حجم كبير، الإضاءة ذات الصلة سلوكيا أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويرد وضع بروتوكول لبناء إضاءة اختراق أنسجة لإيصال الضوء على كميات كبيرة مع الحد الأدنى من القطر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول إضاءة الحجم الكبير، الذي تم تطويره للتلاعب أوبتوجينيتيك في الدماغ الرئيسيات غير البشرية. هو إضاءة ألياف الضوئية بلاستيكية معدلة مع تلميح محفوراً، مثل أن يكون الضوء التي تنبعث منها مساحة السطح > 100 × من الألياف التقليدية. هذا البروتوكول بالإضافة إلى وصف بناء إضاءة كبيرة الحجم، تفاصيل معايرة مراقبة النوعية المستخدمة لضمان التوزيع حتى الخفيفة. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول تقنيات لإدراج وإزالة إضاءة الحجم الكبير. قد تكون مضيئة هياكل كل سطحية وعميقة. إضاءة هذا الحجم الكبير لا تحتاج إلى يكون جسديا بالإضافة قطب، ونظرا لأن إضاءة مصنوعة من البلاستيك، ولا من الزجاج، سوف ببساطة ينحني في الظروف عندما سوف تتحطم الألياف الضوئية التقليدية. لأن يسلم هذا إضاءة الضوء على مدى حجم الأنسجة سلوكيا ذات الصلة (≈ 10 ملم3) مع لا ضرر اختراق أكبر من ألياف الضوئية تقليدية، ويسهل الدراسات السلوكية باستخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية.

Introduction

أدوات أوبتوجينيتيك، والتي تسمح بتحكم العصبية دقة ميلي ثانية واحدة، ويحركها الضوء تستخدم على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا الوظيفية والسلوك في القوارض واللافقاريات. ومع ذلك، محدودة التحديات التقنية استخدام أوبتوجينيتيكس في الدماغ الرئيسيات غير البشرية، والتي لديها وحدة تخزين ~ 100 × أكبر من الدماغ القوارض 1.

لتسهيل الدراسات أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية، صمم إضاءة لمعالجة الأهداف المتنافسة اثنين: كبر حجم الإضاءة واختراق أدنى ضرر. أن يأتي المحاولات السابقة لمعالجة أحد هذه الشواغل في تكلفة من الآخر. حزم من ألياف تضيء كميات أكبر ولكن مع زيادة القطر، ومن ثم الأضرار2،3. ألياف زجاجية مدبب تقليل أضرار الاختراق، لكن التركيز الضيق للضوء التي تنبعث منها المساحات السطحية < 100 ميكرومتر2 4،5. الإضاءة الخارجية الدماغ من خلال نافذة في دوراً تلتف التحدي المتمثل في الإيلاج الضرر ويجوز السماح لإنارة الحجم الكبير، ولكن يمكن استخدامه فقط ل مناطق الدماغ سطحية قليلة6.

لإنشاء إضاءة قطرها كبير الحجم والصغيرة (الشكل 1a)، حفرت غيض من البلاستيك البصرية الألياف هي الحرارة مدبب والكسوة وجوهر (الشكل 1، ج). خلافا لألياف مدبب أخرى أن يركز الضوء على نقطة ضيقة، يسمح النقش الخفيف للهروب بالتساوي على الجانبين من الطرف، ومن ثم، توزيع الضوء على نطاق واسع على مساحة كبيرة (الشكل 1 دوه). لأن أضرار الاختراق غير متناسب إلى القطر الاختراق، وإضاءة هذا لا أكثر ضررا من الاختراق من ألياف تقليدية، بعد فقد > 100 × الضوء التي ينبعث منها الضوء سطح المنطقة ويسلم على نطاق أوسع مع 1/100 سلطة خفيفة كثافة في دماغ وهمية (1.75% [اغروس]) (الشكل 1e). نموذج مونت كارلو (الشكل 1f) يوضح الفرق في ضوء انتشار بين ألياف تقليدية وإضاءة الحجم الكبير عندما يكون لديهم كثافات الطاقة الضوء متساوية كالضوء على انبعاث السطوح. يتم معايرة إضاءة كل على حدة استخدام مجالاً إدماج (الشكل 2 أ، ب) لضمان توزيع الضوء حتى على طول الحافة (الشكل 2 (ج)).

تم التحقق من هذا الحجم الكبير إضاءة مع التلاعب أوبتوجينيتيك السلوك وإطلاق الخلايا العصبية في المقدمات غير البشرية. يمكن تخصيص طول الألياف تلميح إلى أي منطقة في الدماغ، وإلى تعيين الحقل تقبلا الفردية كل الحيوانات. إضاءة يجوز أن يقترن قطب المخترقة لتسجيلات الخلايا العصبية التي تمتد على طول الإضاءة. علاوة على ذلك، نظراً لأنه يمكن أن تحمل هذه الألياف أي لون من الضوء المرئي، فإنه يمكن إقران مع أي من جزيئات أوبتوجينيتيك المتاحة المتوفرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوان تم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة، وقد أقر "معهد ماساشوستس للجنة التكنولوجيا" في "العناية بالحيوان".

1-"تصنيع إضاءة"

  1. استخدام زوج من مقص حاد لقص مقطع من 250 ميكرون القطر البلاستيك الألياف الضوئية التي أطول من الطول المطلوب إضاءة إجمالي 10 سم على الأقل-
  2. إزالة 15-20 سم من البولي إيثيلين سترة من نهاية واحد من الألياف الضوئية البلاستيكية باستخدام قياس 22 سلك متجرد.
  3. آمنة القاصي معظم 3-5 سم من نهاية جردت من الألياف في المشبك القبضة جدول-
  4. عقد نهاية الألياف تغلف مشدود في يد واحدة مع سحب مطرد مستمر. الألياف بشكل مواز للكلمة، عمودي على نائب. الحفاظ على هذا التوتر المستمر على هذه الألياف في جميع أنحاء التدفئة والتبريد (خطوات 1.5 و 1.6 أدناه) حيث أن الألياف لا يزال مستقيم ومشدود كما أنه يخفف.
  5. استخدام إعداد أقل من بندقية الحرارة درجة الحرارة المزدوجة (570/1,000 درجة فهرنهايت،)، حرارة المقطع جردت من الألياف حتى أنه هو ضعفت إلى قطر من 60-100 ميكرومتر، أو حول قطر شعر الإنسان.
  6. الحفاظ على التوتر المستمر على هذه الألياف بينما يسمح للألياف لتبرد. قد يؤدي الفشل في الحفاظ على التوتر الألياف تجعيد.
  7. وتؤكد
  8. قطر طرف ضعفت تحت مجهر تشريح. بدلاً من ذلك، واحد قد استخدم الفرجار بدلاً من ذلك.
    1. إذا لم تكن الألياف رقيقة ما يكفي، كرر الخطوات من 1.4 عن طريق 1.6 حسب الحاجة لتحقيق قطر تلميح المطلوب.
    2. اختياري إذا كان إعادة سحب، وضع علامة صغيرة في الجزء أضيق من الألياف إذا كان سيتم تسخينها مرة أخرى حيث أن مركز البندقية الحرارة ويستهدف الجزء أضيق من الألياف.
    3. في حالة ضعيفة جداً الألياف، البدء من جديد-
  9. مرة واحدة كاملة قد بردت الألياف والقطر المطلوب قد تحقق، قرصه الألياف سم 3 من أضيق نقطة في أي من الجانبين. سريعة، حادة سحب على طول محور الألياف، وفصل الجانبين لإنشاء تلميح مدبب.
  10. دراسة طرف مدبب تحت سلطة منخفضة (مثلاً، 4 س) على مجهر التشريح. إذا كان التلميح متشعب أو كرة لولبية ( الشكل 1f)، تجاهل الألياف.
  11. التحضير أحفر طرف مدبب بوضع قطعة من الشريط مختبر قرب نهاية غيض، تاركة الماضي 5 مم مكشوف. الشريط يحمي الألياف من النقش أعلاه الطول المطلوب لانبعاث الضوء. واختير هذا الطول تلميح استناداً إلى سمك القشرة الرئيسيات في المنطقة المستهدفة. يمكن أن يتعرض مدة أطول أو أقصر حسب الطول المطلوب للإضاءة. إذا كان المطلوب هو بطول الحافة أحفر مختلفة، يمكن نقل حافة الشريط مختبر أقرب إلى أو أبعد من طرف مدبب.
  12. إضعاف ساحة صغيرة (~ 1 بوصة × 2 بوصة) من 5 ميكرومترات كربيد السيليكون ورقة اللف بين الإبهام والسبابة. ضع غيض الألياف بين الجانبين ورقة اللف ولطف أحفر الألياف استخدام الاقتراحات دائرية صغيرة، كما لو كان المتداول من BB بين الإبهام والسبابة. وكثيراً ما تدوير الألياف حيث أن جميع الأطراف هي محفوراً بالتساوي. وسوف يظهر تلميح الألياف “ خشن ” بالعين المجردة في المناطق التي قد تم محفوراً، بينما المناطق المحفورة الأمم المتحدة عادة ما تظهر متجانسة.
  13. كرر الخطوة 1.11 بأكسيد ألومنيوم 3 ميكرومتر اللف ورقة-
  14. إلصاق رابط في نهاية إضاءة مقابل تلميح محفوراً. وهذا ما يسمح إضاءة الاتصال بالكابل الضوئي أو الليزر-
    ملاحظة: هذا الأسلوب يختلف عن الأسلوب المفضل لتحديد الزجاج/الألياف البصرية السليكا في الحلقات, و. لأن التسليح المعدني هو أصعب من الألياف الضوئية البلاستيكية، التلميع في الألياف والتسليح كوحدة بعد الالتصاق يمكن أن تتلف الألياف الضوئية البلاستيكية كشظايا صغيرة من المعادن التي تنتج أثناء عملية الصقل يمكن تضمين أنفسهم في الألياف المشقوق مسطحة.
    1. إزالة حوالي 5 مم من البولي إيثيلين والسترة من الجهة المقابلة لإضاءة استخدام متجرد أسلاك قياس 22-
    2. قص الطرف الآخر شقة بسكين ساخنة لضمان سلاسة السطح.
    3. البولندية على الطرف الآخر شقة مع اللف أدق تباعا أوراق: 5 ميكرومتر، 3 ميكرومتر، 1 ميكرومتر و 0.3 ميكرومتر.
    4. إدراج الشقة مقابل نهاية في التسليح فولاذ المقاوم للصدأ قطرها داخلي ميكرومتر 260 حتى يتم تدفق مع نهاية التسليح.
    5. بصريا تأكيد مصقول الطرف الآخر هو بسلاسة وبشكل متساو مع مجهر ألياف.
    6. إزالة الألياف من التسليح والشريط التسليح رأسياً على حافة جدول مع الألياف مشيراً إلى أسفل.
    7. ملء حقنه 1 مل الإيبوكسي البلاستيك وإرفاقه حقنه إبرة قياس 18 كليلة.
    8. استخدام الإبرة لتطبيق الإيبوكسي أسفل إلى التسليح. ملء التسليح تماما مع الإيبوكسي.
    9. إدراج الألياف التسليح.
    10. يمسح أي الإيبوكسي الزائد من سطح مصقول من الألياف مع مسح خالية من الوبر رطبة قبل التجفيف إذا لزم الأمر. خلاف ذلك، يمكن إزالة الزائدة الإيبوكسي بعد 12-24 h.
    11. تخزين الألياف بلطف حتى المعايرة ووضع غطاء غبار أكثر التسليح.

2. إضاءة المعايرة ومراقبة الجودة

ملاحظة: تقييم هذه الأساليب للمعايرة للضوء الناتج غير الخطي على مسافات مختلفة من غيض الألياف. التفاوت في توزيع الضوء ينتج عادة عن “ وعرة ” أو “ مموج ” تفتق.

  1. إنشاء الخفيفة التدريع الحجاب الحاجز للأعلى من استخدام المجال دمج امتصاص الضوء إحباط ( الشكل 2).
    ملاحظة: ارتداء قفازات كلما الزيوت الخفيفة مناولة تستوعب إحباط لمنع الجلد من خلق البقع التي تعكس الضوء.
    1. طي أ 2 ” 4 ” قطعة من الضوء امتصاص إحباط أكثر على نفسها لتشكيل 2 ” x 2 ” ساحة. أسلوب بديل قطع 2 ” x 2 ” ساحة مع ضوء واحد على استيعاب الجانب ويعكس الجانب (أي واحد من الضوء ، جانب من رقائق الألومنيوم القياسية)؛ بيد أن الأسلوب أكثر من إضعاف أكثر أماناً لأنها توفر ميزة ممل للتعامل مع الحجاب الحاجز في الخطوة القادمة.
    2. أمثال مختبر الشريط أو الشريط الكهربائي على طول حواف المربع لربط الحواف غير مطوية. وهذا يحمل الجانبين معا ويحمي ضد التخفيضات من حواف حادة.
    3. ثقب حفرة في وسط ساحة استخدام إبرة قياس 26-
    4. إزالة المسمار كبير على الحد الأقصى من المجال دمج
    5. وتغطية الافتتاح مع الحجاب الحاجز. مكان الثقب أكثر من المركز. إذا تم إنشاء الحاجز مع أحد تمتص الضوء ويعكس الجانب الضوء واحد، وضع في ضوء استيعاب الجانب حتى والضوء الذي يعكس الجانب الأسفل، تواجه داخل مجال إدماج.
      ملاحظة: لمنع الغبار والحطام من دخول مجال التكامل، وللحفاظ على حفرة توسيط، تأمين الحجاب الحاجز إلى خارج مجال التكامل مع معمل الشريط.
  2. قياس الضوء الناتج على طول نصيحة 500 ميكرومتر زيادات استخدام ميكرومانيبولاتور أو ستيريوتاكسيك الذراع ومجال تكامل-
    ملاحظة: يجب أن تلبس نظارات واقية من الطول الموجي المناسب كلما كان الليزر على.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من الألياف بالليزر أو الضوء المصدر، ولكن لا يؤدي الضوء الناتج بعد.
    2. تأمين إضاءة إلى حامل ستيريوتاكسيك (بريفرابلي مع مختبر الشريط) مع تلميح 7-10 ملم أسفل الجزء السفلي من الحامل.
    3. برغي صاحب ستيريوتاكسيك في arm. ستيريوتاكسيك
    4. محاذاة غيض إضاءة مع الثقب في وسط الحجاب الحاجز. صفر في ميكرومانيبولاتور عند الحافة الضبط نفس مستوى الحجاب الحاجز.
    5. بدوره قبالة الأنوار الغرفة وصفر في مجال إدماج.
    6. تشغيل الليزر (أو أخرى مصدر الضوء) وقياس قوة الضوء الإجمالي الإخراج باستخدام مجال التكامل-
      ملاحظة: استخدام إخراج الخفيفة أدنى إمكانية لاختبار المعايرة.
    7. السفلي الألياف 500 ميكرومتر إلى دمج المجال وكرر الخطوة 2.2.6.
    8. مواصلة خفض هذه الألياف في مجال إدماج وقياس مجموع ناتج الضوء في 500 ميكرومتر زيادات حتى الجميع مستويات إجمالي طاقة الضوء
      تنبيه: أن مستوى إجمالي طاقة الضوء بمجرد طرف كامل في المجال. عدم الاستمرار في انخفاض الألياف تلميح أكثر من 1-2 مم خارج محفوراً طول. إذا اتصل نصيحة الجزء السفلي من مجال التكامل، فإنه قد تذوب و/أو الخراب في مجال إدماج.
  3. تأكيد ألياف محفوراً بالتساوي برسم إجمالي طاقة الضوء الناتج كما خفضت دالة من مدى الألياف في مجال إدماج لتأكيد الخطي.

3-الإضاءة في فيفو

ملاحظة: هنا، تظهر هذه الأساليب باستخدام نموذج بلاستيك بدلاً من الرئيسيات غير البشرية-

  1. زرع كان مزروع دائرة تسجيل قطرها 25 ملم عبر منطقة الدماغ للفائدة قبل التجريب.
  2. أداء التشريحية التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) قبل التجريب. وضع شبكة تسجيل مخصص في الدائرة وملئه مع زيوت التشحيم الجراحية المعقمة للسماح للتصور الشبكة وتحديد مستوى هياكل الدماغ دوراً والهدف-
  3. إعداد
  4. الصغرى برج محرك أقراص قبل كل جلسة الاختبار.
    1. افكس المشابك أنبوب دليل قياس 25 مع تلميح مشطوف الحواف للوسط وأقل على محرك الأقراص. وتستخدم المشابك اثنين لضمان بقاء الأنبوب دليل على التوالي. كل من هذه المشابك يمكن نقل يدوياً إذا رغبت.
      ملاحظة: يمكن epoxied أنبوب دليل أو ملحوم المشابك.
    2. تأمين إضاءة الحجم الكبير في المشبك العلوي على محرك الأقراص نفسه. هذا المشبك موصولة إلى محرك أقراص-
    3. الموضوع إضاءة كبيرة الحجم من خلال أنبوب الدليل الكامل وتأكيد أن تلميح إضاءة يمتد غيض أنبوب الدليل.
      ملاحظة: تحديد طول إضاءة يمتد الماضي غيض أنبوب دليل يساوي المسافة من دوراً إلى الهامش السفلي لمنطقة الدماغ المستهدف، كما عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي-
    4. نقع في أنبوب الدليل وإضاءة في محلول مطهر (مثلاً، تشلوروهيكسيديني) لتعقيم.
  5. وضع شبكة معقمة مخصصة داخل غرفة نظيفة وتأمينه في اتجاه محدد مسبقاً مع المسمار على جانب الدائرة. الشبكة المعروضة هنا قد تباعد 1 مم؛ ومع ذلك، يمكن تخصيص التباعد حسب الحاجة.
    ملاحظة: وهذا ينبغي أن تكون مطابقة للشبكة واتجاه المستخدمة في الرنين المغناطيسي التشريحية.
  6. تأمين صاحب السيارة الصغيرة المناظير باستخدام الأشعة في قاعة التسجيل في اتجاه محدد سلفا-
  7. سحب
  8. إضاءة معقمة من أنبوب الدليل عن طريق سحب إضاءة حتى باستخدام الملقط عقيمة، وغير حادة. ينبغي أن يكون غيض إضاءة 5-10 مم أعلاه غيض أنبوب الدليل.
    ملاحظة: سوف تذعن إضاءة إلى الخارج بين أنبوب الدليل والمشبك. وهذا لا ضرر إضاءة مرنة.
  9. إلصاق الصغرى-محرك الأقراص إلى الحامل ووضع أنبوب الدليل في حفرة الشبكة المستهدفة.
  10. أقل في المرحلة الدقيقة-محرك الأقراص حتى أنبوب الدليل فقط من خلال مستوى بلده دوراً-
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن محرك أقراص صغيرة ثاني مع قطب كهربائي وضعها على الساحة وخفضت في حفرة شبكة مختلفة. سيعرض الحقل المحلية المحتملة على هذا القطب قطعة أثرية خفيفة تعتمد على المسافة، التي يمكن استخدامها لتأكيد وضع إضاءة.
  11. محاولة السفلي إضاءة يدوياً مع الملقط العقيمة.
    1. إذا لم يكن هناك أي مقاومة، تتراجع إضاءة 5-10 مم، انتظر 10 دقائق للسماح للأنسجة لتسوية وحاول مرة أخرى.
    2. إذا كانت لا تزال هناك مقاومة في المحاولة الثانية، سحب الحافة إضاءة في دليل أنبوب، أدنى الدليل أنبوب 0.25 مم، ثم حاول مرة أخرى.
    3. كرر حتى الشرائح إضاءة من خلال أنبوب دليل دون أي مقاومة.
    4. أقل إضاءة حتى ومشدود.
      تنبيه: لا تدفع إضاءة كل قوة ضد المقاومة. في هذه الحالات أنبوب دليل عادة قد لا اخترقت دوراً الكامل. دفع الألياف قوة يؤدي إلى ثني على نفسه، منع هذه الألياف من دخول المخ وربما تدمير التلميح ( الشكل 1 ز)-
  12. الاتصال التسليح في النهاية الأخرى لإضاءة بالبصريات أكبر إعداد أو ليزر.
  13. التأكد من أن أي ضوء مرئياً للرئيسيات غير البشرية.
    1. استخدام التدريع تعتيم أو الضوء على استيعاب إحباط ليشمل كامل أبراج التسجيل-
    2. بوضع كافة الاتصالات البصرية في مغلفات محمية من الضوء امتصاص إحباط.
    3. درع جميع كابلات التصحيح مع الضوء أما امتصاص إحباط أو الأشرطة الكهربائية أسود.
    4. كإجراء وقائي إضافي، وضع بنك أدى (الصمام) شرك من نفس اللون الخفيفة المستخدمة في التجربة وراء الرئيسيات غير البشرية وفلاش المصابيح باستمرار في 2.5 هرتز. وهذا يمنع العيون يتكيف تماما مع الظلام. إذا كان هناك تسرب الضوء غير مقصود، وميض هذا سيساعد على منع التسرب من العمل كمشغل سلوكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإضاءة لكميات كبيرة من الدماغ في المقدمات غير البشرية يسمح للتلاعب أوبتوجينيتيك سلوكيا ذات الصلة. أكر et al. (2016) تستخدم إضاءة هذا الحجم الكبير مع تحول الأحمر هالورهودوبسين، جوز 7 لدراسة مساهمة الزمانية الحقل العين أمامي (فف) الموجهة بالذاكرة ساككاديس في اثنين من القردة الريسوسي. على وجه التحديد، تم حقن مع ناقل فيروسية التي تحتوي على جوز فف الخلايا العصبية ومضيئة ثم مع استخدام إضاءة الحجم الكبير أثناء عرض الهدف أو فترة التأخير، أو فترة إعداد السيارات مهمة saccade الموجهة بذاكرة الضوء الأحمر 8-ويبين الشكل 3 شروط التجربة. معدلات الخطأ (مثلاً، فشل لتنفيذ ساككاديس الموجهة بالذاكرة إلى الموقع الهدف السليم) زيادة كبيرة مع الإضاءة للأهداف في ميدان تقبلا حقن، لكن ليس لأهداف مقابل موقع المنظمة/الإضاءة (الشكل 4 أ).

بالإضافة إلى التغييرات السلوكية الناجمة عن أوبتوجينيتيكس، إضاءة كبيرة الحجم المسموح به للمنظمة من الخلايا العصبية على امتداد كامل 2.5 ملم اللحاء (الشكل 4 ج) وتسليم الخفيفة أكثر من 4.5 مم (الشكل 4 باء)، كما يدل على ذلك المستحثة بصريا الميدانية المحلية المحتملة قطعة أثرية 8.

Figure 1
الشكل 1 . إضاءة الحجم الكبير وتوزع على نطاق واسع الضوء
) واجهة كم/إضاءة الألياف البصرية/التزاوج. ب) الأساسية اتشيد والكسوة انتشار الضوء على نطاق واسع. ج) التي ينبعث منها الضوء 5 مم طوله محفوراً تلميح. د) الأشكال مقارنة لنصيحة لألياف تقليدية وإضاءة حجم كبير. ه) إضاءة والألياف الضوئية التقليدية مع تساوي مجموع القوى الخفيفة الإدخال في 1 "مكعب الدماغ الوهمية (أجار 1.75 في المائة). و) شقة نماذج مونتي كارلو قسم الصليب الأوسط إضاءة كبيرة الحجم بطول الحافة 3 مم (يسار) واتفاقية الألياف ملصوق من قطر متساوية مع كثافة الطاقة الضوء متساوية على ضوء تلك التي تنبعث منها السطوح. راجع أساليب تكميلية من أكر et al.، 2016 للاطلاع على تفاصيل هذا النموذج. ز) عيب إضاءة كبيرة الحجم مع تلميح الكروشيه. ح) نصيحة إضاءة كبيرة الحجم المتضررة الخارجة من أنبوب الدليل. تم تعديل هذا الرقم وطبعها في جزء من أكر et al.، 2016 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . معايرة إضاءة الحجم الكبير
وهذا الرقم هو طبع من أكر et al.، 2016 مع تعديلات طفيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . مهمة Saccade تسترشد الذاكرة مع الإضاءة أو الشام في أوقات مختلفة.
وهذا الرقم هو طبع من أكر et al.، 2016 8الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . الآثار السلوكية والكهربية لتثبيط أوبتوجينيتيك مع كبر حجم الإضاءة
) زادت معدلات الخطأ إلى حد كبير مع الإضاءة. ب) المؤامرات نقطية لعرض تثبيط الخلايا العصبية التي تغطي 2.5 ملم سمك القشرة. ج) الميدانية المحلية إمكانية عرض قطعة أثرية خفيفة التي تغطي 4، 5 مم. ل ب) و ج)، جهات الاتصال 0.5 مم متباعدة عن بعضها البعض على مدى عمق القشرة، n = 426 المحاكمات. هذا الرقم هو تكييف وطبعها من أكر et al.، 20168الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما أوبتوجينيتيك أدوات تستخدم على نطاق واسع لدراسة الأمراض وعلم وظائف الأعضاء في القوارض، التحدي التقني منيرا الدماغ الكبيرة كميات محدودة استخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية. رائد الدراسات في القرود تستخدم كثافات الطاقة الخفيفة الكبيرة (~ 100 ميغاواط/مم2 إلى 20 واط/م2) لإلقاء الضوء على الكميات الصغيرة، وربما < 1 ملم3، والإبلاغ عن الآثار السلوكية متواضعة مع أوبسينس عليه في قشرة4، 9،،من1011 و opsin مثبطة في والاكيميه متفوقة12.

ولذلك، وضعت إضاءة كبيرة الحجم للسماح بإيصال الضوء إلى كميات كبيرة من الأنسجة. مع هذا إضاءة وتحول الأحمر هالورهودوبسين، جوز، قوية، أوبتوجينيتيكالي-محرك السلوك قد لوحظ في الرئيسيات غير البشرية8.

ويمكن تغيير البروتوكول الموصوفة هنا تبعاً لغرض التجربة والهندسة لمنطقة الأنسجة المستهدفة. على سبيل المثال، يمكن أن تطول تلميح محفوراً من الألياف أو تقصيرها تبعاً لحجم المنطقة لتكون مضيئة. يمكن سحب الحافة مع تلميح أكثر سمكا من وصفها أو ألياف قطر أكبر يمكن استخدامها لإنشاء إضاءة أكثر قوة. بينما يصف هذا البروتوكول نصيحة ألياف محفوراً، أنه من الممكن أن أحفر الألياف في التلميح وفي شريحة القاصي أكثر للإضاءة غير متجاورة.

ضوابط مراقبة الجودة جزء أساسي من هذا البروتوكول. يمكن أن تصبح متشعب غيض من إضاءة الحجم الكبير أو كرة لولبية (الشكل 1 ز)، لا سيما إذا كان تالفاً ميكانيكيا أو إذا كان يتم سحبها من رقيقة جداً في البداية. لسحب الألياف مع كمية مناسبة من قوة دائماً، تحتاج معظم المجربون بضع ساعات من الممارسة. نظراً لأن التكلفة المنخفضة لصنع ألياف (الألياف الضوئية البلاستيكية توصي بتكاليف أقل من 0.03 دولار/متر)، المجربون العديد من إلا يضعوا الألياف مع نصائح مثالية للحلقات, و، وتجاهل ذلك، 30 في المائة على الأقل من الألياف لعيوب طفيفة تلميح. يمكن تصحيح التفاوت في توزيع الضوء اكتشفت أثناء المعايرة بواسطة إعادة تلميع نصيحة الألياف وإعادة معايرة الألياف.

