Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Bioengineering

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Summary

Digitaler holographischer Mikroskopie (DHM) ist eine volumetrische Technik, die können bildgebende Proben, die 50-100 X dicker als Hellfeld Mikroskopieren mit vergleichbarer Auflösung, mit der Fokussierung durchgeführt Nachbearbeitung. Hier DHM dient zur Identifizierung, zählen, und verfolgen Mikroorganismen bei sehr niedrigen dichten und verglichen mit optischen Dichtemessungen, Keimzahl und direkte Zählung.

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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Abstract

Genau erkennen und zählen spärliche bakterielle Proben hat viele Anwendungen in der Lebensmittel-, Getränke- und pharmazeutischen Industrie, in der medizinischen Diagnostik und für die Lebens-Erkennung von unbemannten Missionen zu anderen Planeten und Monde des Sonnensystems. Derzeit sind spärliche bakterielle Proben von Kultur-Beschichtung oder Epifluoreszenz Mikroskopie gezählt. Kultur-Platten erfordern lange Inkubationszeit Zeit (Tage bis Wochen) und Epifluoreszenz Mikroskopie erfordert umfangreiche Färbung und Konzentration der Probe. Hier zeigen wir wie einfallenden digitalen holographischen Mikroskopie (DHM) zum Auflisten von Bakterien in sehr verdünnter Kulturen (100-104 Zellen/mL). Erstens ist der Bau von benutzerdefinierten DHM zusammen mit detaillierten Anweisungen auf den Aufbau einer kostengünstigen Instrument diskutiert. Die Grundsätze der Holographie werden besprochen, und ein statistisches Modell wird verwendet, um abzuschätzen, wie lange Videos sollte sein, Zellen, basierend auf die optische Leistungsmerkmale des Instruments und die Konzentration der bakterielle Lösung (Tabelle 2) zu erkennen . Videoerkennung von Zellen bei 105, 104, 103und 100 Zellen/mL zeigt sich in Echtzeit mit UN-rekonstruierten Hologrammen. Rekonstruktion von Amplitude und Phase Bildern zeigt sich mit einer Open-Source-Software-Paket.

Introduction

Bestimmung der genauen bakteriellen zählt in sehr verdünnten Proben ist in vielen Anwendungen von entscheidender Bedeutung: einige Beispiele sind Wasser und Nahrung Qualität Analyse1,2,3; Nachweis von Krankheitserregern in Blut, Liquor cerebrospinalis oder Sputum4,5; Herstellung von pharmazeutischen Produkten, einschließlich steriles Wasser6; und Umwelt-Community-Analyse in oligotrophen Umgebungen wie das offene Meer und Sedimente7,8,9. Es gibt auch immer mehr Interesse an der Erkennung von möglichen erhaltene mikrobielles Leben auf den eisigen Monden von Jupiter und Saturn, besonders Europa10,11 und Enceladus12,13, 14, die bekanntermaßen Untergrund flüssigen Ozeane haben. Weil keine Mission seit Viking 1978 versucht hat, erhaltene Leben auf einem anderen Planeten zu finden, gab es begrenzte Entwicklung der Technologien und Instrumente für bakterielle Identifikation und im Weltraum-Missionen15zählen.

Traditionelle Methoden der Keimzahl finden nur kultivierbare Zellen, die eine Minderheit von Tierarten in ökologischer Belastungen manchmal darstellen können < 1 %16. Platten erfordern Tage oder Wochen Inkubation für maximalen Erfolg, abhängig von der Belastung. Epifluoreszenz Mikroskopie hat weitgehend Platte zählt als Goldstandard für die schnelle und genaue mikrobielle Aufzählung ersetzt. Nukleinsäure-Säure-labeling fluoreszierende Farbstoffe z. B. 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI), SYBR Green oder Acridin Orange, die an Nukleinsäuren binden sind typische verwendeten Farbstoffe17,18,19 , obwohl viele Studien verwenden unterzeichnen fluoreszierende Indikatoren Gramm20,21,22,23,24. Mit diesen Methoden ohne Vorkonzentrierung Stufen führt zu Nachweisgrenzen (DGS) ~ 105 Zellen pro mL. Verbesserungen in der DG sind mit Filterung möglich. Eine flüssige Probe wird Vakuum gefiltert auf eine Membran, in der Regel aus Polycarbonat und idealerweise schwarz, Hintergrund zu reduzieren. Low-Hintergrund Farbstoffe wie die oben genannten DNA-Flecken direkt auf den Filter25angewendet werden können. Für die genaue Zählung vom Auge, ~ 105 Zellen pro Filter, was, dass für mehr als 10 ~5 Zellen pro mL verdünnten Proben bedeutet erforderlich sind, erhebliche Probenvolumina gesammelt und gefiltert werden müssen. Laserscanning-Geräte wurden entwickelt, um systematisch erkunden alle Regionen des Filters und reduzieren damit die Anzahl der Zellen erforderlich für die Zählung, Nachweisgrenzen bis zu ~ 102 Zellen pro mL26schieben. Aber diese sind nicht verfügbar in den meisten Labors und benötigen anspruchsvolle Hardware als auch Software, die Experten Bestätigung zu erlauben, die Partikel beobachtet Bakterien und keine Ablagerungen sind.

Als Referenz, Erwachsene mit Sepsis zeigen Symptome bei in der Regel beginnen < 100 Zellen/mL Blut und Säuglinge bei < 10 Zellen/mL. Eine Blutprobe von einem Erwachsenen dauert 10 mL, und von einem Kleinkind, 1 mL. PCR-basierte Methoden sind durch die Anwesenheit von menschlichen und nicht-pathogenen Flora DNA und durch Hemmung der PCR-Komponenten in der Blut-27,-28gehemmt. Trotz einer Vielzahl von Zukunftstechniken bleiben Kulturen der Goldstandard für die Diagnose der Blutbahn Infektionen, vor allem in ländlichen Gebieten oder sich entwickelnden Nationen. Für die Erkennung von Leben auf anderen Planeten können Thermodynamische Berechnungen den Energiehaushalt und damit die erwarteten möglich Biomasse abschätzen. 1 - 100 Zellen/mL sollen thermodynamisch günstigen auf Europa29sein. Es ist leicht aus diesen Zahlen ersichtlich, Erkennung von sehr kleinen Zahl von Zellen in großen Mengen wässrigen Lösung eine wichtige ungelöste Problem ist.

In diesem Beitrag zeigen wir Erkennung von Serratia Marcescens und Shewanella Oneidensis (Wildtyp und nicht bewegliche Mutant) bei Konzentrationen von 105, 104, 103und 100 Zellen/mL über eine off-Axis holographische Digitalmikroskop (DHM). Der entscheidende Vorteil des DHM über traditionelle Lichtmikroskopie ist die gleichzeitige Darstellung der dicken Probenvolumen mit hoher Auflösung – in dieser Implementierung wurde die Probenkammer 0,8 mm dick. Diese Probenkammern entstanden durch die Soft-Lithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) aus einer Präzision bearbeitete Aluminium-Form mit einer Toleranz von ± 50 µm. Dies entspricht einer ca. 100-fold Verbesserung in der Tiefe des Feldes über Hochleistungs-Lichtmikroskopie. DHM bietet auch quantitative Phaseninformationen ermöglicht Messungen der optischen Weglänge (Produkt aus Brechungsindex und Dicke). DHM und ähnliche Techniken sind verwendet worden, für die Überwachung der Bakterien und Hefe Zellzyklus und Berechnung der bakteriellen trockene Masse30,31,32; Streuung Unterschiede können auch verwendet werden, um Bakterienstämme33zu unterscheiden.

Das Instrument, das wir verwenden ist speziell für den Einsatz mit Mikroorganismen, wie zuvor veröffentlichten34,35, nach Mass und seine Architektur und Konstruktion werden gezeigt und diskutiert. Wässrige Lösungen sind eine 0,25 µL Volumen Probenraum über Spritzenpumpe kontinuierlich zugeführt; die Durchflussrate richtet sich nach Kamera-Frame-Rate um Bildgebung des gesamten Probenvolumen zu gewährleisten. Eine statistische Berechnung prognostiziert die Anzahl der Probenvolumina, die abgebildet werden müssen, um eine beträchtliche Anzahl von Zellen in einer bestimmten Konzentration zu erkennen.

Für Handy-Anwendungen war die Rekonstruktion der Hologramme in Amplitude und Phase Bilder nicht erforderlich; Analyse wurde auf das rohe Hologramm durchgeführt. Das spart erhebliche Rechenressourcen und Speicherplatz: 500 Mb Hologramm video 1-2 Tb bei rekonstruiert werden. Jedoch diskutieren wir Rekonstruktion durch Tiefe der Probe zu bestätigen, dass die Hologramme die gewünschten Arten vertreten. Ein wichtiges Merkmal des DHM ist seine Fähigkeit, Intensität und Phase der Bilder zu überwachen. Organismen, die nahezu transparent in ihrer Intensität (wie die meisten biologischen Zellen) sind eindeutig in Phase angezeigt. Da es eine markierungsfreie Technik ist, werden keine Farbstoffe eingesetzt. Dies ist ein einDvantage für möglich Raumfahrt-Anwendungen, da Farbstoffe nicht die Voraussetzungen einer Mission überleben können und – noch wichtiger ist – kann nicht davon ausgegangen werden, mit Außerirdischen Organismen arbeiten, die nicht für die Codierung von DNA oder RNA nutzen dürfen. Es ist auch ein Vorteil für die Arbeit in extremen Umgebungen wie der Arktis und Antarktis, wo Farbstoffe können schwierig sein, zu der abgelegenen Lage bringen und bei der Lagerung beeinträchtigen können. Rekonstruktion von Bildern in Phase und Amplitude erfolgt mithilfe einer Open-Source-Software-Pakets, die wir auf GitHub (SHAMPOO) zur Verfügung gestellt haben oder ImageJ.

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Protocol

1. Wachstum und Aufzählung der Bakterien

Hinweis: Dies gilt für fast jeder Bakterienstamm in die entsprechende mittlere 36 angebaut. In unserem Beispiel verwenden wir drei Sorten: Serratia Marcescens als eine gemeinsame, leicht identifizierbare Lab Belastung; und ein kleiner, sehr bewegliche Umweltbelastung, Shewanella Oneidensis MR-1. Um die Erkennung von vergleichen bewegliche vs. nicht-bewegliche Zellen, nicht bewegliche Shewanella Mutant, Δ FlgM, dient auch zum Vergleich 37. Alle Sorten werden angebaut, in Lysogeny Brühe (LB).

  1. Prepare sterile LB-Medium (pro Liter destilliertem Wasser: 10 g Bacto Tryptone, 5 g Bacto Hefe, 10 g NaCl; Filter oder Autoklaven). Bereiten Sie standard 100 mm Durchmesser LB-Agar-Platten (gleiche Rezept als Medium plus 15 g Agar / l; Autoklaven (121 ° C, 20 min) zu sterilisieren und gießen Wenn kühl genug, um zu behandeln). Medium und Teller im Kühlschrank lagern.
  2. Am Tag vor dem Experiment Samen 5-6 mL des " Master " Kulturmedium aus einer frischen bakterielle Kolonie, mit richtig steril und biologische Verfahren. Inkubieren Sie auf einen Shaker (120 u/min) bei 30 ° C für ~ 12 h Inkubationszeit abhängig von der Belastung und des Wachstums Rate werden. In unseren Experimenten werden die Stämme Shewanella für 12 Stunden inkubiert; jedoch ist die Serratia nach 8 Stunden geerntet, um die Kultur präsentiert Mitte logarithmische Wachstum zu gewährleisten.
  3. Am Tag des Experiments, nehmen Sie eine photometrische Lesung (OD 600) von den bakteriellen Kultur, die voraussichtlich im Bereich von 0,6 bis 0,7 zu meistern. Es sollte in der logarithmischen Wachstumsphase (wie zuvor festgelegt). Wenn nicht, Subkultur 100 µL in 5 mL Medium und Zellwachstum in der Mitte des Log-Phase lassen.
  4. Nehmen Sie eine Probe des Meisters Kultur und zählen Sie die Zellen, die direkt mit einem Petroff-Hausser zählen Kammer. Das lebende und tote Zellen auflisten wird.
    1. Eine 10 µL Probe der unverdünnte Kultur mit einer Mikropipette und Transfer in die Kammer zu extrahieren.
    2. Bild unter einem hohen trocknende Objektive Mikroskop (40 X oder 63 X, NA 0,7 - 0,8) mit Phasenkontrast.
    3. Zählen die Bakterien auf mindestens 20 Plätzen und Durchschnitt.
      Hinweis: Zählen Sie nur jene Bakterien, die vollständig in ein Quadrat und nur diese überqueren oben und links Grenzen (oder unten und rechts, wenn Sie es vorziehen). Wenn Plätze von mehreren Linien voneinander getrennt sind, wählen Sie eine als Umgrenzung.
    4. Calculate Konzentration als der Durchschnitt von 20 Plätzen x Verdünnungsfaktor. Hinweis die direkte zählt funktionieren nicht gut für Konzentrationen < 10 7 / mL.
  5. Machen Verdünnungsreihen der Kultur für die Zählung der Koloniebildenden Einheiten (KBE). Dies wird lebenden Zellen nur aufzählen.
    1. Stellen eine serielle Verdünnung von jeder der ausgewählten bakteriellen Proben mit steriler Kochsalzlösung 0,9 % Lösung. 20 µL der bakterielle Lösung zu übertragen und mit 180 µL Kochsalzlösung verdünnen. Wiederholen Sie, bis die niedrigste Konzentration ~ 10 3 Zellen/mL.
    2. Nehmen 100 µL aus mindestens zwei Verdünnungen empfohlen sind 10 3 und 10 4 /mL — und Platte auf einen geeigneten Nährboden-Platte. Mit einem sterilen Spreader verteilt. Führen Sie mindestens 3 Wiederholungen jeder Verdünnung.
    3. Brüten auf eine entsprechende Temperatur für Ihre Bakterien über Nacht oder bis Kolonien wachsen.
    4. Kolonien zählen und rechnen Koloniebildenden Einheiten (KBE) nach (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen plattiert = KBE/mL. Durchschnittliche KBE in den Wiederholungen.

2. Vorbereitung der hoch verdünnt Proben für DHM

  1. machen Verdünnungsreihen des Meisters Kultur für DHM und Post-DHM zählen der Koloniebildenden Einheiten auf LB Medien Platten (siehe 1.4.1 - 1.4.4). Diese Doppelblind-führen, so dass die Person, die die Aufnahmen nichts von der Konzentration in jeder gemessene Probe ist.
    1. Verdünnen die Bakterien in 10-15 mL ein minimaler Medium, die Motilität (bei Bedarf) zu fördern, sondern hemmen die Zellteilung, so dass die Konzentration der Zellen während des Experiments nicht merklich ändert. 0,9 % Kochsalzlösung oder eine spezifischere Motilität Medium möglicherweise. Beispielsweise muss bei Verwendung von Escherichia coli Motilität Medium EDTA 38 enthalten. Für diese Beispiele verwenden wir 0,9 % Kochsalzlösung.

3. Aufnahme von DHM Videos

  1. mit einer sterilen Spritze, in ca. 10 mL der Verdünnung von Interesse ziehen.
  2. Die Spritze an der DHM Probenkammer mit sterilen Armaturen und Schläuche anschließen.
    Hinweis: Eine maßgeschneiderte mikrofluidischen Kammer wurde konstruiert, um die konstanten Durchfluss der Probe durch den Strahlengang des Instruments zu ermöglichen. Siehe Abschnitt "Ergebnisse" für weitere Details. Vor dem Experiment, sollten alle Komponenten der Probenraum durch Autoklavieren sterilisiert werden.
  3. Fließen die Probe aus der Spritze durch die Probenkammer kontinuierlich über eine Spritzenpumpe.
    Hinweis: Geeignete Flussraten variieren je nach fluidische Kanal Abmessungen sowie gewünschten Durchsatz und Erwerb Dateneinschränkungen.
  4. Wie im Beispiel die Probenkammer durchströmt wird erwerben Hologramme nacheinander mit einem entsprechenden Frame-Rate. Eine Zeitstempel Datei wird erstellt werden, welche Protokolle erfassen die Zeit eines jeden Bildes später während der Datenanalyse (Abschnitt 4-Protokoll) verwendet werden. Erhalten Sie alle Hologramme bei Raumtemperatur (23° C). Hologramme durch Ausführen einer vorformulierte C++ ausführbare Datei zur Verfügung gestellt vom Kamerahersteller aufnehmen.
    Hinweis: Angemessener Preise variieren je nach der Volumenstrom gewählt. Für dieses Experiment, es empfiehlt sich, eine Frame-Rate zu verwenden, so dass ein Bakterium abgebildet werden würde > 2 Mal, wie es über das Instrument gereist ' Sichtfeld s.
  5. Lassen Sie genügend Zeit für die gesamte 10 mL der Probe durch das DHM übergeben werden.
  6. , Damit Bakterien nicht wachsen oder sterben während der Experimente impfen bereichert Medien Platten mit 100 µL der abgebrannten Medien Post-DHM-Bilderfassung. Mit einem sterilen Spreader verteilt und rund um die Uhr bei entsprechenden Temp inkubieren; zählen der Kolonien vorhanden.

4. Berechnung der Zelldichte und Grenzen der Erkennung

  1. mit den erworbenen Hologramm-Videos analysieren Sie die Daten für die Anwesenheit der Bakterien.
    1. Berechnen Sie den Median Pixelwert für eine Zeitreihe von Hologrammen und ziehen diese Medianwert von jedem jeweiligen Pixel, stationäre Artefakte im Hologramm zu beseitigen. Dies kann in ImageJ erfolgen, indem die folgenden Schritte ausführen:
      1. Konvertieren in 32-Bit (Image-Typ-32 Bit)
      2. berechnen der Median (Bild-Stack-Zproject-Median)
      3. subtrahieren den Median aus dem Rest der Stack ( Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. die Anzahl der sichtbaren hellen Ringe und Zellen im Fokus manuell. In ImageJ, dies geschieht, indem Sie auf die Objekte mit dem Werkzeug Punkt.
    3. Jede Serie von Hologrammen von einem Zeitstempel Datei (Aufnahme mit Hologramm Erwerbszeitpunkt) begleitet werden. Verwendung die Zeitstempel Datei zur Berechnung der Gesamtbetrag der Probe gepumpt zur Zeit das Bild erfasst wurde.
  2. Die Zelldichte zu berechnen, indem man die Gesamtzahl der Zellen erkannt durch das Gesamtvolumen der Stichprobe abgebildet. Durchschnittlich ca. 5-10 Frames für genaue Statistiken.

5. Bild-Rekonstruktion, Amplitude und Phase

  1. Wählen Sie repräsentative Videos mit 10-200 Zellen pro Frame. Roh (nicht Median-subtrahiert) Hologramme in der Rekonstruktion Software laden (Beispiele: numerische Vermehrung ImageJ 39; SHAMPOO [GitHub]).
    1. Verwendung von ImageJ, gehen Sie zum OD-numerische Propagation-numerische Beugung.
    2. An der Eingabeaufforderung, zeichnen Sie eine Fourier-Maske zu wählen, die realen oder virtuellen Abbild und beseitigen jede sinusförmigen Störungselemente.
    3. Amplitude und Phase bei entsprechenden Z-Schritte durch Eingabe der Wiederaufbau Entfernung zu rekonstruieren.
  2. Median subtrahieren die Amplitude Daten zur Lärmminderung in 4.1.1.
  3. Plot-Daten als ein 3D Cube oder Projektion. Gehen Sie auf Plugins — Volume Viewer.

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Representative Results

Die Ergebnisse sollten die Möglichkeit, lebende und tote Bakterien auf einem sehr niedrigen Niveau von DHM zu erkennen geben. Die Anzahl der Bakterien gezählt sollte mit der erzielten Ergebnisse mit Petroff-Hauser zählen Industrie- und Platte Grafen übereinstimmen. Statistische Standardmethoden bieten Informationen über die Genauigkeit der verschiedenen Nachweismethoden bei verschiedenen bakteriellen Konzentrationen.

Abbildung 1 zeigt die Petroff-Hausser Zählkammer sowie die Mikrostruktur der Zählkammer, die in der direkten Enumeration von Zellen verwendet wird. Abbildung 2A zeigt eine typische angereicherten Kultur-Platte, die ausreichend erlaubt wurde Zeit, dass S. Marcescens Kolonien (16 Stunden bei Raumtemperatur) wachsen. Abbildung 2 b zeigt Wachstumskurven für alle Stämme verwendet. Während die genaue Spektrophotometer Messungen variieren, sollte die Beziehung zwischen OD600 und Kolonie Graf linear im Bereich des Spektralphotometers zuverlässig sein; Wir Maßen ~ OD600 = 0,1 als ~ 108/mL. Die direkte Petroff-Hausser zählt und Kolonie zählt sollte stimmen Sie innerhalb 10 % bis die Zellen beginnen zu sterben wie nach Umsatz in der Wachstumskurve zu sehen.

Abbildung 3 zeigt den Aufbau eines benutzerdefinierten Probenkammern. Benutzerdefinierte mikrofluidischen Kammern wurden für dieses Experiment verwendet, um den kontinuierlichen Fluss der Probe durch das Sichtfeld des holographischen Mikroskops ermöglichen. Der Bau der Probenkammern wurden Standard mikrofluidischen Techniken und Materialien verwendet. Blunt kippte aus rostfreiem Stahl, die Nadeln mit männlichen Luer-Lok Befestigungen in mikrofluidischen Gerät zum Einlass und Auslass Anschlüsse an die Probenkammer bieten eingefügt wurden. Die Kanalgeometrie mikrofluidischen entstand durch die weiche Lithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer bearbeiteten Aluminium-master-Form, die über Aluminiumrahmen komprimiert wurde, zwischen zwei optische Qualität Glasfenster. Die PDMS legt Fluss Kanal Geometrien sowie sichert Injektionsnadeln, die flüssigen Transport zu und von den Strömungskanälen zur Verfügung zu stellen. Diese Probenkammern verwenden PDMS ausschließlich auf Kanal Strömungsgeometrie zu etablieren und somit enthalten keine PDMS in den optischen Pfad des Instruments. Beachten Sie, dass aufgrund der optischen einem einfallenden holographische Mikroskop zwei Mikro-Kanäle geformt wurden parallel zueinander in den Probenraum. Dies soll optischen Weglängen zwischen den beiden Armen des Interferometers (bezeichnet als die "Probe" und "Referenz" Arme) übereinstimmen. Der Referenzkanal sollte nur sterile Medien enthalten und Strömung nicht unterliegen sollten.

Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung und Bilder von holographischen Digitalmikroskop in der Labor-Implementierung. Die Bedienung erfolgt durch die mit der Kamera mitgelieferte Software. Abbildung 5 zeigt repräsentative DHM-Daten für bakterielle Enumeration und ihre Korrespondenz mit prognostizierten Zahl der Zellen pro Gesichtsfeld. Von der rohen Hologramme, ohne Umbau ist es möglich zu sehen und zählen der Zellen durch mittlere Subtraktion und manuelle Tracking. Dies reduziert die rechnerische Belastung im Vergleich zu rekonstruieren alle Z-Ebenen, wie die rohen Hologramme die Zellen in der Tiefe der Kammer zeigen. Das Aussehen der Kulturen in unterschiedlichen Konzentrationen und ihre Korrespondenz mit Keimzahl und Petroff-Hauser Graf sind angegeben. Insgesamt Zellzahlen werden durch die Anzahl der Zellen in jedem Probenvolumen über die Gesamtzahl der Bände abgebildet gesehen durchschnittlich bestimmt. Der Nachweisgrenze richtet sich nach der Gesamtzahl der Probenvolumina abgebildet. In diesem Experiment haben wir eine Höchstgrenze auf diesen Wert mit insgesamt maximal 10 mL der Probe in Schritten von 0,25 µL (insgesamt 40.000 Bilder pro Probe) abgebildet. Die Aufnahmen werden beendet, bevor die maximale Gesamtmenge erreicht ist, wenn Zellen in jedem Frame über eine Serie von 20 Bildern deutlich beobachtet werden. In einem früheren Papier berichteten wir eine Formel zur Schätzung der Anzahl der Probenvolumina benötigt, um die Bakterien bei einem 50 %-Konfidenzniveau bei Konzentrationen von 1-105 Zellen/mL (Tabelle 1) bis hin zu erkennen. Basierend auf dieser Schätzung, sollte eine Prüfung aller 40.000 Bilder zur Erkennung von Zellen bei 1/mL, erlauben, obwohl diese Berechnung rechenintensiv ist.

Abbildung 6 zeigt die Verwendung der Wiederaufbau Software (Fidschi)39. Ein einzelnes Hologramm wird geöffnet und die Software "OD-numerische Propagation-numerische Beugung" läuft. Die imaging-Parameter werden im Dialogfeld angegeben; Amplitude, Intensität und Phase können alle rekonstruiert werden. Eine einzelnes Z-Ebene kann gewählt werden, oder Batch Rekonstruktionen verwendet werden, um die gesamte Tiefe zu rekonstruieren.

Abbildung 7 zeigt Rekonstruktionen von Amplitude und Phase Bilder in unterschiedlichen Tiefen in einer Stichprobe. Die Fourier-Maske zur Erzeugung von der Umbauten gezeigt, zusammen mit einem Median subtrahiert Intensität Bild, ein Phase-Bild, eine maximale Projektion durch den Phase-Stack und eine Volumen-Projektion des Stapels Intensität.

Figure 1
Abbildung 1: direkte Zählung der Bakterienzellen. Bakterienkonzentration in Zellen/mL wird berechnet, indem die Gesamtzahl der Bakterien in der Kammer zählen und Skalierung dieser Nummer Buchhaltung dafür, dass die Petroff-Hauser-Kammer nur 20 enthält zählen nL Probe. (A) The Petroff-Hausser Kammer zählen. (B) Bild des Zählens Kammer Mikrostruktur unter 10 X Phasenkontrast, zeigen Boxen in verschiedenen Größen nützlich zum Auflisten von Zellen in verschiedenen Größen. (C) Darstellung von S. Marcescens innerhalb der Zählung Kammer kleinste Felder; 40 x Phasenkontrast. (D) Methode zum zählen, das schließt Zellen fallen auf der oberen und rechten Rand (N), aber nicht die unteren und linken Rand (Y). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: zählen von Zellen durch Koloniewachstum und Extinktion. (A) S. Marcescens für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Auf die richtige Verdünnung sollte Kultur Plattenhaben Sie 20-200 Kolonien für präzise Zählung und Statistiken. Die Platte gezeigt ist etwas zu eng für die zuverlässige Zählung. (B) Wachstum-Kurven für die 3 Stämme verwendet. Eine optische Dichte von 0,1 bis 10 ~8 Zellen/mL entspricht, aber genaue Werte variieren je nach Instrument. Direkte Petroff-Hauser zählt Stimme Platte bis weniger als 10 % im Bereich lineares Wachstum zählt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der 5 unabhängige Stichproben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Probieren Sie Kammer Design. (A) mikrofluidischen schematische (Probe und Referenz Mikrokanäle beschriftet). (B) komplett montierte Probenraum. (C) explodierte CAD anzeigen zeigt die konstitutiven Elemente der Probenraum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Schaltplan und Bilder von holographischen Digitalmikroskop. (A) Schaltplan zeigt vier Hauptelemente: die Quelle, die Probe (Probe Weg ist spec beschriftet und Referenzpfad ist beschriftet Ref.), das Mikroskop und den Sensor. (B) Volumenmodell der Hardware. Der Faser gefütterten Ursprungsbaugruppe befindet sich am unteren, und die Kamera ist an der Spitze. Die Mikroskop-Optik – bestehend aus den zwei asphärischen Linsen und das Relais Objektiv – befinden sich innerhalb der Röhre 300 mm Teleobjektiv. Die dreiachsige Bühne zwischen der Quelle die Mikroskop-Optik bietet einfache manuelle Manipulation der untersuchten Probe. (C) Foto des Instruments im Labor. Der Maßstab im unteren Teil des Bildes entspricht 1 Zoll. Die Schaltpläne werden von Wallace Et Al. neu gezeichnet. 34. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Wachstumskurven und repräsentative Daten der DHM. (A) prognostizierte Zellen pro Gesichtsfeld basierend auf ein Probenvolumen von 365 µm X 365 µm x 1 mm. Der optimale Bereich für die DHM-Enumeration wird im Rechteck angezeigt, und reale Proben sind als (B) und (C). (B) DHM Hologramm von einem Shewanella Kultur bei 8 x 105 Zellen/mL gemessen am Petroff-Hauser und 7,7 x 105 Zellen/mL gemessen an Keimzahl; Dieses Bild zeigt 110 Zellen, eine hervorragende Passform mit der Vorhersage. (C) DHM Hologramm einer Shewanella Kultur 2.0 ±0.1 X 105 Zellen/ml gemessen an Petroff-Hauser und 2,0 ±0.3 X 105 Zellen/mL gemessen an Keimzahl; Dieses Bild zeigt 27 Zellen. Maßstabsleiste = 35 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Durchführung von Rekonstruktionen. (A) öffnen Sie ein Hologramm in Fidschi. (B) führen Sie numerische Vermehrung und geben Sie die Wellenlänge und Bildgröße. Wählen Sie einen Z-Abstand nahe bei 0 beginnen. (C) zeichnen eine Fourier-Maske, wenn aufgefordert, die realen oder virtuellen Bild auszuwählen. (D) Bad Verarbeitung Rekonstruktionen im gesamten Volumen ermöglicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Darstellung von Rekonstruktionen. Bilder von Serratia Kultur ~ 106 Zellen/ml. (A) Raw Hologramm. (B) Fourier-Transformation. Der Bereich innerhalb des Kreises ist der Bereich verwendet werden; der Rest ist maskiert. (C) Amplitude Rekonstruktion in einer Z-Ebene. (D) Phase Rekonstruktion in einer Z-Ebene; die Skala zeigt die Phasenverschiebung in Grad. (E) maximale Intensität Projektion durch alle Z-Ebenen im Stapel Phase. (F) Volumen Anzeigen des Stapels volle Amplitude (365 x 365 x 800 µm). Maßstabsleiste = 35 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Konzentration [Zellen pro mL] Frames benötigt
1.00E + 00 6.686
1.00E + 01 669
1.00E + 02 67
1.00E + 03 7
1.00E + 04 1
1.00E + 05 1

Tabelle 1: Minimale Anzahl von erforderlichen Probenvolumen zur Erkennung von Bakterien durch DHM (Erkennung Vertrauen von 50 %).

Immobilien Wert Einheit
Wellenlänge in Betrieb 405 nm
Objektive numerische Apertur 0,3 -
System-Vergrößerung 20 -
Laterale Auflösung 0,7 Μm
Probenvolumen Imaging 360 x 360 x 800 Μm X μm x μm
Instrument-Länge 400 mm

Tabelle 2: Optische Leistung Spezifikationen für die holografische Digitalmikroskop.

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Discussion

Numerische Rekonstruktion von Hologrammen: für die numerische Rekonstruktion von Hologrammen, die eckige Spektrum-Methode (ASM) verwendet. Dies beinhaltet die Faltung des Hologramms mit dem Grün-Funktion für die DHM. Die komplexe Wellenfront des Bildes an eine bestimmte Brennebene kann durch den Einsatz der Fourier-Convolution-Theorem wie folgt berechnet werden:

Equation 2(1)

Wo Equation 3 ist die Fourier-Transformation Operator, Equation 4 ist die Hologramm-Matrix und Equation 5 ist die grüne Funktion des DHM, definiert als:

Equation 6(2)

Wo Equation 7 ist der Abstand entlang der optischen Achse, von der gewünschten Brennebene rekonstruiert werden, Equation 8 ist die Beleuchtung Wellenlänge, Equation 9 und Equation 10 sind die Anzahl der Pixel in x- und y-Richtung, bzw., und Equation 11 und Equation 12 sind die Pixelgrößen (auf der Ebene des Detektors) in die x- und y-Richtung, bzw.40.

Aus der komplexen Wellenfront kann die Intensität durch die Größe des im Quadrat berechnet werden Equation 13 , und die Phase erhalten Sie durch die Arctangent des Quotienten zwischen die imaginäre und reale Teile des Equation 13 .

Modifikationen und Fehlerbehebung
Experimente mit der Aufzählung der spärlichen Bakterienkonzentration sind sehr anfällig für Verschmutzung, false Positives und false negative. Aus diesem Grund, die Wachstum und Aufzählung der Bakterien sind sowie die Vorbereitung von hoch verdünnten Proben für DHM wichtige Schritte in diesem Experiment. Vorsicht muß genommen werden, zur Vermeidung von Kontaminationen in diesem Experiment durch sorgfältige Kontrolle der Umgebung, wo die Bakterien gewachsen und aufgezählt sind. Richtige Sterilisationstechniken, einschließlich Autoklavieren, helfen gegen Verschmutzung sowie Fehlalarme zu verhindern. Um weiter gegen Fehlalarme zu verhindern, wurden Bakterien für dieses Experiment, das zeigen relativ einzigartige Eigenschaften (z. B. S. Marcescens hat eine sehr ausgeprägte rote Farbe wenn kultiviert) ausgewählt. Um gegen falsche negative zu verhindern, wurden die Bakterien gewählt für dieses Experiment so gewählt, dass sie wäre in der Lage zu wachsen auf angereicherte Kultur Platten sowie haben charakteristische Formen und/oder Motilität Muster über DHM identifiziert werden. Es ist wichtig, in regelmäßigen Abständen für Verschmutzung und/oder unerwartete Zellwachstum durch Beschichtung der Proben und Quantifizierung der Bakterien durch die Keimzahl zu testen.

Bei der Durchführung dieses Experiments, dürfte eine Größe von etwa 2,4 GB pro 1 mL der Probe. Diese Zahl ist natürlich abhängig von der Kamera und das Dateiformat verwendet. Die Größe der Daten gemeldet ist durch den Einsatz von 4 Mpx Detektor und ein Standardformat TIFF-Datei. Die Nachbearbeitung der Daten erfordert etwa 6 min. der Berechnung pro 1 mL der Probe. Diese Bearbeitungszeit wurde beobachtet, während mit einer 8-Core-Prozessor von Intel i7 auf 3,5 GHz und 32 GB RAM. Diese Berechnungen können an die GPU parallelisiert werden, stark reduzierte Bearbeitungszeiten, aber wurde hier nicht getan.

Grenzen der Technik
Mit DHM um sehr geringe Konzentrationen von Bakterien zu erkennen ist, zwar möglich ist diese Methode unspezifisch. Morphologie allein bedeutet nicht schlüssig Bakterienstämme zu identifizieren. Diagnoseanwendungen präsentieren besondere Herausforderungen aufgrund der Anwesenheit von nicht-Ziel-Zellen und Aggregate. Der Vorteil der hier vorgestellten Dual-Beam-Instrument ist jedoch, dass es Bild Bakterien in relativ trüben Proben kann. Die Fähigkeit zur Erkennung von Bakterien in klinischen Proben und dem Grad der Vorverarbeitung der Proben, die benötigt wird, noch festgelegt werden.

Wichtige Schritte im Protokoll
Schritt 2: Quantitative Enumeration unbedingt genaue Verdünnungen zu erhalten. Alle Verdünnungen gemacht sollte durch Keimzahl gesichert werden. Schritt 3: die Wahl der Durchflussmenge und entsprechenden Frame-Rate muss sorgfältig erfolgen, um sicherzustellen, dass alle Zellen zu sehen sind. Anpassung der Pumpe Parameter sollten sorgfältig optimiert werden, bevor Sie ein Limit von Erkennung Experiment durchführen. Schritt 4: für sehr geringe Bakterienkonzentration ist es entscheidend, genügend Daten zur Erkennung sicher sein zu erfassen. Es möglicherweise erforderlich, einige Daten um sicherzustellen, dass Zellen und nicht Schmutz, gesehen werden zu rekonstruieren. In extremen Fällen kann mehr als 10 mL der Lösung erforderlich sein. Non-bewegliche Stämme sind eher zweideutig als bewegliche Sorten sein. Schritt 5: Wenn in den Daten gibt es Zweideutigkeit, Rekonstruktion kann helfen, zeigen, dass Hologramme Zellen und keine Ablagerungen darstellen. Hochauflösende Rekonstruktionen zeigen klassische Zelle Morphologie und Motilität ist deutlich zu erkennen in den Spuren der bewegliche Stämme.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen die Gordon und Betty Moore Foundation Stipendien 4037 und 4038, California Institute of Technology für die Finanzierung dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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References

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