2. 2 X Taq evrensel Master Mix 56.25 µL ve 55.69 µL nükleaz ücretsiz su 0.5 mL tüp ile seyreltilmiş PreAmp örnek Mix 1,13 µL.
  3. 8 PCR reaksiyon mix özel Taq dizi mikroRNA kartlarındaki yük.
  4. Vasıl 311 x g 2 dakika süreyle santrifüj
  5. Dizi kartı mühürleyen özel kartla mühür.
  6. Gerçek zamanlı olarak Bisiklete binme parametreleri değiştirmek bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak tepki çalıştırın: 94,5 ° C 10 min, 30 97 ° C 40 döngüleri için s ve 59,7 ° C 60 s.

7. Veri ekstrapolasyon ve oranları üretimi

    arka plan sinyalleri ve 0,15 tüm deneyleri ve örnekleri için sabit bir eşiği kaldırmak için otomatik bir temeli ayarlama ham Ct değerler elde etmek için
  1. kullanma belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Kaldır lekeleri zavallı amplifikasyon eğrileri ve/veya zavallı pasif referans sinyalleri ile.
  2. Ham Ct değerleri verme " .xls " format ve daha fazla analiz için iki çoğaltmaları Ct demek değerini kullanın.
  3. İlişkili miRNAs ' klinik çalışma örnekleri üzerinde tarihi ölçümler düzeylere ifade (Tablo 2). Örnekleri her özel yapılmış mikrosıvısal kartında en az % 50 bir Pearson neden oluyorsa ' s korelasyon < 97.5, tekrar kartı (QC2, Tablo 1).
  4. Hesaplama − ΔCts bütün miRNAs, miRNA oranları log2 değerine eşdeğer arasında.

8. Hemoliz değerlendirilmesi ile ilgili miRNA imza

  1. Generate aşağıdaki miRNA oranları kısa depolama plazma numuneleri için ilgili kesintileri ile (log2 değerler) kullanarak miRNA hemoliz ile ilgili imza (1-5 haftalıkken − 80 ° C): miR-126/451 < − 0,07, 15b/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0.33, 15b/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3.17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15B/92a < − 1,8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0,87, 126/16 < − 2.85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5,9, 30b/16 < − 3,68.
  2. Hemolyzed örnekleri nerede oranları (8 dışarı-in 16) en az % 50 aşan ilgili kesme olarak sınıflandırmak (QC3, Tablo 1).

9. Risk düzeyi tanımı: yüksek, orta ve düşük

  1. tanımla dört imzalarını Master programı olarak şekil 3 ' te rapor oluşturma miRNA oranları: hastalığı (RD), agresif hastalığı (RAD), varlığı riskini riskini hastalığı (PD) ve agresif hastalığı (PAD) varlığı.
  2. Her imza için kısa depolama plazma numuneleri için ilgili cut-off değeri aşan oranlarda tanımlamak (1-5 haftalıkken − 80 ° C). Aşan oranlarda Pozitif düşünülmesi gereken 9 dışarı-in 27 RD ve PD ve dışarı-in 14 28 RAD ve PAD ( şekil 3 A) sayıdır.
  3. Özniteliği her örnek için ilgili MSC risk düzeyini aşağıdaki gibi: Eğer düşük risk RD negatif ∩ PD negatif ∩ RAD negatif ∩ PAD negatif; orta risk Eğer RD pos ∪ PD pos ∩ RAD negatif ∩ PAD negatif; veya yüksek risk RAD Eğer pos ∪ PAD pos ( şekil 3 B).

Representative Results

BioMILD deneme kombine LDCT-MSC yaklaşım verimliliği ilk satır tarama testleri olarak ağır sigara içen kişilerin büyük bir kohort içinde test amacı ile akciğer kanseri erken teşhis için potansiyel bir çalışmadır. Bir sınıf risk oranları arasında 24 plazma dolaşımdaki miRNAs değerlendirir miRNA test temelinde her gönüllü atfedilir. Büyük ölçüde bildirilen30,31,32, hemoliz kan hücreleri tarafından miRNAs özel olmayan bir sürümü nedeniyle yanlış sonuçlar elde beri miRNA, dolaşan analiz için kritik bir konudur. Önerilen metodolojik iş akışında, önceden analitik kalite kontrol adım ( Tablo 1' deki QC1) tanımlamak için hemolyzed ve böylece sigara-analyzable, plazma numuneleri açıklanan. Şekil 1 hemolyzed (şekil 1A) ve sigara hemolyzed (şekil 1B) plazma numuneleri ile ilgili A414/A375 değerleri bir spektrofotometrik analiz raporları. Klinik bir bağlamda moleküler testi sonuçlarını gönüllü yönetim için çok önemli bu QC1 sağlar edilmistir kan örnekleme yinelenen ve çoğu durumda, geri yükleme örnek.

Moleküler işlendikten sonra RT-qPCR performans doğru bir şekilde teknik sorunları belirlemek için değerlendirilmelidir. Resim 2 A RT qPCR bir zavallı pasif başvuru sinyal nedeniyle düşük bir performans ile gösterir. Bu durumda yeni bir mikrosıvısal kartı ön amplifikasyon ürünü yüklenmesi önerilir. RT-qPCR de, ' Resim 2deki gibiB, gerçekleştirdiğinde kart miRNA ifade değerleri tarihi ölçüm ile karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için ilk yazı analitik kalite kontrol adıma devam eder (QC2, Tablo 1). QC2 adım başarısız olursa, teknik bir sorun ters transkripsiyon sırasında veya öncesi amplifikasyon reaksiyonlarda oluşmuş olabilir ve ters transkripsiyon başlangıç tüm moleküler işleme tekrarlamak uygundur.

Son kalite kontrol adım (QC3) Tablo 1' de moleküler düzeyde hemoliz değerlendirir. 4 eritrosit özel miRNAs (mir-16, mir-451, mir-486-5 p ve mir-92a) düzeyde ifade karşılaştırıldığında o 4 Sigara hemoliz ilgili miRNAs (mir-126, mir-15b, mir-221 ve mir-30b) için tarafından miRNA hemoliz ile ilgili imza oluşturma oluşur 16 (4 x 4) miRNA oranları. Olumlu örnekler negatif örnekler son MSC risk düzeyi sınıflandırma için iletişim kuralı Bölüm 9 ve şekil 3' de anlatıldığı gibi devam ederken hemolyzed olarak sınıflandırılır.

Figure 1
Şekil 1: Spektrofotometrik analiz taze plazma örnekleri. (A) hemolyzed 2 spektrofotometrik profilleri ve (B) 2 sigara hemolyzed plazma numuneleri, dalga boyu A414 ve A375 arasındaki Absorbans oranı ölçme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : RT-qPCR performans mikrosıvısal kartları analiz. Amplifikasyon ve multicomponent yoksul karşılaştırma(a)ve (B) kaliteli mikrosıvısal kartları çizer. Tüm 24 miRNAs ve tek exemplifying miRNA her panelinde rapor edilir. Uygulamasının araziler bu RT-qPCR reaksiyonlar meydana gelen pasif referans sinyalleri gösterilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: MSC algoritması için risk stratifikasyon. Temsilcisi sonuçları 6 plazma numuneleri gönüllülerin dikkate alınarak deneme eleme BioMILD kayıtlı. (A) hastalığı (RD), agresif hastalığı (RAD), hastalık (PD), agresif hastalığı (PAD) ve-80 ° C'de için depolanan plazma numuneleri için karşılık gelen kesme değerleri (log2) varlığı varlığı riskini riskini miRNA oranları imzaları En azından 1 hafta ve 5 hafta kadar. (B) birlikte dört imzalarını tabakalaşmak analyzable örneklerinde yüksek (H) için (ı) orta ve düşük (L) MSC risk düzeyi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Tuzaklar ve metodolojik iş akışı sorunları
BioMILD bir tanı aracı olarak dolaşan miRNAs analiz ilk prospektif çalışma olduğu için eşikleri ve kesintileri veri-analiz için kullanılan retrospektif serisinden oluşturulan. Plazma numuneleri farklı depolama aralığını üstesinden için parametreleri muhtemelen MSC performans artışı elde etmek için rafine olabilir. Yine de, miRNAs analiz başlamadan önce genel işlem çeşitli yönleri dikkatle, katılım kriterleri, örnek toplama ve işleme, gibi değerlendirilmesi gereken ve Biyoinformatik algoritma veri analizi için kabul. Aşağıdaki bölümlerde açıklanan mevcut gazetede, her tek adım önemli konulara ve bunların üstesinden stratejileri öneriyor iş akışının en kritik noktaları ele alınacak.

Çalışma nüfus
Deneme eleme BioMILD için kayıt ölçütlerdir: 50-75 yıl eski, ağır geçerli veya (10 yıldan az) eski Sigara içenler ile en az 30 paketi-yıl ve 5 yıl içinde kanser önceki öyküsü. Bu nüfus içinde tahmini akciğer kanseri sıklığı ve insidansı yılda yaklaşık % %1 0.7, idi. Önerilen protokolünde açıklandığı gibi MSC test uygulamak için analiz nüfus benzer özellikleri korumak gerekir. Özellikle, yukarıda açıklanan QC2 adım benzer bir popülasyondan elde edilen belirli tarihsel verilerle karşılaştırma içerir. Bir korelasyon 97.5 aşağıda teknik sorunları göstergesi olabilir, öte yandan, akciğer kanseri olan risk yansıtan değişmiş dolaşımdaki miRNA düzeylerine sahip çoğu kişiler aslında bu eşiğin altında iken. Başka bir deyişle, QC2 adım burada bildirilen parametreleri ile gelişmekte olan akciğer kanseri riski daha yüksek bir popülasyon için uygulanırsa, kabul edilebilir örnekleri hariç tutabilirsiniz. Yeni, uygun başvuru parametreleri sonra göre beklenen sonuçları analiz her nüfus için özel tanımlanmış olmalıdır.

Kan toplama ve hemoliz
Bu örnek kalite ve özellikleri zarar ve böylece analizleri kesin sonuçları değiştirmek biyolojik örneklerin önemli bir ön analitik adımı koleksiyonudur. Kan örnekleri ile ilgili taze kan toplamak ve numune mümkün olduğunca hızlı bir şekilde işlemek önemlidir. Örnekleri ne 4 ° C'de depolanan, ne de dondurma ve çözme pasajlar hücre lizis (hemoliz) ve RNA düşmesine neden olabilir beri kan çekilme sonra donmuş. Hemoliz işlemi en aza indirmek için plazma 2 saat içinde kan toplama31 ayırmak için önerilmektedir.

Hemoliz büyük ölçüde kırmızı kan hücreleri (RBCs) dağılımı ve bunun sonucunda serbest bırakmak-in çevresini içeriklerini kaynaklanmaktadır. Bu yayın RBCs hücre içi içerik önemli ölçüde kan, potansiyel olarak plazma tabanlı analiz30doğruluğunu etkileyen mikroRNA profilinde değiştirir çünkü test miRNAs dolaşan için bir sorun olabilir.

Ayrıca en az düzeyde hemoliz plazma numuneleri içinde tanımlamak için güçlü olmak miRNAs biyolojik olarak dolaşan dayalı çalışmalar için önemlidir. Hemoliz başlangıçta görsel denetim tarafından beri plazma rengi sarıdan kırmızı son derece hemolyzed örnekleri için değişebilir iki Santrifüjü adım sonra tespit edilebilir. Ancak, sadece görsel denetim moleküler biyomarker araştırma bağlamında yeterince duyarlı olmayabilir.

Hemolyzed plazma numuneleri tanımlamak için bir basit, önceden analitik dalga boyu (λ) adlı spektrofotometrik ölçüm yöntemidir 414 = herhangi bir başka kaynak girişim için uygun ayarı sonra ana oksihemoglobin tepe Absorbans nm. Bu nedenle, biz Absorbans değeri 375, 414 nm zirveye normalleştirilmiş nm, lipidik içerik33gösterge. Alternatif olarak, ya da daha iyisi, birlikte, bir lipemia-independenthemolysis Puan edinildi (HS) kullanılan34olabilir. Spectrophotometrically tabanlı bu yordam en az 6,1 mg/dL ücretsiz hemoglobin tanımlayabilirsiniz. Aksi takdirde, hemolyzed numuneler eritrosit özgü miRNAs algılanması aracılığıyla tespit edilebilir. Hemoliz bile çok düşük bir yüzdesi eritrosit özgü miRNA düzeyleri32önemli bir artış temin beri Fortunato ve ark. 16 miRNAs-verimli olabilir oranları üzerinde dayalı belirli bir hemoliz ile ilgili imza tespit hemoliz plazma örnekleri33içinde sınıflandırmak. Bahsedilen deneyleri Absorbans oranı 414/375 beri birlikte kullanılabilir ve/veya miRNAs hemoliz ile ilgili ölçme sonrası analitik bir aşamasında kalite kontrol olarak kullanılabilir, ancak HS daha fazla maliyetlerinden tasarruf önceden analitik bir aşamasında kabul edilir adım.

MiRNAs yalıtım ve RNA saflık dolaşan
Ayıklama RNA yordam sonraki analizleri başarısı için çok etkili bir adımdır. Plazma gibi düşük bir giriş örnek başlayarak çıkarma miRNAs doğru bir miktar emin olmak mümkün olduğunca verimli olması gerekiyor. Plazma nükleaz ve RT-qPCR aşağı akım enzimatik reaksiyonları ile engelleyebilir ve dolaşan miRNAs algılama etkileyebilecek diğer bileşenleri de dahil olmak üzere birçok protein yüksek konsantrasyonları ile karakterizedir. Bu tür çalışmaları birkaç çıkarma yöntemi kullanılmıştır ama genel olarak, organik ayıklama silis tabanlı RNA zenginleştirme tarafından takip plazma inhibitörleri daha iyi o zaman TRIzol yalnız35kaldırılmasını sağlar. Yine de, son birkaç yıl içinde el ile ekstraksiyon otomatik çıkarma tarafından değiştirilmiştir. Küçük riski kirlenme, daha yüksek tekrarlanabilirlik ve ekonomik kullanımda otomatik sistemler el ile yalıtım protokollere göre ana avantajı vardır. Ayrıca, otomatik çıkarma yöntemleri kan örnekleri ve el ile iletişim kuralları36için karşılaştırıldığında en yüksek verimliliği en yüksek miRNA tutarları vermiştir.

Normalleştirme sorunu
Plazma miRNA düzeyleri normalleştirme hala tartışmalı bir konudur. Nitekim, örnek kalite ya da miktarı farklılıkları miRNAs ifade düzeylerinde varlığı veya hastalıklar ve böylece belirsiz veri yorumlara önde gelen ve sonuçlar yanıltıcı riski nedeniyle gerçek değişiklikleri tanımlaması engelleyebilir. Şimdiye kadar fikir birliği olmaması çeşitli normalleştirme stratejileri37yılında sonuçlandı.

Plazma numuneleri çıkarılan toplam RNA genellikle eşik UV spectrophotometry veya spectrophotometry, Floresans tabanlı gibi standart miktar yöntemlerden böylece RNA kitle standardizasyon38iyileştirmelerden altındadır. Sonuç olarak, sabit bir tutar eluted RNA'ın yerine sabit bir birimini RT tepki39için giriş olarak seçilmelidir.

Her ikisi de her zaman dolaşımda RNase aracılı bozulması40nedeniyle algılanabilir değildir gibi doku örnekleri miRNA analizde kullanılan transkript kat Hizmetleri, RNU48 ve RNU6, gibi hücre dışı miRNA ölçümleri, normalleştirme için uygun değildir, ve ayrıca bir hastalığa özgü şekilde37deregüle. Eğer herhangi bir dolaşımdaki miRNAs etkili başvuru denetimi olarak kullanılmış belli değil. Örneğin, miR-16 sık temizlik ama d için önerilmiştirFarklı çalışmalar bu kanser hastaları28,37plazma örnekleri deregüle olduğunu göstermiştir. Ayrıca, miR-16 düzeyleri yüksek hemoliz30tarafından etkilenir.

MiRNAs sınırlı sayıda çözümlenmesi gerektiğinde yüksek üretilen iş deneyleri için birkaç miRNAs ölçme ve ortalama ifade değeri üzerinde normalize41genel olarak kabul edilmiş, iken, bu normalleştirme yaklaşım uygulanamaz. Normalleştirme sorunu atlamak için Boeri ve ark. 24 miRNAs28arasında karşılıklı oranları temel alan bir algoritma daha önce kurulmuş. Böyle bir yaklaşım çok Tanı Aracı'nı, gelişimi için yararlı olmasına rağmen kolayca etkili bir şekilde ayırt miRNAs muhtemelen tümör gelişiminde bir rol sahip ve böylece miRNAs işleyen KALİBRATÖRLER olarak tanımlayan değişmiş izin vermez. Başka bir etkili strateji geliştirilen serumu miR-sınava akciğer Kanser erken teşhis, Bianchi vd. grup tarafından kabul, geometrik ortalama 6 "temizlik serum-az örnekleri arasında değişen miRNAs" bir grup üzerinde normalize dayanıyordu ve sınıflar hastalar42.

MiRNA tabanlı sıvı biyopsi ve olası uygulama özellikleri
Plazma tabanlı MSC, ağır Sigara içenler akciğer kanserinin erken tanısı için okudu moleküler bir non-invaziv testidir. MSC test önce akciğer kanseri algılama tarafından LDCT, orta veya yüksek riskli konularda yüksek duyarlılık (SE, %87) ve negatif tahmini değer (NBD, % 99) tanımlayabilirsiniz. Özellikle, MSC LDCT tarama LDCT yalnız29%19,7 %3.7 için yanlış pozitif sonuçları azaltarak uygulamak olabilir. MSC test da tek akciğer kanserli hastalarda, göz önünde bulundurarak iyi prognostik performansa sahip göstermiştir ve izleme aracı olarak tek başına veya diğer klinik patolojik parametreler43,44ile birlikte kullanılabilir. Büyük olasılıkla, MSC test akciğer kanseri tanı algoritmalar, böylece tarama maliyet-etkililik azalan daha fazla tutarlılık sağlayabilir.

MSC yanı sıra, non-invaziv diğer testler için erken akciğer kanseri teşhis bildirilmiştir. Bianchi ve ark. Dolaşımdaki miR-Test minimum4534-miRNA imza dayalı, sonra bir 13 miRNA imza42' ye azaltılmış evlenme teklif etti. Serum örnekleri fordiscovery ve doğrulama elde sürekli gözlem, Sigara konular (COSMOS üzerinden) LDCT Avrupa kurum Onkoloji (IEO, Milan, İtalya) gerçekleştirilen deneme, eleme. MiR-Test %78 doğruluk akciğer kanser tespiti için yüksek riskli gönüllü olarak gösterdi. 13 serum miRNAs ve MSC beste 24 arasında sadece 5 miRNAs (miR-92a, miR-30b, miR - 30 c, miR-148a ve miR-140-5 p) çakışan. Bu örnekleri (serum plazma vs) başlayan farklı türü ve veri hazırlama nedeniyle olabilir. Aslında, miR-Test için Serumda, temizlik gibi davranmaya yazarlar seçilen 6 miRNAs 3 tanesi Ayrıca MSC miRNA oranları arasında (miR-15b, miR-19b ve miR-197) dahil edildi. Yine de, MSC plazma ve miR-Test serum örneklerinde daha derinden akciğer kanseri tespiti için sıvı biyopsi miRNA tabanlı kullanımını doğrulamak.

Akciğer kanseri biyolojik tanımlanması için profil oluşturma MiRNAs da balgam örnekleri46üzerinde gerçekleştirdi. Balgam kolayca toplanabilir ve miRNA ifade düzeyleri içinde son derece kararlı görünmektedir. Ancak, akciğer kanseri tarama gönüllü 50-55 yaşından büyük ve ağır Sigara içenler komorbiditeler KOAH, böylece balgam zor elde etmek için yapmak gibi ile vardır. Gerçekten de, farklı vücut sıvıları arasında plazma bir miRNAs potansiyel rolünü araştırmak için en iyi alternatifler (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) akciğer kanseri biyolojik.

Genel olarak, bugünkü gazetelerde açıklanan yordamı ile hayır sınırlama (kanser, sinir sistemi ve kalp-damar hastalıkları ya da şeker hastalığı için) üzerinden araştırıldı patoloji türü ve amacı, çeşitli hastalıklar bağlamında ilgili olabilir klinik kullanım (Tanı, prognoz veya tedaviye bile yanıt için bir biyomarker).

Disclosures

Gabriella Sozzi, Mattia Boeri ve Ugo Pastorino üç patent başvuruları ile ilgili bu makalede açıklanan miRNA imza Gensignia Yaşam Bilimleri için lisanslı yardımcı mucitler vardır. Tüm kalan yazarlar gönderilmiş iş ile ilgili olarak hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgments

Yazarlar teşekkür Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, ve Chiara Banfi işleme için çalışmalarda ve idari yardım için gönüllü; ve Claudio Jacomelli ve Claudio Citterio veri yönetimi için. İş kanser araştırmaları için İtalyan Derneği tarafından desteklenen [araştırmacı hibe Hayır 15928 UP, 14318 olarak GS ve 12162 (Özel Program Kanser Risk değerlendirmesi ve erken tanı "yenilikçi araçları", 5 x 1000)]; İtalyan Sağlık Bakanlığı [Grant No RF-2010]; UO1 CA166905 Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (ABD) verin. MB Fondazione Pezcoller arkadaş grubu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202, (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365, (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63, (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3, (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6, (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105, (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22, (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10, (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4, (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11, (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28, (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15, (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18, (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12, (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38, (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15, (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11, (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362, (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32, (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5, (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19, (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6, (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14, (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37, (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61, (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10, (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50, (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7, (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10, (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19, (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20, (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3, (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17, (4), 494 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics