Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)

Bioengineering

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Summary

Microscopia holográfica digital (DHM) é uma técnica volumétrica que permite amostras de imagens realizadas 50-100x mais espesso que brightfield microscopia em resolução comparável, com o foco de pós-processamento. Aqui DHM é usado para identificar, contando e acompanhamento de microorganismos em muito baixas densidades e em comparação com medições de densidade óptica, contagem de placa e contagem direta.

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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Abstract

Com a detecção e contagem de amostras bacterianas esparsas tem muitas aplicações na comida, bebidas e indústrias de processamento farmacêutico, em diagnósticos médicos e para a detecção de vida por missões robóticas para outros planetas e luas do sistema solar. Atualmente, esparsas amostras bacterianas são contadas por microscopia de chapeamento ou epifluorescência de cultura. Placas de cultura exigem longo tempo de incubação (dias ou semanas) e microscopia de epifluorescência requer mancha extensa e concentração da amostra. Aqui, demonstramos como usar fora do eixo microscopia holográfica digital (DHM) para enumerar as bactérias em culturas muito diluídas (100-104 células/mL). Em primeiro lugar, a construção da DHM personalizado é discutida, juntamente com instruções detalhadas sobre a criação de um instrumento de baixo custo. São discutidos os princípios da holografia, e um modelo estatístico é usado para estimar quanto tempo vídeos devem ser para detectar células, com base nas características desempenho óptico do instrumento e a concentração da solução bacteriana (tabela 2) . A detecção de células em 105, 104, 103e 100 células/mL é demonstrada em tempo real usando hologramas un-reconstruídos. Reconstrução de imagens de amplitude e fase é demonstrada usando um pacote de software open-source.

Introduction

Determinação da precisa contagens bacterianas em amostras muito diluídas é crucial em muitas aplicações: alguns exemplos são a água e a comida qualidade análise1,2,3; deteção de patógenos no sangue, líquido cefalorraquidiano ou escarro4,5; produção de produtos farmacêuticos, incluindo água estéril6; e análise ambiental da Comunidade em ambientes oligotróficos como o aberto oceano e sedimentos7,8,9. Existe também uma crescente interesse para detecção de possível vida microbiana existente nas luas geladas de Júpiter e Saturno, particularmente Europa10,11 e Enceladus12,13, 14, que são conhecidos por terem subsuperficiais oceanos líquidos. Porque nenhuma missão desde Viking em 1978 tem tentado encontrar existe vida em outro planeta, tem havido desenvolvimento limitado de tecnologias e instrumentos de identificação bacteriana e contando durante espaço missões15.

Os métodos tradicionais de contagem de placa encontrar apenas células viáveis, que podem representar uma minoria das espécies em cepas ambientais, às vezes < 1%16. Placas requerem dias ou semanas de incubação para o máximo de sucesso, dependendo da estirpe. Microscopia de epifluorescência substituiu, em larga medida, contagens das placas como o padrão ouro para enumeração microbiana rápida e exata. Corantes de fluorescentes nucleic-ácido-rotulagem como laranja de acridina, dicloridrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), SYBR Green ou 4 ' que se ligam aos ácidos nucleicos são os corantes típicos usados17,18,19 , apesar de muitos estudos utilizam indicadores fluorescentes de grama assinar20,21,22,23,24. Usando esses métodos sem etapas de pré-concentração leva à limites de detecção (LoDs) de ~ 105 células por mL. Melhorias no LoD são possíveis usando filtragem. Uma amostra de líquido é filtrada vácuo em uma membrana, geralmente em policarbonato e idealmente preto para reduzir a fundo. Baixo-fundo corantes tais como as manchas de DNA mencionadas acima podem ser aplicadas directamente para o filtro de25. Para contagem exata pelo olho, as células de5 ~ 10 são necessárias por filtro, o que significa que, para amostras mais diluídas do que 10 ~5 células por mL, volumes significativos de amostra devem ser recolhidas e filtradas. Dispositivos de varredura a laser foram desenvolvidos a fim de explorar sistematicamente todas as regiões do filtro e, assim, reduzir o número de células necessárias para a contagem, empurrando os limites de detecção até ~ 102 células por mL26. No entanto, estes não estão disponíveis na maioria dos laboratórios e exigem hardware sofisticado, assim como software que permitem a confirmação de perita que observou partículas é as bactérias e não os restos.

Para referência, adultos com sepse geralmente começam a mostrar sintomas de < 100 células/mL de sangue e bebês em < 10 células/mL. Uma recolha de sangue de um adulto leva 10 mL e de uma criança, 1ml. Métodos baseados em PCR são inibidos pela presença de humano e não-patogênicas flora DNA e pelos componentes do PCR-inibindo o sangue27,28. Apesar de uma variedade de técnicas emergentes, culturas permanecem o padrão ouro para o diagnóstico de infecções da corrente sanguínea, especialmente em zonas mais rurais ou nações em desenvolvimento. Detecção de vida em outros planetas, cálculos termodinâmicos podem estimar o orçamento de energia para a vida e, portanto, a biomassa possível esperada. 1 - 100 células/mL são esperados ser termodinamicamente razoável na Europa29. Pode ser facilmente visto destes números que a detecção de um pequeno número de células em grandes quantidades de solução aquosa é um importante problema sem solução.

Neste artigo, demonstramos a detecção de Serratia marcescens e Shewanella oneidensis (tipo selvagem e non-motile mutante) em concentrações de 105, 104, 10 e 100 células/mL usando um fora do eixo3 microscópio digital holográfico (DHM). A principal vantagem da DHM por microscopia de luz tradicional é a imagem simultânea de um volume de amostra espesso em alta resolução — nessa implementação, a câmara de amostra foi de 0,8 mm de espessura. Estas câmaras de amostra foram construídas pelo macio-litografia de polidimetilsiloxano (PDMS) de um molde de alumínio de precisão usinadas com uma tolerância de ± 50 µm. Isto representa uma melhoria de aproximadamente 100 vezes em profundidade de campo através de microscopia de luz de alta potência. DHM também fornece informações de fase quantitativa, permitindo a medição do comprimento do percurso óptico (produto do índice de refração e espessura). DHM e técnicas semelhantes têm sido utilizadas para monitoramento de bacteriano e ciclo celular de levedura e cálculo de massa seca bacteriana30,31,32; diferenças de dispersão mesmo podem ser usadas para diferenciar estirpes bacterianas33.

O instrumento que usamos é costume-construído especificamente para uso com microorganismos, como publicado anteriormente34,,35, e seu design e construção são demonstrados e discutidos. Soluções aquosas são continuamente fornecidas a uma câmara de amostra de volume µ l 0,25 através de bomba de seringa; a taxa de fluxo é determinada pela taxa de quadros da câmera para assegurar imagens volume da amostra inteira. Um cálculo estatístico prevê que o número de volumes de amostra que deve ser fotografada a fim de detectar um número significativo de células em uma dada concentração.

Para aplicações de célula-deteção, reconstrução de hologramas em amplitude e fase de imagens não era exigida; análise foi realizada no holograma cru. Isso economiza espaço em disco e recursos computacionais significativos: um holograma de 500 Mb vídeo será 1 a 2 Tb quando reconstruído. No entanto, podemos discutir reconstrução através da profundidade da amostra para confirmar que os hologramas representam a espécie desejada. Uma característica importante da DHM é sua capacidade de monitorar tanto a intensidade e a fase das imagens. Organismos que são quase transparentes em intensidade (como a maioria das células biológicas) aparecem claramente em fase. Como é uma técnica livre de rótulo, não são utilizados corantes. Este é um umdvantage para aplicações de voo de espaço possível, desde que corantes podem não sobreviver as condições de uma missão e — mais importante — não pode ser presumida a trabalhar com organismos extraterrestres, que não podem usar o DNA ou RNA para codificação. Também é uma vantagem para o trabalho em ambientes extremos, tais como o Ártico e Antártico, onde corantes podem ser difíceis de trazer para o local remoto e podem degradar após armazenamento. Reconstrução de imagens em fase e amplitude é executada usando um pacote de software open-source que disponibilizamos no GitHub (SHAMPOO) ou usando o ImageJ.

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Protocol

1. crescimento e enumeração de bactérias

Nota: isso se aplica a quase qualquer estirpe bacteriana crescida no médio adequado 36. No nosso exemplo, usamos três estirpes: Serratia marcescens como uma cepa comum, fácil laboratório identificáveis; e uma menor, altamente motile tensão ambiental, Shewanella oneidensis MR-1. Para comparar a deteção de motile vs pilhas non-motile, um non-motile Shewanella mutante, Δ FlgM, também é usado para comparação 37. Todas as cepas são cultivadas em caldo lisogenia (LB).

  1. Preparar estéril LB médio (por litro de água destilada: 10g bacto triptona, levedura da Difco 5 g, 10 g NaCl; filtro ou autoclave). Prepare padrão 100 mm placas diâmetro LB-ágar (mesma receita como médio mais ágar 15 g por litro; autoclave (121 ° C, 20 min) para esterilizar e despeje quando fresco o suficiente para lidar com). Loja meio e placas na geladeira.
  2. No dia anterior o experimento semente 5-6 mL de " mestre " meio de cultura de uma colônia bacteriana fresco, usando a técnica correta de estéril e biossegurança. Incube um agitador (120 rpm), a 30 ° C para o tempo de incubação ~ 12 h. será dependente da taxa de deformação e crescimento. Em nossos experimentos, as cepas de Shewanella são incubadas durante 12 horas; no entanto, Serratia é colhida após 8 horas, para garantir a cultura estará expondo crescimento meados-logarítmica.
  3. No dia do experimento, fazer uma leitura espectrofotométrica (OD 600) da bacteriano dominar a cultura, que deverá estar na faixa de 0.6 a 0.7. Deve ser na fase logarítmica de crescimento (conforme determinado anteriormente). Se não, subcultura 100 µ l em 5 mL de meio e permitir o crescimento de células para a fase de log de mid.
  4. Tirar uma amostra do mestre cultura e contar as células diretamente usando uma contagem de Petroff-Hausser de câmara. Isto irá enumerar células vivas e mortas.
    1. Extrair uma amostra de 10 µ l da cultura não diluída com uma micropipeta e transferência para a câmara.
    2. Imagem sob um microscópio de objetiva de alta-seco (40 X ou 63 X, at 0,7 - 0,8) usando o contraste de fase.
    3. Contar as bactérias pelo menos 20 quadrados e média.
      Nota: Conte somente as bactérias que são inteiramente dentro de um quadrado e somente aqueles atravessando o topo e limites esquerdos (ou inferior e direito, se você preferir). Se quadrados são separados por várias linhas, escolher um como uma fronteira.
    4. Concentração de calcular a média de 20 quadrados x fator de diluição. Nota que direcionam a contagens não funcionam bem para as concentrações < 10 7 / mL.
  5. Fazer diluições em série da cultura para a contagem de formadoras de Colônia (UFC) de unidades. Isto irá enumerar células vivas só. Solução de
    1. fazer uma diluição serial de cada uma das amostras bacterianas selecionadas com solução salina 0,9%. Transferência de 20 µ l da solução bacteriana e diluí-la com soro fisiológico 180 µ l. Repita até que a concentração mais baixa é de 10 ~ 3 células/mL.
    2. Levar 100 µ l de pelo menos duas diluições-sugeriu é 10 3 e 10 4 /mL — e placa sobre uma placa de cultura em meio sólido apropriado. Espalhar com um espalhador estéril. Realizar pelo menos 3 repetições de cada diluição.
    3. Incubar a uma temperatura adequada para seus bactérias durante a noite ou até colônias cresçam.
    4. a contagem das colónias e calcular unidades (CFU), de acordo com (n º de colônias x fator de diluição) formadoras / volume chapeado = CFU/mL. Média UFC sobre as repetições.

2. Preparação de amostras altamente diluído por DHM

  1. fazer diluições em série do mestre cultura para DHM e post-DHM contagem de unidades formadoras de colônia em placas de mídia LB (ver 1.4.1 - 1.4.4). Executar este duplo-cego, para que a pessoa que faz as gravações desconhece a concentração em cada amostra medida.
    1. Diluir as bactérias em 10-15 mL de um meio mínimo que irá incentivar a motilidade (conforme apropriado), mas inibir a divisão celular, para que a concentração de células não altera sensivelmente durante o experimento. Este pode ser o soro fisiológico a 0,9% ou um meio mais específico de motilidade. Por exemplo, se utilizar a Escherichia coli, médio da motilidade deve conter EDTA 38. Para estes exemplos, nós usamos o soro fisiológico a 0,9%.

3. Gravar vídeos DHM

  1. usando uma seringa estéril, puxe em cerca de 10 mL da diluição de interesse.
  2. Conectar a seringa à câmara de amostra DHM usando encaixes estéril e tubos.
    Nota: Uma câmara microfluidic sob medida foi construída para permitir o fluxo consistente de amostra através do caminho óptico do instrumento. Consulte a seção de resultados para obter mais detalhes. Antes do experimento, todos os componentes da câmara de amostra devem ser esterilizados em autoclave.
  3. A amostra da seringa através da câmara de amostra continuamente usando uma bomba de seringa de fluxo de
  4. .
    Nota: Taxas de fluxo apropriado variam dependendo das dimensões do canal fluídico, taxa de transferência desejada, bem como limitações de aquisição de dados.
  5. Como a amostra é fluiu através da câmara de amostra, adquirir hologramas consecutivamente a uma taxa de quadro apropriado. Será criado um arquivo de carimbo de tempo quais registros o tempo de cada imagem capture para ser usado mais tarde durante a análise de dados (protocolo seção 4). Obter todos os hologramas à temperatura ambiente (23° C). Gravar hologramas executando um arquivo executável de pré-escrita C++ fornecido pelo fabricante da câmera.
    Nota: Taxas de quadros adequadas variam dependendo da taxa de fluxo escolhida. Para este experimento, recomenda-se usar uma taxa de quadros, tal que uma bactéria iria ser fotografada > 2 vezes mais que viajou através do instrumento ' campo de visão de s.
  6. Permitir tempo suficiente para o inteiro 10 mL da amostra a ser vertido a DHM.
  7. Para garantir que as bactérias não crescem ou morrendo durante os experimentos, inocular enriquecido placas de mídia com 100 µ l da captura de imagens de post-DHM mídia irradiado. Espalhar com um espalhador estéril e incubar a temperatura apropriada para 24 horas; contagem das colónias presentes.

4. Cálculo da densidade celular e limites de detecção

  1. com os vídeos adquiridos holograma, analisar os dados para a presença de bactérias.
    1. Calcular o valor mediano de pixel para uma série de tempo de hologramas, em seguida, subtrair deste valor mediano de cada pixel respectivo para eliminar artefatos estacionários no holograma. Isso pode ser feito no ImageJ executando as seguintes etapas:
      1. converter para 32-bit (bit de imagem-tipo-32)
      2. ,
      3. calcular a mediana (imagem-pilha-Zproject-mediana)
      4. subtrair a mediana do resto do (pilha Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. contar o número de anéis arejados visíveis e células em foco manualmente. No ImageJ, isso é feito por apontar para os objetos com a ferramenta ponto.
    3. Cada série de hologramas será acompanhado por um arquivo de carimbo de tempo (gravado no momento da aquisição do holograma). Usar o arquivo de carimbo de tempo para calcular a quantidade total de amostra bombeado ao tempo a imagem foi capturado.
  2. Calcular a densidade de células, dividindo o número total de células detectadas pelo volume total da amostra fotografada. Média de 5-10 frames para estatísticas precisas.

5. Reconstrução de Amplitude e fase de imagem

  1. escolher vídeos representativos com 10-200 células por quadro. Carregar hologramas crus (não mediana-subtraído) para o software de reconstrução (exemplos: propagação numérica ImageJ 39; CHAMPÔ [GitHub]).
    1. Usando o ImageJ, vá para OD-numérica difração propagação numérica.
    2. No prompt, desenhar uma máscara de Fourier para escolher o real ou imagem virtual e eliminar quaisquer características de ruído sinusoidal.
    3. Reconstruir a amplitude e fase na z-medidas adequadas, inserindo a distância de reconstrução.
  2. Mediana subtrair os dados de amplitude para reduzir o ruído como em 4.1.1.
  3. Dados do enredo como um 3D cubo ou projeção. Vá para Plugins — Volume Viewer.

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Representative Results

Os resultados devem indicar a capacidade de detectar bactérias vivas e mortas em níveis muito baixos por DHM. O número de bactérias contadas deve coadunar-se com os resultados obtidos usando as contagem de Petroff-Hauser câmara e placa contagens. Métodos estatísticos padrão fornecem informações sobre a precisão dos métodos de deteção diferentes concentrações bacterianas.

A Figura 1 mostra a câmara de contagem de Petroff-Hausser usado bem como a microestrutura da câmara de contagem que é usada na enumeração direta das células. Figura 2A mostra uma placa de cultura enriquecido típico que se permitiu suficiente tempo para S. marcescens crescer colônias (16 horas em temperatura ambiente). Figura 2B mostra as curvas de crescimento para todas as estirpes utilizadas. Enquanto as medições exatas espectrofotômetro variam, a relação entre600 e colônia contagem de OD deve ser linear dentro do intervalo de confiança do espectrofotómetro; Nós medimos ~ OD600 = 0.1 como /mL de8~ 10. O direto Petroff-Hausser conta e colônia contagens devem concordar em dentro de 10% até as células começam a morrer como visto pelo volume de negócios na curva de crescimento.

A Figura 3 mostra o projeto da câmara de amostra personalizada. Microfluidic personalizado câmaras foram usadas para este experimento para permitir o fluxo contínuo de amostra através do campo de visão do microscópio holográfico. Materiais e técnicas padrão microfluidic foram usados na construção das câmaras de amostra. Sem corte com ponta de aço inoxidável agulhas com encaixes de Luer-Lok machos foram inseridas no dispositivo microfluidic fornecer portas de entrada e saída para a câmara de amostra. A geometria do canal microfluidic foi estabelecida pela litografia macia do polydimethylsiloxane (PDMS), usando um molde de alumínio mestra, que foi comprimido, através de quadros de alumínio, entre duas janelas de vidro de qualidade óptica. O PDMS estabelece geometrias de canal de fluxo, bem como protege as agulhas hipodérmicas, que fornecem fluido transporte de e para os canais de fluxo. Estas câmaras de amostra usam PDMS unicamente para estabelecer a geometria do canal de escoamento e, portanto, não conter nenhum PDMS no caminho óptico do instrumento. Observe que, devido à natureza óptica de um microscópio holográfico fora do eixo, dois microcanais foram moldados paralelos uns aos outros na câmara de amostra. Este destina-se a combinar comprimentos de trajeto ótico entre ambos os ramos do interferômetro (referido como o 'modelo' e 'referência' armas). O canal de referência deve conter apenas a mídia estéril e não deve ser sujeitos a fluxo.

A Figura 4 mostra um diagrama esquemático e imagens do microscópio holográfico digital em sua implementação de laboratório. É operado pelo software fornecido com a câmera. A Figura 5 mostra os dados representativos DHM para enumeração bacteriana e sua correspondência com um número previsto de células por campo de visão. Dos hologramas crus, sem reconstrução, é possível ver e contar as células por subtração mediana e controle manual. Isto reduz a carga computacional comparada a reconstruir todos os z-aviões, como os hologramas crus mostram as células em toda a profundidade da câmara. A aparência das culturas em diferentes concentrações e sua correspondência com placa de contagem e Petroff-Hauser são indicados. Contagem de células totais é determinadas pela média do número de células visto em cada volume de amostra sobre o número total de volumes fotografada. O limite de detecção é determinado pelo número total de volumes de amostra fotografada. Neste experimento, podemos definir um limite máximo nesse valor, com um total máximo de 10 mL da amostra fotografada em incrementos de 0,25 µ l (de um total de 40.000 imagens por exemplo). As gravações estão paradas antes que o volume total máximo é alcançado se as células são claramente observadas em cada quadro sobre uma série de 20 quadros. Em trabalho anterior, relatamos uma fórmula para calcular o número de volumes de amostra necessária para detectar as bactérias em um nível de confiança de 50% em concentrações que variam de 1-105 células/mL (tabela 1). Com base nesta estimativa, um exame de todos os 40.000 quadros deve permitir detecção de células no 1/mL, embora este cálculo é computacionalmente intensivo.

A Figura 6 mostra o uso de reconstrução software (Fiji)39. Um único holograma é aberto e o software "Difração de propagação-numérica OD-numérica" é executada. Os parâmetros de imagem são dadas na caixa de diálogo; intensidade, amplitude e fase podem todos ser reconstruídas. Um avião z único pode ser escolhido, ou reconstruções de lote podem ser usadas para reconstruir de toda a profundidade.

A Figura 7 mostra reconstruções de amplitude e fase de imagens em diferentes profundidades em uma amostra seleccionada. A máscara de Fourier usada para gerar as reconstruções é mostrada, junto com uma imagem de intensidade mediana-subtraída, uma imagem da fase, uma projeção máxima através da pilha de fase e uma projeção de volume da pilha de intensidade.

Figure 1
Figura 1: direto a contagem de células bacterianas. Concentração bacteriana em células/mL é calculada contando o número total de bactérias na câmara de contagem e dimensionamento esse número contabilidade para o fato de que a câmara de Petroff-Hauser contém apenas 20 nL da amostra. (A) The Petroff-Hausser contando a câmara. (B) imagem de contagem câmara microestrutura sob 10 X contraste de fase, mostrando caixas de diferentes tamanhos úteis para enumerar as células de tamanhos diferentes. (C) aparência de S. marcescens dentro as caixas menores contagem de câmara; 40 x contraste de fase. (D) método de contagem que exclui células caindo sobre as bordas superiores e direita (N), mas não as inferiores esquerdas bordas e (Y). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: contagem de células de crescimento de colônia e densidade óptica. (A) S. marcescens incubados à temperatura ambiente durante 16 horas. A diluição correta, placas de cultura deveTenho 20-200 colônias para contagem exata e estatísticas. A placa mostrada é um pouco lotado para contagem confiável. (B) crescimento das curvas para as 3 estirpes usadas. Uma densidade óptica de 0.1 corresponde a 10 ~8 células/mL, mas valores exatos variam de acordo com o instrumento. Contagens de Petroff-Hauser diretas de acordo com contagens de placas para dentro de 10% dentro da faixa de crescimento linear. Barras de erro representam o desvio padrão de 5 amostras independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: projeto câmara da amostra. (A) Microfluidic esquemático (amostra e referência microcanais rotulado). (B) câmara de amostra totalmente montado. (C) explodiu CAD Ver os mostrando os elementos constitutivos da câmara de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: esquema e imagens do microscópio holográfico digital. (A) diagrama esquemático mostrando quatro elementos principais: a fonte, a amostra (caminho do espécime é rotulado especs e caminho de referência é rotulado ref.), o microscópio e o sensor. (B) modelo sólido do hardware. O assembly de fibra-alimentados fonte é na parte inferior, e a câmera de imagem está no topo. A ótica do microscópio – composta por duas lentes asféricas e as lentes de relé – estão contidos dentro do tubo de lente longa de 300 mm. O estágio de três eixos, entre a fonte a ótica do microscópio fornece fácil manipulação manual da amostra em estudo. (C) fotografia do instrumento no laboratório. A barra de escala na parte inferior da imagem representa 1 polegada. As plantas são re-extraídas Wallace et al . 34. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: curvas de crescimento e dados representativos da DHM. Previsto (A) células por campo de visão, com base em um volume de amostra de 365 µm x 365 µm x 1 mm. A gama óptima para enumeração DHM é mostrada no retângulo, e amostras reais são indicadas como (B) e (C). (B) DHM holograma de um Shewanella cultura 8 x 105 células/ml medido por Petroff-Hauser e 7,7 x 105 células/mL como medido pela contagem de placa; Esta imagem mostra 110 células, um excelente ajuste à previsão. (C) DHM holograma de uma cultura de Shewanella ± 0.1 x 10 2.05 células/ml medido por Petroff-Hauser e 2,0 ± 0,3 x 105 células/mL como medido pela contagem de placa; Esta imagem mostra 27 células. Barra de escala = 35 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: realizar reconstruções. (A) abrir um holograma em Fiji. (B) propagação numérica de executar e digite o tamanho do comprimento de onda e a imagem. Escolha uma distância z perto de 0 para começar. (C) desenhar uma máscara de Fourier quando solicitado a selecionar o real ou imagem virtual. (D) banho processamento permite reconstruções em todo o volume. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: aparência de reconstruções.. Imagens da cultura de Serratia ~ 106 células/ml. (A) cru holograma. Transformação de Fourier (B). A área dentro do círculo é a área a ser usado; o resto é mascarado. (C) reconstrução de Amplitude em um único plano z. (D) fase de reconstrução em um único plano z; a barra de escala mostra a mudança de fase em graus. (E) máxima projeção de intensidade através de todos os z-aviões na pilha de fase. (F) Volume Ver os da pilha completa de amplitude (365 x 365 x 800 µm). Barra de escala = 35 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Concentração [células / mL] Quadros necessários
1.00E + 00 6.686
1.00E + 01 669
1.00E + 02 67
1.00E + 03 7
1.00E + 04 1
1.00E + 05 1

Tabela 1: Número mínimo de volumes de amostra necessária para detectar bactérias por DHM (confiança de deteção de 50%).

Propriedade. Valor Unidade
Comprimento de onda de funcionamento 405 nm
Objetiva abertura numérica 0.3 -
Ampliação do sistema 20 -
Resolução lateral 0.7 Μm
Volume de amostra de imagem 360 x 360 x 800 Μm x μm x μm
Comprimento do instrumento 400 mm

Tabela 2: Especificações óptica e desempenho para o microscópio holográfico digital.

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Discussion

Reconstrução numérica de hologramas: para a reconstrução numérica de hologramas, é usado o método do espectro angular (ASM). Isso envolve a convolução do holograma com a função Green para a DHM. O wavefront complexo da imagem em um determinado plano focal pode ser calculada utilizando o teorema da convolução Fourier como segue:

Equation 2(1)

Onde Equation 3 é o operador de Fourier Transform, Equation 4 é a matriz de holograma, e Equation 5 é a função Green da DHM, que é definido como:

Equation 6(2)

Onde Equation 7 é a distância, ao longo do eixo óptico, de plano focal desejado para ser reconstruída, Equation 8 é o comprimento de onda de iluminação, Equation 9 e Equation 10 são o número de pixels no x e y-direções, respectivamente, e Equation 11 e Equation 12 são o tamanho do pixel (no avião detector) em x e y-direções, respectivamente40.

Pela frente de onda complexa, a intensidade pode ser calculada pela magnitude ao quadrado de Equation 13 , e a fase pode ser obtida pelo arco tangente do quociente entre as partes reais e imaginárias da Equation 13 .

Modificações e solução de problemas
Experimentos envolvendo a enumeração das concentrações bacterianas esparsas são altamente suscetíveis à contaminação, falsos positivos e falsos negativos. Por esta razão, o crescimento e a enumeração de bactérias, bem como a preparação de amostras altamente diluídas para DHM são passos críticos neste experimento. Cuidado deve ser tomado para evitar a contaminação, neste experimento, controlando cuidadosamente o ambiente onde as bactérias são crescidas e enumeradas. Técnicas de esterilização adequada, incluindo a esterilização em autoclave, ajudam a prevenir contra a contaminação, bem como falsos positivos. Para aumentar a prevenção contra falsos positivos, as bactérias foram selecionadas para este experimento que apresentam características relativamente exclusivas (por exemplo, S. marcescens tem uma cor vermelha muito distinta quando cultivadas). Para prevenir-se contra falsos negativos, as bactérias escolhidas para este experimento foram selecionadas tais que eles seriam capazes de crescer em placas de cultura enriquecido, bem como têm formas características e/ou padrões de motilidade ser identificados através de DHM. É importante testar periodicamente para contaminação e/ou crescimento celular inesperado por chapeamento as amostras e quantificar as bactérias por contagem em placa.

Na condução deste experimento, espera-se um tamanho de dados de cerca de 2,4 GB por 1 mL de amostra. Este número, claro, é dependente do câmera e formato de arquivo usado. O tamanho dos dados relatado é pelo uso de um detector de Mpx 4 e um formato de arquivo TIFF padrão. O pós-processamento dos dados requer aproximadamente 6 min de computação por 1 mL de amostra. Este tempo de processamento, observou-se enquanto estiver usando um processador de 8-core Intel i7 em 3,5 GHz e 32 GB de memória RAM. Estes cálculos podem ser paralelizados para a GPU para grandemente reduzidos tempos de processamento, mas não foi feito aqui.

Limitações da técnica
Enquanto usando DHM para detectar concentrações muito baixas de bactérias é possível, esse método é não-específica. Morfologia sozinha não é um meio conclusivo de identificar cepas bacterianas. Aplicações diagnósticas apresentará desafios específicos, devido à presença de células não-alvo e agregados. No entanto, a vantagem do duplo-feixe instrumento apresentado aqui é que é capaz de imagem as bactérias em amostras relativamente turvas. A capacidade de detectar bactérias em amostras clínicas e o grau de pre-processamento das amostras que é necessário, continuam a ser determinado.

Passos críticos no protocolo
Passo 2: Obtenção exatas diluições é essencial para a enumeração quantitativa. Nenhum diluições feitas devem ser apoiadas por contagem em placa. Passo 3: A escolha da taxa de fluxo e taxa de quadro correspondente deve ser feita cuidadosamente para garantir que todas as células são vistas. Ajuste dos parâmetros da bomba deve ser cuidadosamente ajustado antes de executar um limite do experimento de deteção. Etapa 4: para concentrações muito baixas de bacterianas, é fundamental capturar dados suficientes para ser confiante da deteção. Pode ser necessário reconstruir alguns dados para ter certeza de que as células e não os restos, estão sendo vistos. Em casos extremos, mais de 10 mL da solução pode ser necessária. Non-motile cepas são mais propensos a ser ambíguo das estirpes motile. Passo 5: se houver qualquer ambiguidade nos dados, reconstrução pode ajudar a demonstrar que hologramas representam células e não os restos. Reconstruções de alta resolução mostrará morfologias célula clássico e motilidade pode ser claramente vista em faixas de cepas motile.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o Gordon e Betty Moore Foundation Grants 4037 e 4038 ao Instituto de tecnologia da Califórnia, para o financiamento deste trabalho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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