علاوة على ذلك، يجب التحقق من تلميح إضاءة بعد كل تجربة. إذا كانت قوات المجرب إضاءة من خلال أنبوب الدليل قبل أنبوب دليل قد توغلت في بلده دوراً، سوف ينحني إضاءة مرة أخرى على نفسها وأنها لن تدخل في الدماغ. عادة، يتم إتلاف نصيحة إضاءة في هذه الحالات (ح الشكل 1). وبصرف النظر عن المقاومة لإضاءة الإدراج، كمجال المحلية المحتملة الاختيار في التجربة للموضع الصحيح إضاءة. إذا كانت عازمة إضاءة يصل أعلاه دوراً، لن تظهر الميدانية المحلية المحتملة المميزة قطعة أثرية الخفيفة، هو بمثابة شيك للموضع إضاءة مناسبة أثناء التجربة.

بينما إضاءة حجم كبير يهدف إلى إيصال الضوء للطبقات القشرية متعددة في نفس الوقت، أنها ليست مناسبة تماما لإلقاء الضوء على الطبقات القشرية أكثر سطحية بينما تدخر طبقات أعمق، أو لإلقاء الضوء على طبقة واحدة من القشرة على حدة. إذا كان المطلوب هو إنارة محددة جداً مكانياً، الألياف الغذائية التقليدية التي تركز الضوء أكثر ضيقاً أو سطحية الإضاءة من خلال النوافذ في بلده دوراً 6 قد يكون أكثر ملاءمة. علاوة على ذلك، هو مرونة إضاءة كبيرة الحجم ميزة والقيد. خلافا للألياف البصرية الزجاجية، لا يمكن أن تتحطم هذه إضاءة في أنسجة المخ، غير أن هذه المرونة أيضا يجعل من الصعب النهوض إضاءة على مسافة القشرية كبيرة (مثلاً، 10 مم أو أكثر). ولذلك، سيلزم أنبوب دليل لاستهداف بنية الدماغ عميقة جداً (مثلاً، هوز)، تكون متقدمة في الماضي في بلده دوراً وفي أنسجة المخ لتوفير تعزيزات ميكانيكية إضافية.

وعموما، يقدم هذا الأسلوب ميزة كبيرة على الأساليب السابقة لأنه يسمح بالإضاءة لوحدات التخزين ذات الصلة سلوكيا الدماغ في المقدمات غير البشرية، مفتاح تكييف أوبتوجينيتيكس للدراسات الرئيسيات غير البشرية. في حين قد تبين هذا الأسلوب في فف قرود الريص، أنها ستعمل في العديد من المجالات الأخرى في الدماغ، وحتى في الدماغ كبيرة وبالمثل الأنواع الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgements

وتسلم LCA التمويل من زمالة ندسيج، جرفب جبهة الخلاص الوطني، وأصدقاء المعهد ماكغفرن. وتسلم الجيش الشعبي التمويل يونيس نورا آروب صندوق، فئة الصندوق آروب عام 1995 معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، هاري والصندوق آروب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. حساب الضمان باء تعترف بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة 2R44NS070453-03A1، بجائزة هارفي "الاتجار الدولي في الانبعاثات"، وجائزة مؤسسة روبرتسون الخلايا الجذعية في نيويورك. وتسلم RD التمويل من EY017292 المعاهد الوطنية للصحة. مايكل وليامز ساعد الفريق على تنظيم وجمع اللوازم قبل التصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1,000 °F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211, (1), 49-57 (2012).
  3. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, (3), 387-397 (2011).
  4. Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24, (1), 63-69 (2014).
  5. Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219, (1), 142-154 (2013).
  6. Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110, (6), 1455-1467 (2013).
  7. Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17, (8), 1123-1129 (2014).
  8. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (46), 7297-7306 (2016).
  9. Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15, (10), 1368-1370 (2012).
  10. Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22, (18), 1722-1726 (2012).
  11. Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33, (42), 16684-16697 (2013).
  12. Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76, (5), 901-907 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics