Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een protocol bij het bouwen van een weefsel doordringende illuminator voor het leveren van licht via grote volumes met minimale diameter wordt gepresenteerd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit protocol beschrijft een groot volume illuminator, die werd ontwikkeld voor optogenetic manipulaties in de hersenen niet-menselijke primaten. De illuminator is een gemodificeerde kunststof optische vezel met geëtste tip, zodanig dat het oplichtende oppervlak > 100 x die van een conventionele vezel. Naast het beschrijven van de bouw van een groot volume hulplicht, detailleert dit protocol de kalibratie van de kwaliteitscontrole gebruikt om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling. Dit protocol wordt verder beschreven technieken voor het invoegen en verwijderen van het hulplicht groot volume. Zowel de oppervlakkige en de diepe structuren kunnen worden verlicht. Dit hulplicht groot volume hoeft niet te worden fysiek gekoppeld aan een elektrode, en omdat de illuminator is gemaakt van kunststof, niet het glas, het gewoon zal buigen in omstandigheden als traditionele optische vezels zou versplinteren. Omdat dit hulplicht licht boven gedragsgestoorde relevante weefsel volumes (≈ 10 mm3) zonder meer schade van de penetratie dan een conventionele optische vezel levert, vergemakkelijkt het behavioral studies met optogenetics in niet-menselijke primaten.

Introduction

Optogenetic instrumenten, die voor milliseconde-nauwkeurige, licht gestuurde neuronale controle zorgen worden veel gebruikt om te studeren functionele fysiologie en gedrag in knaagdieren en ongewervelde dieren. Technische uitdagingen hebben echter slechts beperkt het gebruik van optogenetics in de hersenen van de niet-menselijke primaten, die een volume van ~ 100 x groter dan de knaagdier hersenen 1 heeft.

Om te vergemakkelijken optogenetics studies in niet-menselijke primaten, een hulplicht is ontworpen om twee concurrerende doelstellingen adres: groot volume verlichting en minimale penetratie schade. Eerdere pogingen om een van deze problemen te komen op de duur van de andere. Bundels van vezels verlichten grotere volumes, maar met grotere diameter, en daarmee schade2,3. Taps toelopende glasvezels beschadiging, penetratie, maar ternauwernood focus licht aan oplichtende oppervlak < 100 µm2 - 4,5. Externe hersenen verlichting door een raam in de dura omzeilt de uitdaging van de penetratie schade en kan voor grote volume verlichting, maar het kan alleen worden gebruikt voor enkele oppervlakkige hersenen gebieden6.

Als u wilt maken een groot volume, kleine diameter illuminator (Figuur 1a), het puntje van een plastic optische vezel is warmte tapered en de kern en de bekleding zijn geëtst (Figuur 1bc). In tegenstelling tot andere taps toelopende vezels die licht naar een smal punt concentreren, kunt de etsen licht gelijkmatig ontsnappen uit de zijkanten van de stortplaats, dus licht in grote lijnen over een groot gebied (Figuur 1 de) te verdelen. Omdat de penetratie schade is evenredig aan de diameter van de penetratie, dit hulplicht heeft geen meer schade van de penetratie dan een conventionele vezel, maar het heeft > 100 x het oplichtende oppervlak gebied en levert licht meer in het algemeen met 1/100ste de lichte macht dichtheid in een hersenen phantom (1,75% agarose) (Figuur 1e). Een Monte Carlo-model (Figuur 1f) illustreert het verschil in licht verspreiden tussen een conventionele vezel en het grote volume hulplicht wanneer zij gelijke lichte macht dichtheden hebben als hun lichtdoorlatende oppervlakken. Elke illuminator is individueel gekalibreerd met behulp van een bolfotometer (Figuur 2a, b) om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling langs de tip (Figuur 2 c).

Dit groot volume illuminator is gevalideerd met optogenetic manipulatie van zowel gedrag en neuronale afvuren in niet-menselijke primaten. De lengte van de tip vezel kan worden aangepast naar elk willekeurig deel van de hersenen en voor elk dier individuele receptieve veld kaart. Het hulplicht kan gekoppeld worden aan een doordringende elektrode voor neuronale opnames die zich uitstrekken over de lengte van de verlichting. Verder, omdat de vezel elke kleur van zichtbaar licht kunnen, kunnen worden gekoppeld met een van de beschikbare optogenetic moleculen beschikbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de richtsnoeren van de NIH en goedgekeurd door het Massachusetts Instituut van technologie Committee on Animal Care.

1. illuminator fabricage

  1. gebruik van een paar scherpe schaar te snijden van een deel van 250 µm diameter kunststof optische vezel dat is ten minste 10 cm langer dan de lengte van de gewenste totale illuminator.
  2. Verwijderen van 15-20 cm van polyethyleen jas van het ene eind van de kunststof optische vezel met behulp van een 22 gauge draad-stripper.
  3. Beveiligen de distale meeste 3-5 cm van het gestripte deel van de vezel in een bankschroef Tafelklem.
  4. Houd de dubbelwandige uiteinde van de vezel strak in de ene hand met een constante constante trek. De vezel moet parallel aan de vloer, loodrecht op de vice. Handhaven van deze constante spanning op de glasvezel in de gehele verwarming en koeling (stappen 1.5 en 1.6 hieronder) zodat de vezel rechte en strak blijft zoals het verdunt.
  5. Met de laagste instelling van een dubbele temperatuur warmte pistool 570/1.000 ° F, verwarm het gestripte deel van de vezel tot het is verdund met een diameter van 60-100 μm, of over de diameter van een mensenhaar.
  6. Behouden de constante spanning op de glasvezel terwijl het toestaan van de vezel om te koelen. Falen om de spanning kan leiden tot de vezel te krullen.
  7. Bevestigen de diameter van de verdunde tip onder een Microscoop ontleden. Afwisselend, men kan de remklauwen in plaats daarvan gebruiken.
    1. Als de vezel niet dun genoeg is, herhaalt u stap 1.4 via 1.6 zoals die nodig zijn om de gewenste tip diameter.
    2. Optioneel als opnieuw trekken, zet een kleine mark op het smalste gedeelte van de vezel als het zal opnieuw worden verwarmd zodat het midden van de warmte-pistool richt zich op het smalste gedeelte van de vezel.
    3. Als de vezel te dun is, herbeginnen.
  8. Zodra de vezel volledig is afgekoeld en de gewenste diameter is bereikt, knijpen de vezel 3 cm vanaf het smalste punt aan beide zijden. Met een snelle, scherpe trekken langs de as van de vezel, scheiden de zijkanten om te maken een taps toelopende tip.
  9. Onderzoeken de taps toelopende tip onder een laag vermogen (bijvoorbeeld 4 X) over dissectie Microscoop. Als het uiteinde vertakt of gekruld ( Figuur 1f), negeren de vezel.
  10. Voorbereiden aan de taps toelopende tip etch door het plaatsen van een stukje lab tape in de buurt van het einde van de tip, verlaten de laatste 5 mm blootgesteld. De tape beschermt de vezel tegen ETS boven de gewenste lengte van licht emissie. De lengte van deze tip was geselecteerd op basis van de dikte van primate cortex in de target-regio. Een langere of kortere lengte kan afhankelijk van de gewenste lengte van verlichting worden blootgesteld. Indien een verschillende etsen tip lengte is gewenst, de rand van de lab-tape dichter kan worden verplaatst naar of verder van de taps toelopende tip.
  11. Vouw een klein (~ 1 inch x 2-inch) vierkant van 5 μm siliciumcarbide kabbelende blad over tussen de duim en wijsvinger. Plaats het uiteinde van de vezel tussen de twee zijden van de kabbelende vel en zachtjes de vezel met behulp van kleine cirkelvormige bewegingen, etch, alsof een BB tussen duim en wijsvinger rollen. Vaak draaien de vezel zodat alle kanten gelijkmatig zijn gegrift. De vezel tip zal verschijnen “ geruwd ” met het blote oog in gebieden die hebben is geëtst, terwijl niet-geëtste gebieden meestal altijd gelijkmatig weergegeven.
  12. Herhaal stap 1.11 met een 3 μm aluminium oxide lappen blad.
  13. Brengt een verbindingslijn op het einde van het hulplicht tegenover de geëtste tip. Hierdoor is het hulplicht koppelen aan een optische kabel of laser.
    Opmerking: Deze methode verschilt van de voorkeursmethode voor de vaststelling van glas / kiezelzuur optische vezels in ferrules. Omdat de metalen verlengstuk moeilijker dan de kunststof optische vezel is, polijsten van de vezel en verlengstuk als een eenheid na het lijmen kan beschadigen de kunststof optische vezel als kleine scherven van metaal geproduceerd tijdens het polijsten kunt zich insluiten in flat-gekloofd vezel.
    1. Verwijderen van ongeveer 5 mm van de polyethyleen jas van het andere uiteinde van het hulplicht met behulp van een 22 gauge draad-stripper.
    2. Knippen van de andere kant plat met een warme mes om het oppervlak glad.
    3. Pools van het andere uiteinde plat met achtereenvolgens fijnere lappen bladen: 5 µm, 3 μm, 1 μm en 0,3 µm.
    4. Invoegen de flat tegenover uiteinde in een verlengstuk van de RVS van 260 µm-binnendiameter, totdat het spoelen met het einde van de verlengstuk.
    5. Visueel te bevestigen dat het tegenovergestelde einde soepel en gelijkmatig met een fiber-Microscoop gepolijst is.
    6. Verwijderen van de vezel van het verlengstuk en tape het verlengstuk verticaal aan de rand van een tabel met de vezel die naar beneden wijst.
    7. Vul een spuit van 1 mL met kunststof epoxy en hechten een botte 18 gauge naald op de injectiespuit.
    8. Gebruik de naald te passen epoxy beneden in de verlengstuk. Het verlengstuk volledig te vullen met epoxy.
    9. De vezel invoegen het verlengstuk.
    10. Veeg alle overtollige epoxy van gepolijste oppervlak van de vezel met een natte pluisvrije doekje vóór het drogen indien nodig. Anders, overtollige epoxy kan worden verwijderd na 12-24 h.
    11. Bewaren de vezel zachtjes tot kalibratie en plaats een stofkap boven het verlengstuk.

2. Illuminator kalibratie en kwaliteitscontrole

Opmerking: deze methoden voor kalibratie beoordelen voor niet-lineariteit op verschillende afstanden van de tip van de vezel lichtopbrengst. Ongelijke lichtverdeling meestal het gevolg van een “ hobbelige ” of “ golvende ” taper.

  1. Maken een lichte afscherming membraan voor de bovenkant van de integrerende bol met behulp van licht absorberende folie ( Figuur 2).
    Opmerking: Draag handschoenen wanneer behandeling licht absorberende folie om te voorkomen dat de huid oliën van het creëren van licht reflecterende vlekken.
    1. Vouw een 2 ” door 4 ” stuk van licht absorberende folie op zichzelf om te vormen van een 2 ” x 2 ” square. een alternatieve methode is om te snijden een 2 ” x 2 ” plein met een licht absorberen van kant en een licht reflecterende kant (dat wil zeggen een kant van de standaard aluminiumfolie); echter de fold-over-methode is veiliger, omdat daarin een doffe rand voor het afhandelen van het middenrif in de volgende stap.
    2. vouwen lab tape of isolatietape langs de randen van het vierkant om te binden de randen niet-gevouwen. Dit zowel de zijden bij elkaar houdt en beschermt tegen bezuinigingen van scherpe randen.
    3. Een gat in het midden van het plein met behulp van een 26 gauge naald punctie.
    4. Verwijderen van de grote schroef op de dop van de bolfotometer en betrekking hebben op de opening met het middenrif. Plaats het gat boven het midden. Als het middenrif is gemaakt met een licht absorberen en een licht reflecterende kant, plaatst u het licht absorberen kant omhoog en het licht reflecterende zijde naar beneden, geconfronteerd met de binnenkant van de bolfotometer.
      Opmerking: Om te voorkomen dat stof en puin van het invoeren van de bolfotometer en houden het gat gecentreerd, beveiligen het membraan aan de buitenkant van de bolfotometer met lab tape.
  2. Maatregel lichte uitgang langs de tip in 500 µm stappen met behulp van een micromanipulator of stereotaxic arm en een bolfotometer.
    Opmerking: Veiligheidsbril met de juiste golflengte moeten gedragen worden, wanneer de laser brandt.
    1. Het andere uiteinde van de vezel verbinden met een laserprinter of een licht bron, maar doen niet nog licht trigger.
    2. Secure het hulplicht aan een stereotaxic (prefe-houderrably met lab tape) met de tip 7-10 mm onder de bodem van de houder.
    3. Schroef de stereotaxic houder in het stereotaxic wapen
    4. Hiermee lijnt u de tip van het hulplicht met het gat in het midden van het middenrif. De micromanipulator nul wanneer de tip op exact hetzelfde niveau als het middenrif is.
    5. Turn off van de kamer lichten en nul van de bolfotometer.
    6. Leiden tot de laser (of andere lichtbron) en meet de lichte totaalvermogen uitvoer via de bolfotometer.
      Opmerking: De laagste lichtopbrengst mogelijk gebruiken voor het testen van de kalibratie.
    7. De glasvezel 500 µm lager in de integrerende bol en herhaalt u stap 2.2.6.
    8. Verder verlagen van de vezel in de bolfotometer en het meten van totale lichtopbrengst in 500 µm stappen tot de lichte totaalvermogen niveaus af
      Let op: Lichte totaalvermogen moet niveau af zodra de gehele tip in het gebied is. Ga niet verder met het verlagen van de vezel meer dan 1-2 mm buiten de geëtste tip lengte. Als het uiteinde contact maakt met de onderkant van de bolfotometer, het kan smelten en/of ruïneren van de bolfotometer.
  3. Een gelijkmatig geëtste vezel bevestigen door het uitzetten van lichte totaalvermogen output als een functie van hoe ver de vezel is verlaagd in de bolfotometer te bevestigen lineariteit.

3. in Vivo verlichting

Opmerking: hier, deze methoden worden weergegeven met behulp van een plastic model in plaats van een niet-menselijke primaten.

  1. Implantaat een kamer van 25 mm diameter opnemen over het gebied van de hersenen van belang voorafgaand aan experimenten was geïmplanteerd.
  2. Anatomische magnetische resonantie beeldvorming (MRI) voorafgaand aan experimenten uitvoeren Een aangepaste opname-raster plaatsen in de zaal en vul het met steriele chirurgische smeermiddel voor raster visualisatie en bepaling van het gehalte van de breinstructuur dura- en het doeldomein.
  3. Bereiden een toren micro-station vóór elke test sessie.
    1. Affix een 25 meter gids buis met schuine tip naar het midden en lagere klemmen op de schijf. Twee klemmen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de gids buis rechtdoor blijft. Beide van deze klemmen kunnen handmatig worden verplaatst indien gewenst.
      Opmerking: De gids-buis kan vastgesoldeerd aan de klemmen of epoxied worden.
    2. Beveiligen het hulplicht groot volume in de bovenste klem op hetzelfde station. Deze klem is gekoppeld aan de aandrijfmotor.
    3. Draad de verlichter van de groot-volume door de gids buis volledig en bevestigen dat het uiteinde van het hulplicht strekt zich uit langs de tip van de gids buis.
      Opmerking: De lengte van het hulplicht dat zich uitstrekt van verleden het uiteinde van de buis gids is gelijk aan de afstand van de dura in het onderste gedeelte van de regio van de hersenen doel, als bepaald via MRI.
    4. Geniet van de gids buis en illuminator in antiseptische oplossing (bijvoorbeeld, chlorohexidine) te steriliseren.
  4. Een aangepaste gesteriliseerde raster plaatsen binnen de schone kamer en veilig op een vooraf opgegeven oriëntatie met een schroef aan de zijkant van de kamer. De hier getoonde raster heeft 1 mm afstand; echter de afstand zo nodig kan worden aangepast.
    Opmerking: Dit moet identiek zijn aan het raster en de afdrukstand in de anatomische MRI gebruikt.
  5. De stereotactische houder van de micro-aandrijving op de kamer van de opname in een vooraf bepaalde richting secure.
  6. Intrekken de gesteriliseerde verlichter van de buis van de gids door te trekken van het hulplicht up met behulp van steriele, botte pincet. De tip van het hulplicht moet 5-10 mm boven de tip van gids buis.
    Opmerking: Het hulplicht zal buigen naar buiten tussen de buis van de gids en de klem. Dit zal niet beschadigen de flexibele illuminator.
  7. Brengt de micro-drive aan de houder en de gids buis plaatsen in doel raster gat.
  8. Lagere de fase van de micro-station totdat de buis gids gewoon door het niveau van de dura is.
    Opmerking: Indien gewenst, kan een tweede micro-station met een elektrode worden in het werkgebied geplaatst en in een ander rooster gat verlaagd. Het lokale veld potentiële op deze elektrode zal tonen een afstand-afhankelijke lichte artefact, die kan worden gebruikt ter bevestiging van plaatsing illuminator.
  9. Proberen hoe lager het hulplicht handmatig met steriel pincet.
    1. Als er geen weerstand, trekken de verlichter 5 - 10 mm, wacht 10 minuten zodat het weefsel te regelen en probeer het opnieuw.
    2. Als er nog weerstand bij de tweede poging, de verlichter tip intrekken in de gids buis, lager de gids 0,25 mm buis, en probeer het opnieuw.
    3. Herhalen totdat de illuminator glijdt door de gids buis zonder enige weerstand.
    4. Lagere de verlichter totdat het strak.
      Let op: Duw niet het hulplicht krachtig tegen verzet. In deze gevallen de gids buis meestal is niet doorgedrongen tot de dura volledig. De vezel krachtig duwen zal leiden tot het te buigen, voorkomen van de vezel van het invoeren van de hersenen en eventueel vernietigen van de tip ( Figuur 1 g).
  10. De verlengstuk aan de andere kant van het hulplicht verbinden met de grotere optica instellen of laser.
  11. Zorg ervoor dat geen licht zichtbaar voor de niet-menselijke primaten is.
    1. Gebruik verduisterende afschermen of licht absorberende folie volledig omvat de opname torens.
    2. Plaats van alle optische verbindingen in afgeschermde enveloppen zijn gemaakt van licht absorberende folie.
    3. Schild alle patch kabels met beide licht absorberende folie of zwarte isolatietape.
    4. Als een extra voorzorgsmaatregel, plaats een lokvogel light - emitting diode (LED) bank voor de dezelfde lichte kleur gebruikt in het experiment achter de niet-menselijke primaten en flash van de LED's continu bij 2,5 Hz. Hiermee voorkomt u dat de ogen volledig aan te passen aan de duisternis. Mochten er onverhoeds zwak lekkage, deze knipperend licht zou helpen om te voorkomen dat het lek een gedrags trigger bijeenkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De verlichting van de grote hersenen volumes in niet-menselijke primaten zorgt voor behavioristisch relevante optogenetic manipulatie. Acker et al. (2016) gebruikt dit hulplicht groot volume met de rood-verschoven Halorhodopsin, Jaws, 7 te bestuderen van de tijdelijke bijdrage van het veld frontale oog (FEF) geheugen-geleide saccades in twee rhesus monkeys. In het bijzonder waren FEF neuronen geïnjecteerd met een virale vector met kaken en vervolgens verlicht met rood-licht met behulp van het hulplicht groot volume tijdens de presentatie van de doelgroep, vertragingsperiode of motor voorbereidingsperiode van een geheugen-geleide saccade taak 8. Figuur 3 toont de experiment-voorwaarden. Foutenpercentages (b.v., mislukkingen uit te voeren van de geheugen-geleide naar de juiste doellocatie saccades) aanzienlijk verhoogd met verlichting voor doelen in het ingespoten receptieve veld, maar niet voor doelen tegengesteld aan de site van inactivatie / verlichting (Figuur 4a).

Naast de gedragsveranderingen geïnduceerd door optogenetics, het grote volume hulplicht toegestaan voor inactivatie van neuronen in de loop van de volledige 2.5 mm van de cortex (Figuur 4 c) en lichte levering meer dan 4.5 mm (figuur 4b), zoals blijkt uit de optisch-geïnduceerde lokale veld potentiële artefact 8.

Figure 1
Figuur 1 . Groot Volume Illuminator distribueert breed licht
een) optische vezel/paring mouw/illuminator interface. b) omkaderd kern en bekleding licht verspreiden in grote lijnen. c) Light-emitting 5 mm-lang geëtst tip. d) vergelijking van tip vormen voor een conventionele vezel en een groot volume illuminator. e) Illuminator en conventionele optische vezel met gelijke totale invoer lichte bevoegdheden in 1" kubieke hersenen phantom (1,75% agar). f) Monte Carlo modellen van het middelste gedeelte van het Kruis van een groot volume illuminator met 3 mm tip lengte (links) en een Conventie vlakke gekloofd vezel van gelijke diameter met gelijke lichte macht dichtheden op hun lichtdoorlatende oppervlakken. Zie aanvullende methoden van Acker et al., 2016 voor de details van dit model. g) defect groot volume illuminator met gekrulde tip. h) beschadigd groot volume illuminator tip opkomende uit gids buis. Dit cijfer is bewerkt en herdrukt in deel van Acker et al., 2016 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Groot Volume Illuminator kalibratie
Dit cijfer is herdruk van Acker et al., 2016 met kleine wijzigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Geheugen-geleide Saccade taak met verlichting of Sham op verschillende tijdstippen.
Dit cijfer is herdruk van Acker et al., 2016 8Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Gedrags- en elektrofysiologische effecten van inhibitie van de Optogenetic met groot Volume verlichting
een) foutenpercentages aanzienlijk toegenomen met verlichting. b) Raster percelen remming van neuronen verspreid over de 2,5 mm dikte van de schors te laten zien. c) lokale veld potentieel tonen een lichte artefact spanning 4.5 mm. Voor b) en c), contactpersonen zijn verdeelde 0.5 mm van elkaar over de diepte van de cortex, n = 426 proeven. Dit cijfer is aangepast en herdruk van Acker et al., 20168Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel optogenetic tools veel gebruikt worden om te studeren ziekten, en fysiologie bij knaagdieren, heeft de technische uitdaging van verhelderend grote hersenen volumes beperkt het gebruik van optogenetics in niet-menselijke primaten. Baanbrekende studies in apen grote lichte macht dichtheden (~ 100 mW/mm2 tot 20 W/mm2) gebruikt voor het verlichten van kleine volumes, misschien < 1 mm3en gerapporteerde bescheiden gedrags effecten met excitatory opsins in de cortex4, 9,10,11 en een remmende opsin in de superieure colliculus12.

Daarom ontstond een groot volume illuminator zodat voor lichte levering aan grote weefsel volumes. Met dit hulplicht en de rode-verschoven halorhodopsin, Jaws, robuust, optogenetically-station gedrag werd waargenomen in niet-menselijke primaten8.

Het protocol hier beschreven kan worden aangepast afhankelijk van het doel van het experiment en de geometrie van de target weefsel regio. Bijvoorbeeld, kan de geëtste tip van de vezel worden verlengd of ingekort afhankelijk van de grootte van de ruimte moet worden verlicht. Het uiteinde kan worden getrokken met een dikkere tip dan beschreven of een grotere diameter vezel kan worden gebruikt om een meer robuuste illuminator. Terwijl dit protocol een geëtste vezel tip beschrijft, is het haalbaar om de vezel zowel aan het uiteinde een meer distale segment voor niet-aaneengesloten verlichting etch.

Kwaliteitscontroles zijn een cruciaal onderdeel van dit protocol. De tip van een groot volume-hulplicht kan vertakt of gekruld (Figuur 1 g), met name indien deze mechanisch beschadigd of als het in eerste instantie te dun wordt getrokken. Te trekken van de vezel met de juiste hoeveelheid kracht consequent, moeten de meeste onderzoekers een paar uur van de praktijk. Gezien de lage kosten van het maken van vezels (de aanbevelen kunststof optische vezel kost minder dan $ 0,03/meter), veel onderzoekers alleen brengt vezels met perfecte tips voor tips en, derhalve, het negeren van ten minste 30% van de vezels voor kleine tip onvolkomenheden. Ongelijke lichtverdeling ontdekt tijdens de kalibratie kan worden gecorrigeerd door opnieuw polijsten de tip fiber en opnieuw kalibreren van de vezel.

Verder moet de tip van het hulplicht gecontroleerd worden na elk experiment. Als de experimentator de verlichter door de gids buis dwingt voordat de gids buis doorgedrongen de dura tot is, de verlichter zal buigen terug op zichzelf en het zal niet het invoeren van de hersenen. De illuminator tip is meestal vernietigd in deze gevallen (Figuur 1 h). Afgezien van de weerstand tegen illuminator inbrengen fungeert het lokale veld potentiële als een in-experiment controle voor juiste illuminator plaatsing. Als de illuminator is gebogen omhoog boven de dura, weergegeven het lokale veld potentiële het karakteristieke licht artefact, die als controle voor juiste illuminator plaatsing tijdens het experiment dient niet.

Hoewel het grote volume hulplicht is ontworpen voor levering licht aan meerdere corticale lagen tegelijk, is het niet goed geschikt te verlichten de meest oppervlakkige corticale lagen terwijl sparend diepere lagen of te verlichten van een enkellaags cortex individueel. Als zeer ruimtelijk specifieke verlichting gewenst is, wellicht traditionele vezels die licht meer eng gericht of oppervlakkige verlichting door ramen in de dura 6 geschikter. Verder is de flexibiliteit van het grote volume-hulplicht is zowel een voordeel en een beperking. In tegenstelling tot optische glasvezels, dit hulplicht niet kan versplinteren in hersenweefsel, echter deze flexibiliteit maakt het ook moeilijk om vooraf de verlichter over grote corticale afstand (b.v., 10 mm of meer). Daarom te richten op een zeer diepe hersenstructuur (b.v., pulvinar), zou een gids buis moeten worden vooruitgegaan langs de dura en in hersenweefsel te verstrekken aanvullende mechanische versterking.

Globaal, is deze methode biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van voorafgaande methoden omdat hierdoor verlichting van gedragsgestoorde relevante hersenen volumes in niet-menselijke primaten, een sleutel tot aanpassing van de optogenetics voor niet-menselijke primaten studies. Hoewel deze methode getoond in de FEF van rhesus monkeys, zou het werken op veel andere hersengebieden en zelfs bij andere diersoorten ook grote hersenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen

Acknowledgements

LCA erkent financiering van een NDSEG-beurs, de NSF-GRFP en de vrienden van het McGovern Institute. EP erkent financiering de Harry en Eunice Nohara UROP Fonds, de MIT-klasse van 1995 UROP Fonds en het Fonds MIT UROP. ESB erkent financiering van NIH 2R44NS070453-03A1, de prijs van IET Harvey, en de New York stamcel Foundation-Robertson Award. RD erkent financiering van NIH EY017292. Michael Williams hielp het team te organiseren en leveringen vóór het filmen te verzamelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1,000 °F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211, (1), 49-57 (2012).
  3. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, (3), 387-397 (2011).
  4. Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24, (1), 63-69 (2014).
  5. Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219, (1), 142-154 (2013).
  6. Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110, (6), 1455-1467 (2013).
  7. Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17, (8), 1123-1129 (2014).
  8. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (46), 7297-7306 (2016).
  9. Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15, (10), 1368-1370 (2012).
  10. Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22, (18), 1722-1726 (2012).
  11. Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33, (42), 16684-16697 (2013).
  12. Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76, (5), 901-907 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics