बड़ी मात्रा, व्यवहार-गैर मानव रहनुमाओं में Optogenetics के लिए प्रासंगिक रोशनी

Behavior

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Summary

एक प्रोटोकॉल ंयूनतम व्यास के साथ बड़ी मात्रा में प्रकाश देने के लिए एक ऊतक मर्मज्ञ प्रकाशक का निर्माण करने के लिए प्रस्तुत किया है ।

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Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक बड़ी मात्रा प्रकाशक, जो गैर में optogenetic जोड़तोड़ के लिए विकसित किया गया था मानव रहनुमा मस्तिष्क । प्रकाशक एक संशोधित प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर के साथ धंसा टिप, कि प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्र है & #62; 100x कि एक पारंपरिक फाइबर की. बड़ी मात्रा में प्रकाशक के निर्माण का वर्णन करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल विवरण गुणवत्ता नियंत्रण अंशांकन भी प्रकाश वितरण सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा प्रकाशक को संमिलित करने और निकालने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है । सतही और गहरी दोनों संरचनाओं को रोशन किया जा सकता है । यह बड़ी मात्रा प्रकाशक शारीरिक रूप से एक इलेक्ट्रोड करने के लिए युग्मित होने की जरूरत नहीं है, और क्योंकि प्रकाशक प्लास्टिक से बना है, कांच नहीं, यह बस परिस्थितियों में झुकना होगा जब पारंपरिक ऑप्टिकल फाइबर टूट जाएगा. क्योंकि इस प्रकाशक के व्यवहार पर प्रकाश उद्धार-प्रासंगिक ऊतक संस्करणों (≈ 10 mm3) एक पारंपरिक ऑप्टिकल फाइबर की तुलना में कोई बड़ा प्रवेश क्षति के साथ, यह व्यवहार गैर मानव रहनुमाओं में optogenetics का उपयोग कर अध्ययन की सुविधा ।

Introduction

Optogenetic उपकरण, जो मिलीसेकंड के लिए अनुमति देते हैं-सटीक, प्रकाश चालित न्यूरॉन्स नियंत्रण व्यापक रूप से कुतर और अकशेरूकीय में कार्यात्मक फिजियोलॉजी और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, तकनीकी चुनौतियों गैर मानव रहनुमा मस्तिष्क में optogenetics का उपयोग सीमित है, जो एक मात्रा ~ 100x कुतर मस्तिष्क से बड़ा है 1

गैर-मानव रहनुमाओं में optogenetics अध्ययन की सुविधा के लिए, एक प्रकाशक को दो प्रतिस्पर्धी लक्ष्यों को पता करने के लिए डिज़ाइन किया गया था: बड़ी मात्रा में रोशनी और न्यूनतम प्रवेश क्षति । पिछले एक इन चिंताओं का पता करने का प्रयास दूसरे के महंगे पर आ गए हैं । फाइबर के बंडलों बड़ी मात्रा में प्रबुद्ध लेकिन वृद्धि व्यास के साथ, और, इस प्रकार, नुकसान2,3. पतला ग्लास फाइबर प्रवेश क्षति को कम, लेकिन संकीर्ण रूप से प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्रों के लिए प्रकाश फोकस & #60; १०० µm2 4,5. बाडी में एक खिड़की के माध्यम से बाह्य मस्तिष्क रोशनी प्रवेश क्षति की चुनौती को दरकिनार और बड़ी मात्रा रोशनी के लिए अनुमति दे सकते हैं, लेकिन यह केवल कुछ सतही मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है6

एक बड़ी मात्रा, छोटे व्यास प्रकाशक (चित्र 1a) बनाने के लिए, एक प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर की नोक गर्मी पतला है और कोर और cladding (चित्रा 1b, सी) धंसा रहे हैं । अंय पतला फाइबर कि एक संकीर्ण बिंदु पर प्रकाश ध्यान केंद्रित के विपरीत, नक़्क़ाशी प्रकाश समान रूप से बाहर टिप के पक्षों से बचने के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार, प्रकाश वितरण मोटे तौर पर एक बड़े क्षेत्र पर (चित्र 1 d, e) । क्योंकि प्रवेश नुकसान प्रवेश व्यास के लिए आनुपातिक है, इस प्रकाशक एक पारंपरिक फाइबर की तुलना में अधिक पैठ नुकसान नहीं है, अभी तक यह & #62 है; 100x प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्र और प्रकाश बचाता है और अधिक मोटे तौर पर 1/ एक मस्तिष्क प्रेत (१.७५% agarose) (चित्रा 1e) में घनत्व । एक मोंटे कार्लो मॉडल (चित्रा 1f) एक पारंपरिक फाइबर और बड़ी मात्रा प्रकाशक के बीच प्रकाश प्रसार में अंतर दिखाता है जब वे अपने हल्के उत्सर्जन सतहों के रूप में बराबर प्रकाश शक्ति घनत्व है । प्रत्येक प्रकाशक व्यक्तिगत रूप से (चित्रा 2c) टिप के साथ भी प्रकाश वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक एकीकृत क्षेत्र (चित्रा 2a, बी) का उपयोग करने पर तुले हुए है ।

इस बड़े वॉल्यूम प्रकाशक दोनों व्यवहार और गैर-मानव रहनुमाओं में न्यूरॉन फायरिंग के optogenetic हेरफेर के साथ मान्य किया गया है । फाइबर टिप लंबाई किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र के लिए और प्रत्येक जानवर के व्यक्तिगत ग्रहणशील क्षेत्र के नक्शे के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रकाशक है कि रोशनी की लंबाई अवधि के लिए एक मर्मज्ञ इलेक्ट्रोड के साथ जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, क्योंकि फाइबर दृश्य प्रकाश के किसी भी रंग ले जा सकते हैं, यह उपलब्ध optogenetic अणुओं में से किसी के साथ जोड़ा जा सकता है उपलब्ध है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं को NIH दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी कमेटी द्वारा पशु देखभाल पर अनुमोदित किए गए थे ।

< p class = "jove_title" > 1. प्रकाशक निर्माण

  1. तेज कतरनों की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए २५० & #181 के एक वर्ग में कटौती; एम व्यास प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर कि कम 10 सेमी वांछित कुल प्रकाशक लंबाई से अधिक लंबा है.
  2. एक 22 गेज तार खाल उधेड़नेवाला का उपयोग प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर के एक छोर से पॉलीथीन जैकेट के 15-20 सेमी निकालें.
  3. एक मेज वाइज दबाना में फाइबर के छीन लिया अंत के बाहर सबसे 3-5 सेमी सुरक्षित ।
  4. एक निरंतर स्थिर खींचने के साथ एक हाथ में तना हुआ फाइबर के जैकेट के अंत पकड़ो । फाइबर फर्श के समानांतर होना चाहिए, सीधा करने के लिए उप । हीटिंग और ठंडा भर फाइबर पर इस निरंतर तनाव बनाए रखने (कदम १.५ और १.६ नीचे) इतना है कि फाइबर सीधे और तना हुआ के रूप में यह पतली रहता है ।
  5. एक दोहरे तापमान हीट गन (570/1000 & #176; F,) के निंनतम सेटिंग का उपयोग कर, जब तक यह ६०-१०० & #956 के व्यास के लिए thinned है, तो फाइबर के छीन अनुभाग गर्मी, या एक मानव बाल के व्यास के बारे में ।
  6. फाइबर पर लगातार तनाव बनाए रखते हुए
  7. को ठंडा करने की अनुमति देते हैं । तनाव बनाए रखने के लिए विफलता फाइबर कर्ल करने के लिए कारण हो सकता है ।
  8. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पतले टिप के व्यास की पुष्टि करें । वैकल्पिक रूप से, एक कैलिपर्स बजाय उपयोग कर सकते हैं ।
    1. यदि फाइबर पर्याप्त पतली नहीं है, दोहराने चरणों १.४ के माध्यम से १.६ के रूप में वांछित टिप व्यास को प्राप्त करने की जरूरत.
    2. वैकल्पिक अगर फिर से खींच, फाइबर के संकीर्ण भाग में एक छोटे से निशान डाल अगर यह फिर से गर्म हो जाएगा कि गर्मी बंदूक के केंद्र फाइबर के संकीर्ण भाग लक्ष्य ।
    3. अगर फाइबर बहुत पतला है तो ओवर स्टार्ट करें ।
  9. एक बार फाइबर पूर्ण ठंडा है और वांछित व्यास प्राप्त किया गया है, दोनों ओर संकीर्ण बिंदु से फाइबर 3 सेमी चुटकी । एक त्वरित, तेज फाइबर की धुरी के साथ पुल के साथ, एक पतला टिप बनाने के लिए पक्षों को अलग ।
  10. एक कम शक्ति के तहत पतला टिप की जांच करें ( जैसे , 4x) पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप । यदि टिप कांटा या कर्ल करवाया है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1f ), फाइबर त्यागें.
  11. टिप के अंत के पास लैब टेप का एक टुकड़ा रखकर पतला टिप खोदना करने के लिए तैयार है, पिछले 5 मिमी उजागर छोड़ रहा है । टेप प्रकाश उत्सर्जन की वांछित लंबाई से ऊपर नक़्क़ाशी से फाइबर की रक्षा करता है । इस टिप लंबाई लक्ष्य क्षेत्र में रहनुमा प्रांतस्था की मोटाई के आधार पर चुना गया था । एक लंबी या छोटी लंबाई रोशनी की वांछित लंबाई के आधार पर उजागर किया जा सकता है । यदि एक अलग खोदना टिप लंबाई वांछित है, प्रयोगशाला टेप के किनारे के करीब या आगे ले जाया जा सकता है पतला टिप से ।
  12. गुना एक छोटा (~ 1 इंच x 2 इंच) के वर्ग 5 & #956; एम सिलिकॉन कार्बाइड अंगूठे और तर्जनी के बीच में ओवरलैपिंग शीट । अतिव्यापी शीट के दो पक्षों के बीच फाइबर की नोक प्लेस और धीरे छोटे परिपत्र गति का उपयोग कर फाइबर खोदना, के रूप में अगर अंगूठे और तर्जनी के बीच एक बीबी रोलिंग । अक्सर फाइबर घुमाएं ताकि सभी पक्षों समान रूप से धंसा रहे हैं । फाइबर टिप दिखाई देगी & #8220; roughened & #8221; नग्न आंखों के लिए है कि क्षेत्रों में धंसा दिया गया है, जबकि संयुक्त राष्ट्र के धंसा क्षेत्रों में आम तौर पर चिकनी दिखाई देते हैं ।
  13. दोहराएँ चरण १.११ के साथ एक 3 & #956; m एल्यूमिनियम ऑक्साइड ओवरलैपिंग शीट.
  14. एक कनेक्टर खोदना के विपरीत प्रकाशक के अंत पर चिपका टिप । यह एक ऑप्टिकल केबल या लेज़र करने के लिए कनेक्ट करने के लिए प्रकाशक की अनुमति देता है ।
    नोट: इस विधि ferrules में कांच/सिलिका ऑप्टिकल फाइबर फिक्सिंग के लिए पसंदीदा विधि से अलग है । क्योंकि धातु सामी प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर से कठिन है, एक इकाई के रूप में फाइबर और सामी चमकाने के बाद gluing धातु के छोटे ठीकरा के रूप में प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर को नुकसान पहुंचा सकते है चमकाने की प्रक्रिया के दौरान उत्पादित खुद को फ्लैट में एंबेड कर सकते है फाइबर सट ।
    1. एक 22 गेज तार खाल उधेड़नेवाला का उपयोग कर प्रकाशक के विपरीत छोर से पॉलीथीन जैकेट के बारे में 5 मिमी निकालें.
    2. सतह चिकनी करने के लिए एक गर्म चाकू के साथ विपरीत अंत फ्लैट में कटौती ।
    3. क्रमिक महीन अतिव्यापी शीट्स के साथ विपरीत अंत फ्लैट पॉलिश: 5 & #181; म, 3 & #956; म, 1 & #956; m र ०.३ & #181; m.
    4. समतल विपरीत छोर को २६० & #181 में डालें; m भीतरी व्यास स्टेनलेस स्टील सामी जब तक यह सामी के अंत के साथ फ्लश है ।
    5. नेत्रहीन पुष्टि करते है कि विपरीत अंत सुचारू रूप से और समान रूप से एक फाइबर माइक्रोस्कोप के साथ पॉलिश है ।
    6. सामी से फाइबर निकालें और सामी नीचे की ओर इशारा करते हुए फाइबर के साथ एक मेज के किनारे पर खड़ी टेप.
    7. एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक epoxy के साथ सिरिंज भरें और सिरिंज के लिए एक कुंद 18 गेज सुई देते हैं.
    8. सुई का उपयोग करने के लिए सामी में epoxy नीचे लागू होते हैं । सामी पूरी तरह से epoxy के साथ भरें ।
    9. सामी में फाइबर डालें ।
    10. एक गीला एक प्रकार का वृक्ष के साथ फाइबर की पॉलिश सतह से किसी भी अतिरिक्त epoxy पोंछ-मुक्त अगर जरूरत सुखाने से पहले पोंछे । अंयथा, अतिरिक्त epoxy 12-24 एच
    11. के बाद हटाया जा सकता है
    12. फाइबर धीरे से अंशांकन जब तक स्टोर और सामी पर एक धूल टोपी जगह.
< p class = "jove_title" > 2. प्रकाशक अंशांकन और गुणवत्ता नियंत्रण

< p class = "jove_content" > नोट: फाइबर की नोक से विभिन्न दूरियों पर प्रकाश उत्पादन गैर रैखिकता के लिए अंशांकन के लिए इन तरीकों का आकलन करें । असमान प्रकाश वितरण आम तौर पर एक & #8220 से परिणाम; ऊबड़ & #8221; या & #8220; लहरदार & #8221, शंकु.

  1. एकीकृत क्षेत्र के शीर्ष के लिए एक प्रकाश परिरक्षण डायाफ्राम बनाएं प्रकाश अवशोषित पंनी का उपयोग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
    नोट: दस्ताने पहनें जब भी प्रकाश अवशोषित पंनी हैंडलिंग धब्बों को दर्शाती प्रकाश बनाने से त्वचा तेलों को रोकने के लिए ।
    1. गुना ए 2 & #8221; बाय 4 & #8221; एक 2 & #8221 के लिए फार्म पर प्रकाश अवशोषित पंनी का टुकड़ा; x 2 & #8221; वर्ग. & #160; एक वैकल्पिक पद्धति में एक 2 & कट है #8221; x 2 & #8221; वर्ग एक प्रकाश को अवशोषित पक्ष और एक ओर दर्शाती प्रकाश के साथ ( यानी , मानक एल्यूमीनियम पंनी का एक पक्ष); यह अगले चरण में डायाफ्राम हैंडलिंग के लिए एक सुस्त बढ़त प्रदान करता है, क्योंकि हालांकि, गुना से अधिक विधि सुरक्षित है । & #160;
    2. गुना प्रयोगशाला टेप या गैर जोड़ किनारों को बांधने के लिए वर्ग के किनारों के साथ विद्युत टेप । यह दोनों पक्षों को एक साथ रखती है और तेज किनारों से कटौती के खिलाफ की रक्षा ।
    3. पंचर एक 26 गेज सुई का उपयोग कर वर्ग के केंद्र में एक छेद ।
    4. एकीकृत क्षेत्र से टोपी पर बड़े पेंच हटाने और डायाफ्राम के साथ खोलने कवर । केंद्र पर छेद प्लेस । यदि डायाफ्राम एक प्रकाश को अवशोषित और पक्ष को दर्शाती प्रकाश के साथ बनाया गया था, जगह प्रकाश पक्ष को अवशोषित और प्रकाश नीचे पक्ष को दर्शाती है, एकीकृत क्षेत्र के अंदर का सामना करना पड़ ।
      नोट: को एकीकृत क्षेत्र में प्रवेश करने और छेद केंद्रित रखने से धूल और मलबे को रोकने के लिए, डायाफ्राम प्रयोगशाला टेप के साथ एकीकृत क्षेत्र के बाहर करने के लिए सुरक्षित ।
  2. में टिप के साथ प्रकाश उत्पादन को मापने ५०० & #181; एम वेतन वृद्धि एक micromanipulator या stereotaxic हाथ और एक एकीकृत क्षेत्र का उपयोग कर.
    नोट: उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के सुरक्षा चश्में पहना जाना चाहिए जब भी लेजर पर है ।
    1. फाइबर के विपरीत अंत एक लेजर या प्रकाश स्रोत से कनेक्ट है, लेकिन अभी तक प्रकाश उत्पादन ट्रिगर नहीं है ।
    2. एक stereotaxic धारक के लिए प्रकाशक सुरक्षित (preferably लैब टेप के साथ) के साथ टिप 7-10 मिमी के नीचे धारक के साथ.
    3. stereotaxic बांह में stereotaxic धारक पेंच ।
    4. डायाफ्राम के केंद्र में छेद के साथ प्रकाशक के टिप संरेखित करें । शूंय micromanipulator जब टिप डायाफ्राम के रूप में सटीक एक ही स्तर पर है ।
    5. कमरे रोशनी बंद कर देते है और एकीकृत क्षेत्र शूंय ।
    6. लेजर ट्रिगर (या अन्य प्रकाश स्रोत) और एकीकृत क्षेत्र का उपयोग कर कुल प्रकाश शक्ति उत्पादन को मापने.
      नोट: अंशांकन परीक्षण के लिए संभव सबसे कम प्रकाश उत्पादन का उपयोग करें ।
    7. कम फाइबर ५०० & #181; मीटर में घालमेल क्षेत्र और दोहराने चरण 2.2.6.
    8. एकीकृत क्षेत्र में फाइबर को कम करने और ५०० & #181 में कुल प्रकाश उत्पादन को मापने जारी रखने के लिए, कुल प्रकाश शक्ति का स्तर बंद जब तक मीटर वेतन वृद्धि.
      सावधानी: कुल प्रकाश शक्ति एक बार पूरे टिप क्षेत्र में है बंद स्तर चाहिए । फाइबर से अधिक 1-2 mm धंसा टिप लंबाई से परे कम करने के लिए जारी नहीं है । यदि टिप संपर्क एकीकृत क्षेत्र के नीचे, यह पिघल और/या एकीकरण क्षेत्र को बर्बाद कर सकते हैं ।
  3. कितनी दूर फाइबर एकीकृत क्षेत्र में रैखिकता की पुष्टि करने के लिए कम किया गया है की एक समारोह के रूप में कुल प्रकाश बिजली उत्पादन की साजिश द्वारा एक समान रूप से धंसा हुआ फाइबर की पुष्टि करें ।
< p class = "jove_title" > 3. Vivo में दीप्ति

< p class = "jove_content" > नोट: यहां, इन पद्धतियों एक गैर मानव रहनुमा के बजाय एक प्लास्टिक मॉडल का उपयोग कर दिखाया जाता है ।

  1. प्रत्यारोपण एक 25 मिमी व्यास रिकॉर्डिंग चैंबर ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र पर प्रयोग करने से पहले प्रत्यारोपित किया गया था.
  2. प्रयोग करने से पहले संरचनात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) प्रदर्शन करते हैं । चैंबर में एक कस्टम रिकॉर्डिंग ग्रिड प्लेस और यह बाँझ शल्य स्नेहक के साथ भरने के लिए ग्रिड दृश्य और बाडी और लक्ष्य मस्तिष्क संरचनाओं के स्तर के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. प्रत्येक परीक्षण सत्र से पहले एक टावर माइक्रो ड्राइव तैयार करते हैं ।
    1. प्रत्यय एक 25 गेज गाइड ट्यूब के साथ मध्यम और ड्राइव पर कम clamps के लिए बेवल टिप । दो clamps का उपयोग किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए कि गाइड ट्यूब सीधे रहता है । इन clamps के दोनों मैंयुअल रूप से ले जाया जा सकता है अगर वांछित ।
      नोट: गाइड ट्यूब epoxied या clamps करने के लिए टांका हो सकता है ।
    2. एक ही ड्राइव पर ऊपरी दबाना में बड़ी मात्रा प्रकाशक सुरक्षित । इस क्लैंप ड्राइव मोटर से जुड़ा हुआ है ।
    3. गाइड ट्यूब के माध्यम से बड़े मात्रा प्रकाशक थ्रेड पूरी तरह से और पुष्टि करें कि प्रकाशक की नोक गाइड ट्यूब के टिप पिछले प्रदान करता है ।
      नोट: गाइड ट्यूब की नोक पिछले प्रदान करता है कि प्रकाशक की लंबाई बाडी से लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के निचले मार्जिन के लिए दूरी के बराबर है, एमआरआई के माध्यम से निर्धारित के रूप में.
    4. को बंध्याकरण करने के लिए गाइड ट्यूब और रिप्रकाशक एंटीसेप्टिक सॉल्यूशन ( जैसे , chlorohexidine) में भिगोएं ।
  4. स्वच्छ कक्ष के अंदर एक कस्टम निष्फल ग्रिड जगह है और यह एक पूर्व चैंबर की ओर से एक पेंच के साथ निर्दिष्ट अभिविंयास पर सुरक्षित । यहां दिखाए गए ग्रिड में 1 mm रिक्ति है; हालांकि, रिक्ति आवश्यक के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है ।
    नोट: यह ग्रिड और संरचनात्मक एमआरआई में इस्तेमाल किया अभिविंयास के समान होना चाहिए ।
  5. एक पूर्व निर्धारित अभिविंयास में रिकॉर्डिंग चैंबर पर स्टीरियोटैक्टिक माइक्रो ड्राइव धारक सुरक्षित ।
  6. को बाँझ, कुंद संदंश का उपयोग कर प्रकाशक खींच द्वारा गाइड ट्यूब से निष्फल प्रकाशक वापस लेना । प्रकाशक की नोक गाइड ट्यूब के टिप से ऊपर 5-10 मिमी होना चाहिए.
    नोट: प्रकाशक बाहर गाइड ट्यूब और दबाना के बीच धनुष होगा । इससे फ्लेक्सिबल प्रकाशक को नुकसान नहीं होगा ।
  7. प्रत्यय धारक को माइक्रो ड्राइव और लक्ष्य ग्रिड छेद में गाइड ट्यूब जगह है ।
  8. जब तक गाइड ट्यूब बस बाडी के स्तर के माध्यम से है माइक्रो ड्राइव चरण कम ।
    नोट: यदि वांछित, एक दूसरे माइक्रो एक इलेक्ट्रोड के साथ ड्राइव मंच पर रखा जा सकता है और एक अलग ग्रिड छेद में कम । इस इलेक्ट्रोड पर स्थानीय क्षेत्र क्षमता एक दूरी पर निर्भर प्रकाश विरूपण साक्ष्य, जो प्रकाशक प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखाएगा.
  9. बाँझ संदंश के साथ मैन्युअल कम प्रकाशक का प्रयास.
    1. यदि कोई प्रतिरोध है, प्रकाशक 5-10 mm वापस लेना, 10 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए ऊतक बसने और फिर से कोशिश की अनुमति है ।
    2. अगर दूसरा प्रयास पर अभी भी प्रतिरोध है, गाइड ट्यूब में प्रकाशक टिप वापस लेना, गाइड ट्यूब कम ०.२५ mm, और फिर से प्रयास करें ।
    3. किसी भी प्रतिरोध के बिना गाइड ट्यूब के माध्यम से प्रकाशक स्लाइड तक दोहराएँ ।
    4. कम प्रकाशक जब तक यह तना हुआ है ।
      सावधानी: प्रकाशक प्रतिरोध के खिलाफ जबरदस्ती धक्का मत करो । इन मामलों में गाइड ट्यूब आमतौर पर बाडी पूरी तरह से प्रवेश नहीं किया है । फाइबर जबरदस्ती धकेलने यह खुद पर झुकने के लिए कारण होगा, मस्तिष्क में प्रवेश करने से फाइबर को रोकने और संभवतः टिप को नष्ट करने (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1g ).
  10. बड़ा प्रकाशिकी सेट या लेजर के लिए प्रकाशक के दूसरे छोर पर सामी कनेक्ट ।
  11. सुनिश्चित करें कि कोई प्रकाश गैर मानव रहनुमा को दिखाई दे रहा है ।
    1. पूरी तरह से रिकॉर्डिंग टावरों को शामिल करने के लिए ब्लैक आउट परिरक्षण या प्रकाश को अवशोषित पंनी का उपयोग करें ।
    2. जगह ढाल लिफाफे में सभी ऑप्टिकल कनेक्शन प्रकाश अवशोषित पंनी के बने ।
    3. ढाल सभी पैच केबल या तो प्रकाश अवशोषित पंनी या काले विद्युत टेप के साथ.
    4. एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में, एक डेको प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) एक ही हल्के रंग गैर मानव रहनुमा के पीछे प्रयोग में इस्तेमाल किया और २.५ हर्ट्ज पर लगातार एल ई डी फ्लैश के बैंक जगह है । यह आंखों को पूरी तरह से अंधेरे में एडजस्ट करने से रोकता है । अगर वहां अनजाने प्रकाश रिसाव थे, इस चमकती रोशनी को एक व्यवहार ट्रिगर के रूप में सेवारत से रिसाव को रोकने में मदद मिलेगी ।

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Representative Results

गैर मानव रहनुमाओं में बड़े मस्तिष्क की मात्रा की रोशनी व्यवहार प्रासंगिक optogenetic हेरफेर के लिए अनुमति देता है । अकर एट अल. (२०१६) लाल खिसकाया Halorhodopsin के साथ इस बड़ी मात्रा प्रकाशक का इस्तेमाल किया, 7 जबड़े के लिए ललाट आंख क्षेत्र (FEF) के अस्थाई योगदान का अध्ययन करने के लिए स्मृति-दो रीसस बंदरों में निर्देशित saccades । विशेष रूप से, FEF न्यूरॉन्स एक वायरल जबड़े युक्त वेक्टर के साथ इंजेक्शन थे और फिर एक स्मृति निर्देशित saccade कार्य के दौरान या तो लक्ष्य प्रस्तुति, देरी की अवधि, या मोटर तैयारी अवधि के दौरान बड़ी मात्रा प्रकाशक का उपयोग लाल बत्ती के साथ प्रबुद्ध 8. चित्रा 3 प्रयोग शर्तों से पता चलता है । त्रुटि दरें (उदा., विफलताओं को उचित लक्ष्य स्थान पर स्मृति-निर्देशित saccades को निष्पादित करने के लिए) काफी इंजेक्शन ग्रहणशील क्षेत्र में लक्ष्यों के लिए रोशनी के साथ बढ़ गया, लेकिन निष्क्रियता की साइट के विपरीत लक्ष्य के लिए नहीं/ (चित्र 4a) ।

optogenetics द्वारा प्रेरित व्यवहार परिवर्तन के अलावा, बड़े वॉल्यूम प्रकाशक प्रांतस्था के पूर्ण २.५ मिमी अवधि पर न्यूरॉन्स की निष्क्रियता के लिए अनुमति दी (चित्र 4c) और ४.५ मिमी (चित्रा 4b) से अधिक प्रकाश वितरण, के रूप में सबूत ऑप्टिकली प्रेरित स्थानीय क्षेत्र संभावित विरूपण साक्ष्य 8

Figure 1
चित्र 1 . बड़े वॉल्यूम प्रकाशक मोटे तौर पर प्रकाश वितरित करता है
क) ऑप्टिकल फाइबर/संभोग आस्तीन/ ख) नक़्क़ाशी कोर और cladding प्रकाश व्यापक रूप से फैल गया । ग) 5 मिमी उत्सर्जक प्रकाश-लंबी धंसा टिप । घ) एक पारंपरिक फाइबर और एक बड़ी मात्रा प्रकाशक के लिए टिप आकृतियों की तुलना । ई) प्रकाशक और 1 में समान कुल इनपुट प्रकाश शक्तियों के साथ पारंपरिक ऑप्टिकल फाइबर "घन मस्तिष्क प्रेत (१.७५% आगर). 3 मिमी टिप लंबाई के साथ एक बड़ी मात्रा प्रकाशक के मध्य पार खंड के मोंटे कार्लो मॉडल (बाएँ) और एक कन्वेंशन फ्लैट उनके प्रकाश उत्सर्जन सतहों पर बराबर प्रकाश बिजली घनत्व के साथ बराबर व्यास के सट फाइबर. इस मॉडल के विवरण के लिए अकर एट अल., २०१६ के अनुपूरक तरीके देखें. छ) घुमावदार टिप के साथ दोषपूर्ण बड़ी मात्रा प्रकाशक । h) क्षतिग्रस्त बड़ी मात्रा प्रकाशक टिप गाइड ट्यूब से उभर रहे हैं । इस आंकड़े को संशोधित किया गया है और अकर एट अल, २०१६ 8से भाग में पुनर्मुद्रित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . बड़ी मात्रा प्रकाशक अंशांकन
यह आंकड़ा मामूली संशोधनों के साथ अकर एट अल., २०१६ से पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . स्मृति-प्रबुद्ध या अलग समय पर अन्तर्वासना के साथ निर्देशित Saccade कार्य.
यह आंकड़ा अकर एट अल, २०१६ 8से पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . व्यवहार और बड़ी मात्रा रोशनी के साथ Optogenetic निषेध के Electrophysiological प्रभाव
ए) त्रुटि दरों रोशनी के साथ काफी बढ़ गई । ख) प्रांतस्था के २.५ मिमी मोटाई फैले न्यूरॉन्स के दिखा निषेध के रैस्टर भूखंडों. ग) स्थानीय क्षेत्र क्षमता एक प्रकाश ४.५ mm फैले विरूपण साक्ष्य दिखा । ख) और सी)के लिए, संपर्क प्रांतस्था की गहराई, n = ४२६ परीक्षणों के अलावा ०.५ mm स्थान पर हैं । यह आंकड़ा अनुकूलित और अकर एट अल, २०१६8से पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि optogenetic उपकरण व्यापक रूप से कुतर में रोग और फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, बड़े मस्तिष्क की मात्रा रोशन की तकनीकी चुनौती गैर मानव रहनुमाओं में optogenetics का उपयोग सीमित है । बंदरों में अग्रणी अध्ययन बड़े प्रकाश बिजली घनत्व (~ १०० मेगावाट/mm2 से 20 डब्ल्यू/2) छोटी मात्रा को रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया, शायद & #60; 1 मिमी3, और प्रांतस्था4में उत्तेजक opsins के साथ मामूली व्यवहार प्रभाव की सूचना दी, 9,10,11 और सुपीरियर colliculus12में एक निरोधात्मक opsin ।

इसलिए, बड़े वॉल्यूम प्रकाशक बड़ी ऊतक वॉल्यूम के लिए प्रकाश वितरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था । इस प्रकाशक और लाल-स्थानांतरित halorhodopsin के साथ, जबड़े, मजबूत, optogenetically-ड्राइव व्यवहार गैर-मानव रहनुमाओं में मनाया गया था8

यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोग और लक्ष्य ऊतक क्षेत्र के ज्यामिति के उद्देश्य के आधार पर बदला जा सकता है । उदाहरण के लिए, फाइबर की धंसा टिप लंबा या रोशन किया जा करने के लिए क्षेत्र के आकार के आधार पर छोटा किया जा सकता है । टिप एक मोटा टिप के साथ वर्णित की तुलना में खींचा जा सकता है या एक बड़ा व्यास फाइबर एक और अधिक मजबूत प्रकाशक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल एक धंसा फाइबर टिप का वर्णन करता है, यह दोनों नोक पर और गैर-निरंतर रोशनी के लिए एक अधिक बाहर खंड पर फाइबर खोदना करने के लिए संभव है.

गुणवत्ता नियंत्रण जांच इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । एक बड़ी मात्रा प्रकाशक की नोक कांटे या कर्ल करवाने (चित्रा 1g) बन सकता है, खासकर अगर यह यांत्रिक रूप से क्षतिग्रस्त है या यदि यह भी शुरू में पतली खींच लिया है । लगातार बल की उचित मात्रा के साथ फाइबर खींचने के लिए, सबसे experimenters अभ्यास के कुछ घंटों की जरूरत है । फाइबर बनाने की कम लागत को देखते हुए (सिफारिश प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर से कम लागत $०.०३/मीटर), कई experimenters केवल ferrules करने के लिए सही सुझावों के साथ फाइबर प्रत्यय और, इसलिए, छोटे टिप खामियों के लिए फाइबर के कम से कम 30% त्यागें. असमान प्रकाश वितरण अंशांकन के दौरान की खोज फिर से फाइबर टिप चमकाने और फिर से फाइबर जांचना द्वारा सही किया जा सकता है ।

इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोग के बाद प्रकाशक की नोक की जांच की जानी चाहिए । अगर प्रयोगकर्ता गाइड ट्यूब के माध्यम से प्रकाशक को आगे की ओर बाध्य करता है, इससे पहले कि मार्गदर्शिका ट्यूब ने बाडी में प्रवेश किया हो, प्रकाशक स्वयं पर पीछे मुड़ जाएगा और यह मस्तिष्क में प्रवेश नहीं करेगा । आमतौर पर, प्रकाशक टिप इन मामलों में (चित्रa) नष्ट हो जाती है । प्रकाशक सम्मिलन के प्रतिरोध के अलावा, स्थानीय फ़ील्ड संभावित उचित प्रकाशक प्लेसमेंट के लिए एक इन-प्रयोग जाँच के रूप में कार्य करता है. यदि प्रकाशक बाडी के ऊपर तुला हुआ है, स्थानीय क्षेत्र क्षमता विशेषता प्रकाश विरूपण साक्ष्य है, जो प्रयोग के दौरान उचित प्रकाशक नियुक्ति के लिए एक जांच के रूप में कार्य करता है दिखाएगा नहीं होगा ।

जबकि बड़ी मात्रा प्रकाशक वितरण प्रकाश के लिए एक साथ कई cortical परतों के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह अच्छी तरह से सबसे सतही cortical परतों रोशन जबकि गहरी परतों बख्शने या प्रांतस्था की एक परत रोशन करने के लिए अनुकूल नहीं है व्यक्तिगत. यदि बहुत विशेष रूप से विशिष्ट प्रदीप्ति वांछित है, तो बाडी 6 में खिड़कियों के माध्यम से प्रकाश अधिक संकीर्ण या सतही रोशनी ध्यान केंद्रित पारंपरिक फाइबर अधिक उपयुक्त हो सकता है । इसके अलावा, बड़ी मात्रा प्रकाशक का लचीलापन दोनों एक लाभ और एक सीमा है । कांच ऑप्टिकल फाइबर के विपरीत, इस प्रकाशक मस्तिष्क ऊतक में चकनाचूर नहीं कर सकते, तथापि, यह लचीलापन भी यह मुश्किल बड़े cortical दूरी पर प्रकाशक अग्रिम करने के लिए बनाता है (उदा., 10 मिमी या अधिक) । इसलिए, एक बहुत ही गहरी मस्तिष्क संरचना (उदा, pulvinar) को टार्गेट करने के लिए, एक गाइड ट्यूब को बाडी के पिछले और मस्तिष्क के ऊतकों में अतिरिक्त यांत्रिक सुदृढीकरण प्रदान करने के लिए उन्नत होने की आवश्यकता होगी ।

कुल मिलाकर, इस विधि से पहले तरीकों पर एक पर्याप्त लाभ प्रदान करता है क्योंकि यह व्यवहार-गैर में प्रासंगिक मस्तिष्क संस्करणों के रोशनी की अनुमति देता है, मानव रहनुमाओं, गैर को optogenetics अनुकूल करने के लिए एक चाबी मानव रहनुमा अध्ययन । हालांकि इस विधि रीसस बंदरों के FEF में दिखाया गया है, यह कई अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में और यहां तक कि अन्य इसी तरह की बड़ी मस्तिष्क प्रजातियों में काम करेंगे ।

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Disclosures

कोई

Acknowledgements

एलसीए एक NDSEG फैलोशिप, NSF GRFP, और McGovern संस्थान के दोस्तों से धन स्वीकार करता है । EP हैरी और Eunice Nohara उरोप कोष, १९९५ उरोप कोष के एमआईटी वर्ग, और एमआईटी उरोप कोष के धन को स्वीकार करता है । ESB NIH 2R44NS070453-03A1, चलो हार्वे पुरस्कार, और ंयूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन-Robertson पुरस्कार से धन स्वीकार करता है । आरडी NIH EY017292 से धन स्वीकार करता है । माइकल विलियंस टीम को संगठित और आपूर्ति इकट्ठा करने से पहले फिल्माने में मदद की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1,000 °F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

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References

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