التحديد الكمي للكائنات الحية الدقيقة في تركيزات منخفضة باستخدام المجهر المجسم الرقمي (DHM)

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الميكروسكوب المجسم الرقمي (DHM) هو تقنية حجمي يسمح تصوير العينات X 50-100 أكثر سمكا من الفحص المجهري برايتفيلد في القرار قابلة للمقارنة، مع التركيز ما بعد المعالجة. هنا يستخدم اضعا لتحديد وفرز الأصوات، وتتبع الكائنات المجهرية في جداً منخفضة الكثافة والمقارنة مع قياسات الكثافة البصرية ولوحة العد والعد المباشر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد كشف بدقة وفرز العينات البكتيرية متفرق العديد من التطبيقات في الأغذية والمشروبات، والصناعات الدوائية، في التشخيص الطبي، والكشف عن الحياة الروبوتية بعثات أخرى الكواكب وأقمار النظام الشمسي. حاليا، يتم حسابها العينات البكتيرية متفرق طريق الثقافة الطلاء أو ابيفلوريسسينسي المجهري. لوحات الثقافة تتطلب فترة طويلة حضانة مرات (أيام إلى أسابيع)، والفحص المجهري ابيفلوريسسينسي يتطلب تلطيخ مكثفة وتركيز العينة. هنا، نحن توضح كيفية استخدام الفحص المجهري خارج المحور الرقمي المجسم (DHM) لتعداد البكتيريا في الثقافات مخفف جداً (100-104 خلايا/مل). أولاً، هو مناقشة بناء اضعا مخصصة، جنبا إلى جنب مع تعليمات مفصلة حول بناء وسيلة منخفضة التكلفة. وتناقش مبادئ التجسيدي، ويتم استخدام نموذج إحصائي لتقدير كم من الوقت ينبغي أن أشرطة الفيديو للكشف عن الخلايا، استناداً إلى خصائص الأداء البصري للصك وتركز الحل البكتيرية (الجدول 2) . فيديو الكشف عن الخلايا في 105، 104، 103و 100 خلايا/مل يتجلى في الوقت الحقيقي باستخدام الصور المجسمة الأمم المتحدة أعيد بناؤها. ويتجلى الإعمار الصور السعة والمرحلة باستخدام حزمة برمجيات المصدر المفتوح.

Introduction

تحديد دقة التهم البكتيرية في عينات مخفف جداً أمر حاسم في العديد من التطبيقات: هي أمثلة قليلة على الماء والغذاء نوعية التحليل1،2،3؛ الكشف عن العوامل الممرضة في الدم أو السائل الدماغي النخاعي البصاق4،5؛ إنتاج المستحضرات الصيدلانية، بما في ذلك الماء المعقم6؛ وتحليل المجتمع البيئي في البيئات oligotrophic مثل مفتوحة المحيط والرواسب7،،من89. هناك أيضا اهتمام متزايد في الكشف عن إمكانية الحياة الميكروبية قائما على الأقمار الجليدية لكوكب المشتري وزحل، لا سيما أوروبا10،11 وانسيلادوس12،13، 14، التي من المعروف أن لها المحيطات السائلة تحت سطح الأرض. لأن أي بعثة منذ فايكنغ في عام 1978 حاول العثور على الحياة موجودة على كوكب آخر، كان هناك التنمية المحدودة لتكنولوجيات وأدوات لتحديد البكتيريا والعد أثناء بعثات الفضاء15.

البحث عن الأساليب التقليدية للوحة العد فقط من الخلايا كولتورابل، التي يمكن أن تمثل أقلية أنواع في الضغوط البيئية، في بعض الأحيان < 1%16. لوحات تتطلب أيام أو أسابيع من الحضانة لأقصى قدر من النجاح، تبعاً للضغط. ابيفلوريسسينسي المجهري حلت إلى حد كبير التهم لوحة كمعيار الذهب لتعداد الميكروبية سريعة ودقيقة. الحمض النووي-العلامات الفلورية الأصباغ مثل 4 أو 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)، "الأخضر سيبر" أو أورانج أكريديني التي تربط الأحماض النووية هي18،،من17نموذجية الأصباغ المستخدمة19 ، على الرغم من أن العديد من الدراسات استخدام مؤشرات الفلورسنت غرام توقيع20،،من2122،،من2324. باستخدام هذه الطرق دون تركيز ما قبل الخطوات يؤدي إلى الحدود للكشف عن (لودس) ~ 105 خلايا كل مل. تحسينات في اللد إمكانية استخدام الترشيح. عينة سائل تصفية الفراغ على الغشاء، عادة البولي، ومن الناحية المثالية الأسود إلى الحد من الخلفية. منخفض-خلفية الأصباغ مثل البقع الحمض الخلوي الصبغي المشار إليها أعلاه يمكن تطبيقها مباشرة على تصفية25. لعد دقيق بالعين، الخلايا5 ~ 10 مطلوب للتصفية، مما يعني أن لعينات مخفف أكثر من الخلايا5 ~ 10 كل مل، حجم العينة كبيرا يجب جمعها وتصفيتها. وقد وضعت أجهزة المسح الضوئي الليزر بغية استكشاف جميع مناطق عامل التصفية بشكل منهجي وبالتالي تقليل عدد الخلايا المطلوبة للعد، دفع حدود الكشف وصولاً إلى خلايا2 ~ 10 كل مل26. ومع ذلك، هذه غير متوفرة في معظم المختبرات، وتتطلب الأجهزة المتطورة، فضلا عن البرامج التي تسمح بتأكيد الخبراء بأنه لاحظ الجسيمات هي البكتيريا ولا من الحطام.

للإشارة، البالغين مع الانتان عادة ما تبدأ تظهر الأعراض في < الخلايا 100 مليلتر من الدم، والرضع في < 10 خلايا/مل. سحب دم من الكبار يأخذ 10 مل، ومن رضيع، 1 مل. الأساليب المستندة إلى بكر هي تحول دون وجود البشرية وغير ممرضة النباتات الحمض النووي ومكونات تثبيط PCR في الدم27،28. وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من التقنيات الناشئة، تظل الثقافات المعيار الذهبي لتشخيص التهابات مجرى الدم، لا سيما في المناطق الريفية أكثر أو الدول النامية. للكشف عن الحياة في الكواكب الأخرى، يمكن تقدير حسابات دينامي حراري ميزانية الطاقة للحياة ومن ثم الكتلة الأحيائية المحتملة المتوقعة. 1-100 خلايا/مل يتوقع أن يكون معقولاً [ثرمودنميكلي] في أوروبا29. سهولة يتبين من هذه الأرقام أن الكشف عن إعداد صغيرة جداً من الخلايا في كميات كبيرة من محلول مائي مشكلة هامة لم تحل بعد.

في هذه الورقة، ونظهر الكشف السراتية marcescens و أونيدينسيس شيوانيلا (المسخ البرية من نوع وغير متحركة) بتركيزات 105104، 103و 100 مليلتر الخلايا استخدام قبالة محور المجهر المجسم الرقمي (DHM). الميزة الرئيسية اضعا عبر الفحص المجهري الخفيفة التقليدية هو تصوير واحد من وحدة تخزين العينة سميكة بدقة عالية – في هذا التنفيذ، كانت قاعة عينة 0.8 مم. وشيدت هذه الدوائر عينة من لينة الطباعة الحجرية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) من العفن الدقة تشكيلة ألومنيوم مع تسامح من ± 50 ميكرومتر. هذا يمثل تحسنا تقريبا 100-fold في العمق من الميدان عبر الفحص المجهري الضوء عالية الطاقة. كما يوفر اضعا المرحلة كمية المعلومات، مما يسمح لقياس طول المسار الضوئي (المنتج من الانكسار وسمك). وقد استخدمت اضعا وتقنيات مشابهة لرصد البكتيريا والخميرة دورة الخلية وحساب كتلة جافة البكتيرية30،،من3132؛ حتى يمكن استخدام الاختلافات ونثر للتفرقة بين السلالات البكتيرية33.

أداة نستخدمها مبنية خصيصا للاستخدام مع الكائنات الحية الدقيقة، كما نشرت سابقا34،35، وتصميم وتشييد أظهرت ومناقشتها. يتم توفير المحاليل باستمرار إلى 0.25 ميليلتر حجم عينة دائرة عن طريق مضخة الحقن؛ يتحدد معدل التدفق بمعدل الإطار الكاميرا ضمانا لتصوير حجم العينة كاملة. وتتنبأ عملية حسابية إحصائية عدد وحدات العينة التي يجب أن يتم أخذ صورة عنه بغية الكشف عن عدد كبير من الخلايا بتركيز معين.

طلبات الكشف عن الخلية، لم يكن إعادة إعمار الصور المجسمة إلى صور مرحلة والسعة المطلوبة؛ تم إجراء تحليل على الهولوغرام الخام. وهذا يوفر موارد حسابية كبيرة ومساحة القرص: صورة ثلاثية الأبعاد 500 ميغابايت فيديو سوف يكون 1-2 تيرابايت عندما أعيد بناؤها. ومع ذلك، نحن نناقش إعادة الإعمار من خلال عمق العينة للتأكد من أن الصور المجسمة تمثل الأنواع المرغوبة. سمة هامة من سمات اضعا هو قدرته على رصد كثافة والمرحلة من الصور. الكائنات الحية التي تقريبا شفافة في كثافة (مثل معظم الخلايا البيولوجية) تظهر واضحة في المرحلة. كما أسلوب خال من التسمية، يتم استخدام لا صبغات. وهذادفانتاجي للتطبيقات الممكنة من التحليق في الفضاء، منذ الأصباغ قد لا ينجون من شروط البعثة و – والأهم – لا يمكن الافتراض بالعمل مع الكائنات خارج كوكب الأرض، والتي لا يجوز استخدام الحمض النووي الريبي أو لترميز. كما أنها ميزة للعمل في البيئات المتطرفة مثل القطب الشمالي والقطب الجنوبي، حيث قد يكون من الصعب على جلب إلى الموقع البعيد الأصباغ وقد تتحلل عند التخزين. يتم تنفيذ إعادة الإعمار للصور في المرحلة والسعة استخدام حزمة برمجيات المصدر المفتوح التي حققناها متاح على GitHub (الشامبو) أو باستخدام إيماجيج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-النمو وتعداد البكتيريا

ملاحظة: وهذا ينطبق على ما يقرب من أي سلالة بكتيرية نمت في المتوسط المناسبة 36. في المثال الخاص بنا، نحن نستخدم ثلاث سلالات: السراتية marcescens كسلالة مختبر شخصية مشتركة، من السهل؛ وسلالة بيئية أصغر حجماً ومتحركة عالية، السيد أونيدينسيس شيوانيلا-1. مقارنة كشف متحركة مقابل الخلايا غير متحركة، وغير متحركة متحولة شيوانيلا، Δ فلجم، يستخدم أيضا للمقارنة بين 37. وتزرع جميع سلالات في مرق ليسوجيني (رطل)-

  1. تحضير العقيمة رطل المتوسطة (لتر من الماء المقطر: تريبتوني بكتو ز 10، 5 غ بكتو الخميرة، 10 جرام كلوريد الصوديوم؛ أو عامل تصفية أو اﻷوتوكﻻف). إعداد معيار 100 مم لوحات القطر أجار رطل (نفس الوصفة المتوسطة بالإضافة إلى أجار ز 15 لتر؛ اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية، 20 دقيقة) تعقيم وصب عند باردا بما يكفي للتعامل مع). تخزين المتوسطة ولوحات في الثلاجة.
  2. البذور قبل التجربة اليوم 5-6 مل من " سيد " المتوسطة الثقافة من مستعمرة بكتيرية جديدة، باستخدام تقنية معقمة والسلامة البيولوجية الصحيحة. تبني على شاكر (120 لفة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية لوقت الحضانة h. ~ 12 سوف تعتمد على معدل النمو والإجهاد. في تجاربنا، هي المحتضنة سلالات شيوانيلا لمدة 12 ساعة؛ ومع ذلك، يتم حصاد السراتية بعد 8 ساعات، لضمان الثقافة سوف يكون المعرض النمو منتصف لوغاريتمي.
  3. يوم التجربة، تأخذ قراءة سبيكتروفوتوميتريك (OD 600) من البكتيريا السيطرة على الثقافة، والتي من المتوقع أن تكون في النطاق من 0.6 إلى 0.7. ينبغي أن يكون في مرحلة النمو لوغاريتمي (كما تحدد مسبقاً). إذا لا، ثقافة فرعية 100 ميليلتر في 5 مل متوسطة وتسمح بنمو الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل.
  4. أخذ عينة من سيد الثقافة وحساب الخلايا مباشرة باستخدام العد هاوسير بيتروف الدائرة. وهذا سوف تعداد الخلايا الحية والميتة على حد سواء-
    1. استخراج عينة 10 ميليلتر من ثقافة غير مخفف مع ميكروبيبيتي ونقل إلى الغرفة.
    2. الصورة تحت مجهر هدف السامي-جاف (40 X أو 63 X، نا 0.7-0.8) باستخدام التباين المرحلة.
    3. عد البكتيريا في الساحات والمتوسط على الأقل 20.
      ملاحظة: الاعتماد فقط على تلك البكتيريا التي تقع تماما ضمن ساحة وفقط تلك العبور الأعلى وحدود الأيسر (أو الأسفل ومن اليمين، إذا كنت تفضل). إذا كانت المربعات مفصولة بخطوط عدة، اختر واحداً كحد.
    4. مربعات
    5. تركيز حساب كالمتوسط 20 × معامل التخفيف. علما بأن توجيه التهم لا تعمل جيدا لتركيزات < 10 7/مل.
  5. جعل تخفيف المسلسل من الثقافة لعد تشكيل مستعمرة وحدات (زيمبابوي). وهذا سوف تعداد الخلايا الحية فقط- الحل
    1. جعل مسلسل إضعاف كل من العينات البكتيرية المحدد مع عقيمة المالحة 0.9 في المائة. نقل 20 ميليلتر من الحل البكتيرية وتمييع مع 180 ميليلتر المالحة. كرر حتى يتم تركيز أدنى ~ 10 3 خلايا/مل.
    2. تأخذ 100 ميليلتر من اثنين على الأقل اقترح تخفيف هي 10 3 و 10 4/mL — ولوحة على صفيحة وسائط صلبة مناسبة. أن انتشار الناشرة عقيمة. أداء replicates 3 على الأقل من كل تمييع.
    3. احتضانها في درجة حرارة ملائمة للبكتيريا الخاصة بك بين عشية وضحاها أو حتى تنمو المستعمرات.
    4. عد المستعمرات وحساب مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) حسب (# المستعمرات × معامل التخفيف)/مطلي بحجم = زيمبابوي/مل. متوسط زيمبابوي خلال replicates.

2. إعداد "عينات تمييع عاليا" اضعا

  1. جعل تخفيف المسلسل الرئيسية الثقافة اضعا ووظيفة-اضعا عد من الوحدات المكونة للمستعمرة على لوحات إعلامية رطل (انظر 1.4.1-1-4-4). أداء هذه المزدوجة التعمية حيث يكون الشخص الذي يقوم التسجيلات غير مدركين للتركيز في كل عينة قياس.
    1. تضعف البكتيريا إلى 10-15 مل متوسط الحد الأدنى الذي سيتم تشجيع حركية (حسب الاقتضاء) ولكن تمنع انقسام الخلية، حيث أن تركيز الخلايا لا تغير ملحوظ أثناء التجربة. قد يكون هذا المحلول الملحي 0.9% أو وسيلة حركية أكثر تحديداً. على سبيل المثال، في حالة استخدام الإشريكيّة القولونية، يجب أن تحتوي على حركية متوسطة يدتا 38. لهذه الأمثلة، ونحن نستخدم ملحي 0.9 ٪.

3. تسجيل "ملفات الفيديو اضعا"

  1. باستخدام المحاقن معقمة، سحب حوالي 10 مل تخفيف الفائدة.
  2. الاتصال حقنه إلى الدائرة عينة اضعا استخدام تركيبات عقيمة والأنابيب-
    ملاحظة: شيد غرفة موائع جزيئية مصنوعة خصيصا من أجل السماح بتدفق متسقة من عينة من خلال مسار بصري للصك. راجع المقطع النتائج لمزيد من التفاصيل. قبل هذه التجربة، ينبغي تعقيم جميع مكونات الدائرة عينة بالتعقيم.
  3. تدفق العينة من المحاقن من خلال نموذج الدائرة بشكل مستمر باستخدام مضخة الحقن.
    ملاحظة: تختلف معدلات التدفق المناسب تبعاً لإبعاد قناة فلويديك والإنتاجية المرجوة، فضلا عن محدودية الحصول على البيانات-
  4. كما يتم تدفق العينة من خلال الدائرة عينة، الحصول على الصور المجسمة تباعا بمعدل إطار مناسب. سيتم إنشاء ملف ختم الوقت فيها سجلات الوقت كل صورة التقاط لاستخدامها في وقت لاحق من خلال تحليل البيانات (المادة 4 من البروتوكول). الحصول على جميع الصور المجسمة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). تسجيل الهولوغرام بتنفيذ ملف قابل للتنفيذ c + + قبل خطية المقدمة من الشركة المصنعة للكاميرا.
    ملاحظة: تختلف معدلات الإطار المناسب تبعاً لمعدل التدفق المختار. لهذه التجربة، من المستحسن استخدام معدل إطارات مثل أنه سوف يتم أخذ صورة عنه جرثومة > 2 مرات كما أنه سافر عبر الأداة ' مجال الرؤية s.
  5. السماح بوقت كاف لكامل 10 مل من عينة أن تتدفق من خلال اضعا.
  6. لضمان أن البكتيريا لا تنمو أو تموت أثناء التجارب، تطعيم أثري لوحات وسائل الإعلام مع 100 ميليلتر للمستهلك وسائل الإعلام اضعا وظيفة التقاط الصور. تنتشر مع الناشرة عقيمة واحتضانها في درجة الحرارة الملائمة لمدة 24 ساعة؛ عد المستعمرات الحالية-

4. حساب كثافة الخلية وحدود للكشف عن

  1. مع أشرطة الفيديو المكتسبة بصورة ثلاثية الأبعاد، تحليل البيانات لوجود البكتيريا.
    1. حساب القيمة الوسطية بكسل لسلسلة زمنية من الصور المجسمة، ثم طرح هذه القيمة الوسطية من كل بكسل كل منها للقضاء على القطع الأثرية الثابتة في الصورة الثلاثية الأبعاد. قد يكون ذلك في إيماجيج عن طريق إجراء الخطوات التالية:
      1. تحويل إلى 32-بت (الصورة-نوع--32 بت)
      2. حساب الوسيط (الصورة-مكدس-زبروجيكت-الوسيط)
      3. طرح الوسيط من بقية (مكدس بروسيسيماجيكالكولاتورسوبتراكت)
    2. عدد الحلقات متجددة الهواء مرئية والخلايا في التركيز يدوياً. في إيماجيج، ويتم ذلك بالإشارة إلى الكائنات باستخدام أداة النقطة.
    3. كل سلسلة من الصور المجسمة سيكون مصحوبا بملف ختم الوقت (تسجيل الوقت للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد). استخدام الملف طابع زمني لحساب المبلغ الإجمالي للعينة ضخها في الوقت الصورة تم التقاطها.
  2. حساب كثافة الخلية بقسمة إجمالي عدد الخلايا التي تم الكشف عنها بواسطة الحجم الإجمالي للعينة المصورة. 5-10 إطارات لإحصاءات دقيقة في المتوسط-

5. صورة التعمير إلى السعة والمرحلة

  1. اختر أشرطة الفيديو التمثيلي مع الخلايا 10-200 لكل إطار. تحميل الخام الهولوغرام (لا الوسيط مطروح) إلى برامج إعادة الإعمار (أمثلة: 39 من "نشر ImageJ العددية"؛ شامبو [GitHub]).
    1. "باستخدام إيماجيج"، انتقل إلى "حيود" إكثار العددية OD العددية.
    2. موجه، رسم قناع فورييه اختيار حقيقي أو صورة افتراضية، والقضاء على أية ميزات الضوضاء جيبية.
    3. إعادة بناء السعة والمرحلة في الخطوات z المناسبة عن طريق إدخال المسافة التعمير-
  2. طرح متوسط البيانات السعة للحد من الضوضاء كما هو الحال في 4.1.1.
  3. بيانات الأرض ك 3D المكعب أو الإسقاط. انتقل إلى الإضافات — عارض حجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتبين النتائج أن القدرة على اكتشاف البكتيريا الحية والميتة عند مستويات منخفضة جداً من اضعا. ينبغي أن يكون العدد من البكتيريا عد يتسق مع النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام التهم الدائرة ولوحة العد بيتروف-هاوزر. الأساليب الإحصائية القياسية توفر معلومات حول الدقة أساليب الكشف عن مختلف في تركيزات البكتيرية المختلفة.

ويبين الشكل 1 قاعة العد بيتروف-هوسير المستخدمة فضلا عن المجهرية قاعة الفرز الذي يتم استخدامه في التعداد مباشرة من الخلايا. يبين الشكل 2 ألف لوحة ثقافة مخصب نموذجي تم السماح لها كافية الوقت S. marcescens تنمو المستعمرات (16 ساعة في درجة حرارة الغرفة). ويبين الشكل 2 منحنيات النمو لجميع السلالات المستخدمة. بينما تختلف القياسات الدقيقة جهاز المطياف الضوئي، ينبغي أن تكون العلاقة بين عدد600 ومستعمرة OD خطية ضمن مجموعة موثوقة من جهاز المطياف الضوئي؛ قمنا بقياس ~ OD600 = 0.1 ك/mL8~ 10. بيتروف-هاوسير المباشر التهم والتهم مستعمرة ينبغي أن توافق على حدود 10% حتى الخلايا تبدأ في الموت كما يراها دوران في منحنى النمو.

ويبين الشكل 3 تصميم الدوائر نموذج مخصص. واستخدمت دوائر موائع جزيئية مخصصة لهذه التجربة للسماح بتدفق مستمر من عينة من خلال مجال الرؤية المجهر المجسم. استخدمت تقنيات قياسية موائع جزيئية والمواد في بناء الدوائر عينة. مقلوب بلانت، الفولاذ المقاوم للصدأ الإبر مع الذكور اللوير لوك تجهيزات أدرجت في الجهاز موائع جزيئية لتوفير منافذ مداخل ومخارج للدائرة بعينه. هندسة قناة موائع جزيئية أنشئت قبل الطباعة الحجرية الناعمة من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) استخدام العفن رئيسية ألمنيوم تشكيلة، التي تم ضغطها، عبر إطارات الألومنيوم، بين اثنين من النوافذ الزجاجية الجودة البصرية. PDMS تنشئ الهندسات قناة تدفق فضلا عن يؤمن الإبر إبر، التي توفر نقل السوائل من وإلى قنوات تدفق. تستخدم هذه الدوائر عينة PDMS فقط لإنشاء تدفق القناة الهندسة وهكذا تحتوي على لا PDMS في مسار بصري للصك. لاحظ أنه نظراً لطبيعة الضوئية المجهر المجسم خارج المحور، كانت مصبوب الصغرى قناتين موازية لبعضها البعض في الدائرة بعينه. وهذا يهدف إلى مطابقة أطوال المسار البصري بين ذراعيه من السابر (المشار إليها كالأسلحة 'العينة' و 'مرجع'). قناة الإشارة يجب أن يحتوي فقط على وسائل الإعلام العقيمة، ولا ينبغي أن يخضع تدفق.

ويبين الشكل 4 تخطيطي وصور المجهر المجسم الرقمي في تنفيذه المختبر. تشغلها البرامج المتوفرة مع الكاميرا. يبين الشكل 5 بيانات اضعا تمثيلية للتعداد الجرثومي ومراسلاتهم مع الأرقام المتوقعة من الخلايا كل مجال الرؤية. من الهولوغرام الخام، دون إعادة الإعمار، من الممكن لمعرفة وحساب الخلايا بالطرح الوسطية وتتبع الخط. وهذا يقلل إلى حد كبير عبء الحسابية مقارنة بإعمار جميع z-الطائرات، كما الهولوغرام الخام إظهار الخلايا في جميع أنحاء عمق الدائرة. يتم الإشارة إلى ظهور الثقافات في تركيزات مختلفة ومراسلاتهم مع لوحة العد والعد بيتروف-هاوزر. عدد خلايا الكلي تتحدد بحساب متوسط عدد الخلايا ينظر في حجم كل عينة على العدد الإجمالي لوحدات التخزين تصويرها. يتحدد الحد الأقصى للكشف عن العدد الإجمالي لوحدات تخزين العينة المصورة. ونحن في هذه التجربة، تعيين حد أقصى في هذه القيمة، مع إجمالي الحد أقصى من 10 مل عينة المصورة تزايدات 0.25 ميليلتر (مجموعة صور 40,000 كل عينة). يتم إيقاف التسجيلات قبل أن يتحقق الحجم الإجمالي الأقصى إذا كانت الخلايا ووضوح لوحظت في كل إطار على مدى سلسلة من إطارات 20. في ورقة سابقة، أبلغنا بصيغة لتقدير عدد حجم العينة اللازمة للكشف عن البكتيريا في مستوى ثقة 50% بتركيزات تتراوح بين 1-105 خلايا/مل (الجدول 1). بناء على هذا التقدير، فحصا لكل الإطارات 40,000 ينبغي السماح للكشف عن خلايا في 1/مل، على الرغم من أن هذا الحساب مكثفة حسابياً.

ويبين الشكل 6 استخدام إعادة الإعمار البرمجيات (فيجي)39. فتح صورة واحدة ثلاثية الأبعاد ويتم تشغيل البرنامج "الحيود إكثار العددية OD العددية". وترد معايير التصوير في مربع الحوار؛ السعة، والكثافة، ومرحلة قد كل بناؤها. ويمكن اختيار طائرة واحدة z، أو دفعة إعادة البناء يمكن أن تستخدم لإعادة بناء عمق كامل.

يبين الشكل 7 عمليات إعادة البناء من السعة ومرحلة الصور في أعماق مختلفة في عينة مختارة. يظهر القناع فورييه المستخدمة لتوليد عمليات إعادة البناء في، جنبا إلى جنب مع صورة طرح متوسط كثافة وصورة مرحلة وإسقاط الحد أقصى عن طريق المكدس المرحلة وإسقاطات حجم المكدس كثافة.

Figure 1
رقم 1: توجيه عد الخلايا البكتيرية. يتم حساب تركيز البكتيريا في خلايا/مل بحساب العدد الكلي للبكتيريا في عد الدائرة وتحجيم المحاسبة رقم لحقيقة أن الدائرة بيتروف-هاوزر يحتوي فقط على 20 nL عينة. (أ) بيتروف-هاوسير عد الدائرة. الصورة (ب) لعد الدائرة المجهرية تحت 10 × المرحلة على النقيض، تظهر مربعات ذات أحجام مختلفة مفيدة لتعداد الخلايا ذات أحجام مختلفة. (ج) ظهور S. marcescens داخل مربعات أصغر عد الأصوات في الدائرة؛ 40 X المرحلة التباين. (د) طريقة للعد الذي يستبعد الخلايا التي تقع على الحواف اليمنى والعليا (ن)، ولكن ليس أقل والأيسر الحواف (Y). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: عد الخلايا بنمو مستعمرة والكثافة البصرية- (أ) S. marcescens المحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. في إضعاف الصحيح، ينبغي أن لوحات الثقافةوقد المستعمرات 20-200 للعد دقيقة وإحصاءات. لوحة يظهر إلى حد ما مزدحمة للغاية لعد موثوق بها. (ب) نمو منحنيات لسلالات 3 المستخدمة. يناظر بكثافة بصرية من 0.1 ~ 108 خلايا/مل، ولكن تختلف قيم الضبط بالصك. المباشر بيتروف-هاوزر التهم نتفق مع لوحة التهم إلى حدود 10% في نطاق النمو الطولي. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للعينات المستقلة 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نموذج تصميم الدائرة. (أ) موائع جزيئية التخطيطي (ميكروتشانيلس مرجع للعينة والمسمى). (ب) عينة مجمع بشكل كامل الدائرة. (ج) "انفجرت كاد" عرض عرض العناصر المكونة للدائرة بعينه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التخطيطي وصور المجهر المجسم الرقمي- التخطيطي (A) يبين العناصر الرئيسية الأربعة: المصدر، والعينة (يسمى مسار العينة المواصفات ويسمى مسار مرجع الرقم)، المجهر، وأجهزة الاستشعار. (ب) نموذج الصلبة للأجهزة. الجمعية مصدر تغذية الألياف في الجزء السفلي، وكاميرا التصوير من أعلى. مجهر البصريات – تتألف من اثنين من العدسات اللاصقة وعدسة التتابع – ترد داخل أنبوب طويل عدسة 300 ملم. المرحلة ثلاثة محاور بين المصدر البصريات مجهر يوفر سهولة التلاعب اليدوي للعينة قيد الدراسة. (ج) صورة فوتوغرافية للصك في المختبر. يمثل الشريط الجدول في الجزء السفلي من الصورة 1 بوصة. الخطط إعادة المستمدة من والاس et al. 34- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: منحنيات النمو وبيانات تمثيلية اضعا. خلايا بريديكتيد (A) كل حقل من عرض استناداً إلى حجم عينة ميكرومتر µm x 365 365 × 1 مم. يتم عرض نطاق الأمثل لتعداد اضعا في المستطيل، وترد عينات حقيقية ك (ب) و (ج). (ب) اضعا صورة ثلاثية الأبعاد من شيوانيلا الثقافة في 8 × 105 خلايا/مل قياسا بيتروف-هاوزر و 7.7 × 105 خلايا/مل قياسا بتعداد الصحن؛ تظهر هذه الصورة 110 الخلايا، احتواء ممتازة للتنبؤ. (ج) اضعا المجسمة لثقافة شيوانيلا في هو x 10 2.05 خلايا/مل تقاس بيتروف-هاوزر و 2.0 ±0.3 x 105 خلايا/مل قياسا بتعداد الصحن؛ هذه الصورة تظهر الخلايا 27. شريط المقياس = 35 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: القيام بعمليات إعادة البناء- (أ) فتح صورة ثلاثية الأبعاد في فيجي. (ب) "تشغيل النشر الرقمية" وقم بإدخال الحجم الطول الموجي والصورة. اختر مسافة z قريبة من 0 بدء تشغيل. (ج) رسم قناع فورييه عندما تتم مطالبتك لتحديد صورة افتراضية أو حقيقية. حمام (د) تجهيز يسمح لعمليات إعادة البناء في جميع أنحاء وحدة التخزين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: ظهور عمليات إعادة البناء- صور للثقافة السراتية في ~ 106 خلايا/مل. (أ) الخام صورة ثلاثية الأبعاد. تحويل فورييه (ب). هي منطقة داخل الدائرة المنطقة لاستخدامها؛ يتم حجب بقية. (ج) إعادة الإعمار السعة في z-طائرة واحدة. (د) المرحلة التعمير في طائرة z واحدة؛ ويبين شريط مقياس مرحلة التحول في درجات. () كحد أقصى كثافة الإسقاط من خلال جميع الطائرات z في المكدس المرحلة. (و) حجم عرض المكدس السعة الكاملة (365 × 365 × 800 ميكرون). شريط المقياس = 35 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تركيز [خلايا كل مل] الإطارات اللازمة
1.00 E + 00 6,686
1.00 E + 01 669
1.00 E + 02 67
1.00 E + 03 7
1.00 E + 04 1
1.00 E + 05 1

الجدول 1: رقم الحد الأدنى لحجم العينة المطلوبة للكشف عن البكتيريا التي اضعا (الكشف عن الثقة من 50%).

الملكية القيمة وحدة
تشغيل الطول الموجي 405 شمال البحر الأبيض المتوسط
هدف الفتحة العددية 0.3 -
نظام التكبير 20 -
القرار الأفقي 0.7 ميكرومتر
حجم عينة التصوير 360 × 360 × 800 ميكرو x μm x μm
طول الأداة 400 مم

الجدول 2: مواصفات البصري والأداء للمجهر المجسم الرقمي-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعادة البناء العددي من الهولوغرام: لتعمير الهولوغرام العددية، يتم استخدام الأسلوب الطيف الزاوي (ASM). ويشمل هذا الالتواء من الصورة الثلاثية الأبعاد مع الدالة الأخضر اضعا. يمكن حساب واجهة الموجه المعقدة للصورة في طائرة خاصة تنسيق باستخدام "نظرية فورييه الالتواء" كالتالي:

Equation 2(1)

حيث Equation 3 هو عامل "تحويل فورييه"، Equation 4 هو مصفوفة ثلاثية الأبعاد، و Equation 5 هو دالة للأخضر اضعا، الذي يعرف بأنه:

Equation 6(2)

حيث Equation 7 هي المسافة، على طول المحور البصري، من الطائرة التنسيق المطلوب يتم بناؤها، Equation 8 هو الطول الموجي الإضاءة، Equation 9 و Equation 10 هي عدد وحدات البكسل في x واتجاهات y، على التوالي، و Equation 11 و Equation 12 هي أحجام بكسل (في الطائرة كاشف) في x و y التوجيهات، على التوالي40.

من جبهة الموجه المعقدة، يمكن حساب الكثافة حجم التربيعية من Equation 13 ، ويمكن الحصول عليها في المرحلة بقوس المماس للقسمة بين أجزاء وهمية وحقيقية Equation 13 .

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
التجارب التي تشمل تعداد تركيزات بكتيرية متفرقة عرضه للتلوث والمغلوطة والسلبيات الكاذبة. لهذا السبب، النمو وتعداد البكتيريا، فضلا عن إعداد عينات مخفف جداً اضعا هي الخطوات الحاسمة في هذه التجربة. ويجب توخي الحذر لتجنب التلوث في هذه التجربة عن طريق التحكم بعناية بالبيئة حيث نمت البكتيريا وتعداد. تقنيات التعقيم السليم، بما في ذلك التعقيم، تساعد على منع ضد التلوث، فضلا عن إيجابيات كاذبة. إلى منع ضد المغلوطة، اختيرت البكتيريا لهذه التجربة التي يحمل خصائص فريدة نسبيا (مثلاً، S. marcescens له لون أحمر مميزة جداً عند مثقف). لمنع ضد السلبيات الكاذبة، اختيرت البكتيريا الذي اختير لهذه التجربة أن أنها ستكون قادرة على تنمو على لوحات إثراء الثقافة، فضلا عن الأشكال المميزة و/أو أنماط حركية يمكن تحديدها عن طريق اضعا. من المهم اختبار دورياً للتلوث و/أو نمو الخلايا غير متوقع بطلاء العينات وتحديد كمية البكتيريا بتعداد الصحن.

ويتوقع في إجراء هذه التجربة، حجم بيانات من حوالي 2.4 غيغابايت لكل 1 مل من العينة. وبطبيعة الحال، هذا العدد، تعتمد على تنسيق الملف والكاميرا المستخدمة. حجم البيانات التي ذكرت باستخدام جهاز كشف 4 Mpx وتنسيق ملف TIFF قياسية. ويتطلب تجهيز البيانات تقريبا 6 دقيقة لاحتساب كل 1 مل من العينة. وقد لوحظ هذا وقت المعالجة أثناء استخدام معالج إنتل i7 أساسية 8 في 3.5 جيجاهرتز و 32 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي. يمكن باراليليزيد هذه الحسابات إلى زوجته إلى حد كبير تخفيض أوقات المعالجة، ولكن لم يحدث هنا.

القيود المفروضة على هذه التقنية
بينما من الممكن استخدام اضعا للكشف عن تركيزات منخفضة جداً من البكتيريا، هذا الأسلوب غير محددة. مورفولوجيا وحدها ليست وسيلة حاسمة لتحديد السلالات البكتيرية. تطبيقات تشخيص تحديات محددة بسبب وجود خلايا غير المستهدفة والمجاميع. ومع ذلك، ميزة الصك المزدوج-شعاع المعروضة هنا أنه قادرة على صورة البكتريا في عينات عكر نسبيا. القدرة على اكتشاف البكتيريا في العينات السريرية، ودرجة المعالجة التمهيدية للعينات المطلوب، لا يزال يتعين تحديد.

خطوات حاسمة في البروتوكول
الخطوة 2: الحصول على تخفيف دقيقة أمر ضروري للتعداد الكمي. تخفيف أي التي يجب أن تكون مدعومة بلوحة العد. الخطوة 3: يجب أن يتم الاختيار من معدل التدفق ومعدل الإطار المقابل بعناية لضمان أن يتم النظر إلى كافة الخلايا. ينبغي تعديل المعلمات مضخة ضبطها بعناية قبل تنفيذ حد من الكشف عن التجربة. الخطوة 4: لتركيزات بكتيرية منخفضة جداً، من الأهمية بمكان لالتقاط بيانات كافية لأن تكون واثقة من الكشف. قد يكون من الضروري لإعادة بناء بعض البيانات أن تكون على يقين من أن الخلايا، وليس من الحطام، ينظر. وفي الحالات القصوى، قد يلزم أكثر من 10 مل من محلول. عدم متحركة سلالات من المحتمل أكثر أن تكون غامضة من سلالات متحركة. خطوة 5: إذا لم يكن هناك أي غموض في البيانات، إعادة الإعمار يمكن أن تساعد في إثبات أن الهولوغرام تمثل الخلايا وليس من الحطام. عمليات إعادة البناء سوف تظهر مورفولوجيس خلية الكلاسيكية، وحركية يمكن رؤية ذلك بوضوح في مسارات سلالات متحركة عالية الدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب تقر Gordon وبيتي مور مؤسسة المنح 4037 و 4038 إلى "معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا" لتمويل هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
  4. Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
  5. Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
  6. Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
  7. Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
  9. Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
  10. Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
  11. Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
  12. Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. (2013).
  13. Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
  14. McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
  15. Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
  16. Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
  17. Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
  18. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
  19. Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  20. Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
  21. Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
  22. Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
  23. Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
  24. Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
  25. Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
  26. Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
  27. Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
  28. Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
  29. Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. (2017).
  30. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
  31. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
  32. Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
  33. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
  34. Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
  35. Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
  36. Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
  37. Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
  38. Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
  39. Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
  40. Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics