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Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni

Developmental Biology

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Summary

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l'introduzione in coltura in vitro .

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Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

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Abstract

Umani sangue trematodi, Schistosoma spp., hanno un ciclo di vita complesso che coinvolge fasi dello sviluppo sessuale e asessuale all'interno di un lumaca intermedi e di mammifero ospite finale, rispettivamente. La capacità di isolare e sostenere le fasi del ciclo di vita diverso in condizioni di coltura in vitro ha notevolmente facilitato le indagini dei meccanismi cellulari, biochimici e molecolari che regolano l'host, la sviluppo e la crescita del parassita interazioni farmacologiche. Trasmissione della schistosomiasi richiede la riproduzione asessuata e lo sviluppo di più stadi larvali all'interno dell'host lumaca; dal miracidium infettiva, attraverso sporocisti primarie e secondarie, alla fase finale cercarial che è infettivo agli esseri umani. In questa carta presentiamo un protocollo passo-passo per massa schiusa e isolamento di Schistosoma mansoni miracidia da uova ottenute dai fegati di topi infetti e la loro successiva introduzione in coltura in vitro . Si prevede che il protocollo dettagliato incoraggerà nuovi ricercatori per partecipare e ampliare questo importante settore della ricerca di schistosome.

Introduction

L'essere umano sangue flukes Schistosoma spp., sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia tropicale trascurata che affligge un stimato 230 milioni di persone in tutto il mondo1. La specie più diffusa, Schistosoma mansoni, è geograficamente distribuita in Sud America, l'arcipelago dei Caraibi, Medio Oriente e Africa sub-sahariana2. Il ciclo di vita di S. mansonie altri schistosomes, è complesso, che coinvolge un mammifero ospite definitivo e lumache d'acqua dolce del genere Biomphalaria che fungono da ospiti intermedi obbligati.

S. mansoni adulto maschio e femmina a vite senza fine coppie vivono nelle vene mesenteriche posteriore di riprodurre il mammifero ospite, determinando il rilascio di uova embrionate (ovuli) che sono alloggiati in piccole venule della mucosa intestinale. Uova quindi rotture attraverso le pareti del vaso, migrano attraverso il tessuto mucoso e alla fine inserire il lume intestinale dove essi sono annullate con le feci. Quando gli ovuli digitare tratteggio di larve d'acqua dolce e liberamente natante (miracidia), devono, in breve tempo, trovare una lumaca Biomphalaria adatta per infettare al fine di continuare il suo ciclo di vita. Questo processo di infezione coinvolge miracidial attaccamento alla superficie esterna di lumaca seguita da penetrazione attiva e voce della larva nell'ospite. Presto dopo l'entrata, il miracidium inizia a capannone relative piastre epidermiche ciliati esterni come si forma un sincizio che diventerà la nuova superficie esterna (tegumento) della prossima fase larvale, lo sporociste primario o madre. Attraverso la riproduzione asessuata, ogni sporociste primario produce e rilascia una seconda generazione di sporocisti, definiti secondari o sporocisti di figlia, che a sua volta, generano e rilasciare grandi quantità di intramolluscan fase finale, le cercarie di Fasciolopsis3 . Al momento della fuga dall'host lumaca, liberamente natante cercarie sono capaci di associare a e direttamente penetrando la pelle di un uomo o altri host mammiferi adatto. All'entrata in loro nuovo ospite, cercarie trasformano alla fase schistosomula parassitarie e invadono il sistema vascolare. Essi, a loro volta, migrare al polmone e quindi alla vena epatica dove maturano in vermi adulti, formano coppie maschili e femminile e viaggiare a vene mesenteriche per completare il loro ciclo di vita.

Successo intramolluscan o "fase di lumaca" sviluppo larvale schistosomes è essenziale per la continuazione del ciclo di trasmissione interumana host-to-host. Di fondamentale importanza è la seguente voce periodo del miracidium liberamente natante in host lumaca e la sua trasformazione iniziale alla fase primaria sporociste. A seconda della compatibilità fisiologica e immunologica tra ospite e parassita, è durante questa fase di sviluppo larvale che iniziale successo o il fallimento di stabilire infezioni è determinato4,5,6 . Lo sviluppo successivo di sporocisti primari in grado di produrre asessualmente sporocisti secondari, che quindi generano cercarie umani-infettivo, ulteriormente richiedono un ambiente di host fisiologico permissiva che fornisce per tutta crescita del parassita e riproduttiva ha bisogno.

Fin qui, piccolo è conosciuto circa il sottostante fisiologici, biochimici e processi molecolari controllare interazioni di schistosome-lumaca, soprattutto le molecole e vie coinvolte nella regolazione della riproduzione e sviluppo larvale o modulante risposta immune dell'ospite. Pronto accesso a un gran numero di questi stadi larvali in vitro condizioni di coltura che permettono la manipolazione sperimentale faciliterebbe notevolmente alla scoperta delle vie di sviluppo e meccanismi di fondo della crescita cellulare, differenziazione e riproduzione. Percorsi critici parassita o meccanismi, identificati attraverso la sperimentazione in vitro , quindi potrebbero essere utilizzati per interrompere la crescita/riproduzione larvale nell'host di lumaca, o per identificare meccanismi immuni dell'ospite lumaca coinvolti nel riconoscimento e nell'eliminazione di fasi miracidial o sporociste.

In questo articolo e il video di presentazione, forniamo una descrizione dettagliata di un metodo per isolare un numero elevato di nuotare liberamente S. mansoni miracidia per introduzione nella cultura in vitro che poi può essere sottoposto a follow-up sperimentale manipolazione (vedere la Figura 1 per una descrizione schematica del flusso di lavoro di protocollo). Anche se le procedure simili sono state descritte in precedenza7,8,9, abbiamo sentito che un protocollo dettagliato sarebbe utile per i ricercatori che desiderano impiegare questo modello per affrontare domande ancora senza risposta legate alla lo sviluppo larvale intramolluscan, proliferazione cellulare e interazioni immuni di schistosome-lumaca. Inoltre, questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l'isolamento delle uova da altri trematodi medicamente importanti quali vescica-dimora S. haematobium, distomi del fegato o trematodi del polmone.

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Protocol

Tutti cura degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso della University of Wisconsin-Madison sotto protocollo istituzionale Animal Care e non. V005717. Il seguente protocollo comporta lavorare in una struttura di livello 2 di biosicurezza (BSL2) per agenti patogeni umani, anche se nessuna delle fasi di schistosome raffigurate in questo protocollo sono infettiva per l'uomo o altri mammiferi. Seguire politiche istituzionali per la gestione degli agenti patogeni umani del gruppo di rischio 2 (RG2).

Nota: Usiamo topi femmina Swiss-Webster (6 - settimana vecchi) a causa della loro maggiore suscettibilità all'infezione10, ottenendo quindi più grandi oneri di uovo. Tucker et al. descrivere i protocolli di infezione mouse e lumaca utilizzati in questo modello sistema11. La Tabella materiali elenca tutte le attrezzature specifiche, materiali, reagenti e fonti animali necessari per svolgere questo protocollo sperimentale.

1. il trattamento dei fegati infetti

  1. Eutanasia topi, post-infezione 6-7 settimane, da asfissia di CO2 (tasso di 10-30% del volume della camera al minuto). Topi di monitor per la cessazione della respirazione e battito cardiaco.
    Nota: In genere fino a 20 topi possono essere elaborati in un dato momento.
  2. Dopo aver trasferito eutanasizzati topi una cappa di biosicurezza, posizionare il mouse sulle loro spalle e spruzzare loro superfici ventrale con etanolo al 70%. Lasciate macerare per 1 min.
  3. Pizzicare e tirare la pelle dell'addome più basso e tagliare tutta la base della pelle pizzicata più vicina all'addome con forbici chirurgiche sterili. Tirare la pelle tagliata anteriormente (cioè, verso la testa) per rivelare il fegato. Si noti che il fegato dovrebbe essere ampliato e screziato dovuto una risposta granulomatosa indotta da uovo (Figura 2A).
  4. Rimuovere il fegato e posizionarlo in un becher contenente 200 mL di sterile 1,2% NaCl soluzione contenente pen/strep.
  5. Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.4 con topi restanti.
    Nota: Venti topi sono generalmente trattati in un solo raccolto.
  6. Posizionare i fegati in una capsula di Petri sterile e rimuovere non-fegato grasso/connettivo con pinze sterili.
  7. Trasferimento fegatini tagliati/puliti in una bottiglia sterile 250 mL Centrifuga contenente ~ 200 mL di soluzione sterile di NaCl 1,2% con penna/strep.
  8. Vigorosamente agitare il flacone contenente i fegati e, utilizzando una pipetta monouso sterile, rimuovere la superficie in eccesso schiuma/detriti galleggianti. Lentamente versare fuori la soluzione salina rimanente in un contenitore o affondare contenenti candeggina 1% (disinfettante).
  9. Aggiungi ~ 200 mL di soluzione salina fresca per i fegati e ripetere il passaggio 1.8 tre volte di più.

2. fegato isolamento di estrazione e miracidial

  1. Inserire i fegatini in una tazza piccola sterili in acciaio inox frullatore e aggiungere ~ 2 mL di soluzione di 1,2% di NaCl (Figura 2B).
  2. Coprire la tazza con un foglio e una capsula di Petri di evitare fuoriuscite e mescolare per 1 min dall'alternarsi di bassa e alta velocità (20 s bassa velocità/10 s ad alta velocità; ripetizione) (Figura 2).
  3. Distribuire uniformemente la sospensione del fegato blended in bottiglie sterili 250 mL centrifuga (per 20 fegati utilizzano 4 bottiglie).
  4. Aggiungere soluzione fisiologica sterile con antibiotici a ~ 200 mL bottiglia/volume totale. Pesare/equilibrio bottiglie prima della centrifugazione.
  5. Centrifugare i fegati mescolati a 290 x g per 15 min a 4 oC. delicatamente versare i surnatanti in un contenitore con candeggina prima dello smaltimento.
  6. Ripetere i passaggi da 2.4-2.5 una volta. Essere sicuri Risospendere accuratamente sedimento del fegato prima della centrifugazione.
  7. Dopo aver scartato l'ultima soluzione fisiologica lavare (passo 2,6), aggiungere 200 mL di acqua sterile stagno con penna/strep al tessuto del fegato pellettato, agitare per risospendere il sedimento e trasferire la sospensione in un pallone volumetrico da sterilizzata a 1-L che è stato completamente rivestito di alluminio lamina, fatta eccezione per la parte superiore 3 cm del collo (Figura 2D).
    Nota: Utilizzare due bottiglie (= 10 fegati) per 1-L fiaschetta. Laghetto d'acqua simula l'ambiente d'acqua dolce naturale necessaria per stimolare miracidial Cova da uova.
  8. Utilizzando acqua sterile dello stagno, riempire il matraccio a circa 3 cm sopra la lamina che copre il collo. Poi, senza ritardo (come miracidia presto cominciano a covare), rimuovere la schiuma residua e tessuto del fegato galleggiante alla superficie pipettando rapidamente fino ~ 12 mL di acqua di stagno contenente detriti e scartando in un separato scartare il tubo. Sostituire con acqua fresca e sterile dello stagno.
  9. Ripetere la pulizia passo 2.8, altre tre volte, verificare presenza di miracidia nel tubo di scartare. Cessare la ripetizione della fase di pulizia se miracidia appaiono nella soluzione di lavaggio.
  10. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere lentamente ~ 12 mL di acqua calda sterile stagno (pre-riscaldato a 30 oC) per creare un gradiente di temperatura con acqua tiepida pulita e sterile sulla parte superiore.
    Nota: Ciò avviene meglio scaricando lentamente l'acqua lungo il lato del collo per evitare di miscelare boccetta.
  11. Posizionare una piccola capsula di Petri copertura sopra l'apertura della boccetta e brillare una luce brillante nella parte superiore del pallone sopra la pellicola di copertura per illuminare la superficie superiore dell'acqua.
    Nota: In genere, entro 5-10 min, nuoto miracidia, attirata dalla luce, si concentrerà in gran numero entro i primi 2-3 cm di acqua di stagno (Figura 3A).

3. Miracidial raccolta e coltivazione

  1. Quando miracidia hanno accumulato sulla superficie dopo 10 min, utilizzando una pipetta da trasferimento sterile, rimuovere ~ 8 mL di acqua di stagno e trasferirlo in una provetta sterile 15 mL centrifuga. Collocare la provetta contenente miracidia sul ghiaccio.
  2. Aggiungere posteriore 8 mL di acqua calda sterile stagno lungo l'interno del matraccio tarato e attendere altri 10 min.
  3. Utilizzando tubi di nuovi ogni volta, ripetere i passaggi da 3.1 e 3.2 altre tre volte. Dopo la raccolta dith 4, tenere il tubo finale in ghiaccio per 10 minuti consentire la miracidia a stabilirsi. Questo set di tubi comprende il primo raccolto.
  4. Centrifugare le provette contenenti miracidia a 290 x g per 1 min a 4 oC in una centrifuga refrigerata pre-raffreddata.
  5. Rimuovere immediatamente la maggior parte del surnatante (~ 7 mL) facendo attenzione a non disturbare il pellet di parassita (Figura 3B).
  6. Piscina tutti la miracidia da questo primo raccolto in un unico tubo, quindi sciacquare tutti i tubi originali con ~ 1 mL di acqua sterile stagno e aggiungere alla provetta del "pool".
  7. Consentire i parassiti a stabilirsi sul ghiaccio per ~ 5 min e centrifugare nuovamente i parassiti a 290 x g per 1 min a 4 oC.
  8. Con attenzione rimuovere il supernatante e aggiungere che 6-8 mL sterile Chernin equilibrata soluzione salina (CBSS +; Vedi tabella materiali) contenente pen/strep.
  9. Delicatamente sospendere la miracidia e aliquota in una piastra di coltura 24 pozzetti (1 mL per pozzetto), seguita dal tubo di risciacquo in 6-8 mL CBSS + e aggiungendo 1 mL di risciacquo in ciascun pozzetto. Incubare i parassiti a 26 oC in condizioni di normossia. Concentrazioni di miracidia isolato potranno variare, ma generalmente in media ~ 7000/mL.
  10. Se i parassiti sono ancora concentrato presso la sorgente di luce, ripetere i passaggi 3.1 a 3.9 per continuare la raccolta tardiva-cova miracidia ma aumentare l'intervallo di tempo tra le raccolte per 15-20 min.
    Nota: Questo nuovo set di tubi rappresenta la seconda raccolta. Tuttavia, poiché i numeri miracidial sono in genere Bassi, larve da tutte le provette di solito sono raggruppate in un'unica cultura ben contenenti 2 mL CBSS +.
  11. Alle 24 ore post-raccolta e coltivazione, Risospendere delicatamente sporocisti nei loro pozzi di pipettaggio.
  12. Attendere qualche minuto per consentire i parassiti a depositarsi sul fondo dei pozzetti. Una volta che si sono insediati, rimuovere con cautela il surnatante (~1.5 mL), che conterrà la maggior parte delle piastre epidermiche ciliate capannone da miracidia durante la trasformazione larvale. Questa "trasformazione" supernatante può essere scartata o incorporata in studi di follow-up di prodotti secretivi larvali.
  13. Aggiungere 1,5 mL di fresco CBSS + in ciascun pozzetto e delicatamente pipetta per risospendere sporocisti. Ripetere il passaggio 3.12 se si desidera ulteriore lavaggio o cambiando in un supporto diverso.

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Representative Results

La stragrande maggioranza dei miracidia in genere vi sono state raccolte nei primi due "raccolti". Incubazione di miracidia isolato in CBSS + innesca il processo di trasformazione di miracidium-a-sporociste (Figura 4A- C). Entro la prima ora seguente trasferimento alla cultura pozzetti contenente CBSS +, la maggior parte di cessare miracidia nuoto (Figura 4A). A 6 h nella cultura, miracidia stanno attivamente spargimento loro piatti ciliati epidermici (Figura 4B). Coincidente con questo processo di spargimento, larve formano il loro rivestimento tegumentali sinciziale esterno come si trasformano in sporocisti primari. La maggior parte dei parassiti avrà completato larvale trasformazione, diventando completamente formati sporocisti, tramite post-coltura 24-48h in CBSS + (Figura 4). Dopo 4 giorni di cultura in CBSS + da solo, sporociste sopravvivenza può essere preveduta per diminuire a ~ 80%. Tuttavia, sporocisti coltivate per 1 giorno in CBSS + e poi trasferito al terreno completo di Bge (cBge) per 3 giorni in genere provocare migliori tassi di sopravvivenza e larve con un aspetto più robusto (Figura 4). Attuabilità sporociste generalmente rimane stabile tra 4 e 7 giorni in cBge con costante aumento di crescita larvale durante questo tempo nella cultura rispetto al CBSS + da solo.

Figure 1
Figura 1 . Panoramica del flusso di lavoro protocollo. Riassunto schematico delle fasi principali coinvolte nell'isolamento e coltura di miracidia derivati da topi infettati con il trematode umano del sangue, S. mansoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Elaborazione dei fegati infettati. (A) Mouse del fegato infettato pesantemente con le uova di S. mansoni . Si noti la dimensione allargata, colore anomalo e la presenza di granulomi nel fegato infetto (a destra) rispetto ad un normale fegato non infetto (a sinistra). (B) lavato mouse fegati dopo trasferimento a tazza sterile frullatore in acciaio inox. I fegati sono stati poi assemblati per un minuto usando Petri e lamina sterile per coprire la tazza, evitando fuoriuscite (C). Dopo il mescolamento, l'omogenati di fegato, contenenti uova, è stato lavato più volte in soluzione salina e risospesi in acqua sterile dello stagno, prima di essere trasferito in un matraccio tarato da 1 L coperto con carta stagnola (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Raccolta S. mansoni miracidia. Attivamente il nuoto miracidia concentrato di attrazione alla luce nella parte superiore del pallone volumetrico (A). A intervalli di 10 min, parassiti vengono raccolti mediante pipetta e posti a 4 ° C per immobilizzare le larve. Miracidia vengono poi lavati in CBSS + mediante centrifugazione e raccolti in un unico tubo (B) appena prima della distribuzione dei pozzetti di una piastra di coltura. CBSS +; Chernin equilibrata soluzione salina (Tabella materiali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Trasformazione di Miracidial per la loro manutenzione e sporocisti primari in vitro . S. mansoni miracidia e sporocisti messi in coltura in vitro per tempi diversi post-raccolta. Appena raccolto miracidia entro 1 h di cultura in CBSS + (A). Dopo 6 h di cultura, miracidia hanno cominciato a spargere i loro piatti ciliati epidermici (frecce) come si trasformano in sporocisti primarie (B). Dopo 24 h in CBSS + la maggior parte della miracidia hanno completamente trasformato a sporocisti primari (C). Sporocisti erano trasformati in CBSS + per 24 h, poi trasferiti e mantenute in medium cBge per 3 giorni (D). Sporocisti generalmente appaiono più robusti e hanno più alti tassi di sopravvivenza alle post-coltivazione 4 giorni in presenza di cBge, rispetto al CBSS + da solo. CBSS +, Chernin equilibrata soluzione salina; cBge mezzo, completo b. glabrata embrionale delle cellule medie (Vedi Tabella materiali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Miracidia di S. mansoni, isolato e manipolato come descritto nel presente documento, può infettare solo l'ospite intermedio di lumaca e pertanto non rappresentano un rischio biologico umano durante questa fase di sviluppo larvale. Tuttavia, per evitare l'accidentale esposizione/infezione di lumache, dovrebbe prestare attenzione per eseguire gli isolamenti miracidial in una posizione diversa dalle zone dove la specie di lumaca Biomphalaria sensibili possono essere presente o mantenuto. Una stanza separata, registrata come BSL2 spazio, è altamente raccomandata. Inoltre, lavare tutte le soluzioni utilizzate nella lavorazione di fegati e larvale isolamento devono essere trattati con un disinfettante (ad es., 1% candeggina) prima dello smaltimento.

Si noti che la rimozione chirurgica dei fegati da topi infettati e loro successiva elaborazione prima della miscelazione/omogeneizzazione vengono eseguiti in una cappa di sicurezza biologica (BSC) in condizioni asettiche. Tuttavia, per motivi pratici (facilità di manipolazione di campioni alla rinfusa) tutte le altre procedure sono fatte su un benchtop disinfettata utilizzando contenitori sterili (ad es., tazze frullatore, fiaschi, bottiglie e tubi, pipette di trasferimento, ecc.) e soluzioni sterili contenenti antibiotici (acqua salina, stagno, CBSS). Gli antibiotici vengono aggiunti a tutte le soluzioni come ulteriore precauzione contro la contaminazione microbica introdotta. Inoltre, durante l'isolamento di miracidial e di raccolta di passi (protocollo sezioni 2 e 3), un coperchio di piccola capsula di Petri è posto sopra il matraccio di apertura per minimizzare la contaminazione esterna durante la rimozione iniziale di detriti di schiuma/fegato e successivo trasferimento di miracidia concentrato dalla beuta per provette da centrifuga.

In genere, la raccolta miracidia da 20 fegati di infetti del topo in un singolo batch, da cui stimiamo larvali rendimenti di circa 5000 larve per fegato. Tuttavia, i rendimenti possono variare considerevolmente a seconda dell'intensità di infezione dei topi individuali conseguente variazione lotto miracidial recuperi. Gli isolamenti può essere effettuata utilizzando meno fegati di partenza, anche se il metodo che abbiamo descritto è generalmente applicabili per 10-20 fegati. Quando 20 fegati vengono elaborati, seguendo il finale risospensione del pellet del fegato in acqua sterile dello stagno (protocollo sezione 2, punto 2.7), le sospensioni dovrebbero essere distribuite equamente in due palloni 1000 mL (2 bottiglie/boccetta). Se vengono utilizzati 10 fegati o meno, gli omogeneati del fegato originali (protocollo sezione 2, punto 2.3) possono essere distribuiti a 2 bottiglie e lavato sospensioni poi trasferiti in un matraccio tarato da singolo per un'ulteriore elaborazione. Uno o 2 fegati possono anche essere elaborati, ma quantità (volumi) di estrazione, lavaggio e da cova soluzioni dovrebbe essere ridotto proporzionalmente, con finale lavato di sedimenti in acqua dello stagno viene trasferito a un 10 mL coperto di stagnola matraccio di concentrarsi miracidia.

Al fine di massimizzare i rendimenti di miracidial con un minimo di contaminazione di detriti del fegato, è anche importante eseguire i lavaggi di acqua di stagno (protocollo sezione 2, passaggi 2,7-2,9) così rapidamente ed efficacemente possibile. Una volta che le uova sono esposti all'acqua di stagno, miracidial cova si verifica presto da allora in poi, anche se il tempo prima apparizione larvale presso la sorgente di luce del collo del pallone può variare da 5-20 min dopo la schiusa comincia. Per limitare la perdita di parassiti durante la pulizia dello stagno acqua passi è fondamentale per controllare visivamente ogni acqua di stagno lavare per primo miracidia che arrivano nello strato d'acqua superiore del collo del pallone. Inoltre, una volta miracidia vengono trasferiti in provette di raccolta 15 mL e sono posti su ghiaccio, essi cessano l'attività di nuoto e depositano alla parte inferiore del tubo. Tuttavia, dopo centrifugazione a pellet larve (sezione 3, passaggi 3.4-3.5), miracidia inizierà nuovamente a nuotare se acqua è lasciata scaldare. Pertanto, è importante rimuovere l'acqua dello stagno rapidamente, ma senza disturbare il pellet o pipettaggio fino nuoto parassiti.

Come precedentemente accennato, rendimenti di miracidia isolato possono variare a seconda il numero di coppie di verme adulto presente in topi individuali (intensità di infezione) e la coerenza dei protocolli di infezione iniziale. Miracidia sono fortemente fototropico e la maggior parte (80-90%) si concentrerà presso la sorgente di luce sopra il primo periodo di raccolta. Il restante 10-20% di miracidia continuerà a covare e più si accumulano lentamente durante il secondo periodo di vendemmia. Più (> 95%) miracidia introdotto nella cultura e mantenuta a 26 oC in CBSS + mezzo sarà hanno trasformato a sporocisti primari entro 24-48 h di coltivazione. In questo momento, vitalità larvale in genere è > 90%. Dopo 4 giorni a CBSS + sola redditività scende notevolmente (70-80%). Tuttavia, il terreno di coltura da CBSS + a completare Bge media 24h seguente di commutazione iniziale coltivazione CBSS risultati in crescita più robusta e più alti tassi di sopravvivenza. Manteniamo ordinariamente colture a breve sporociste in condizioni di normossia. Tuttavia, sporocisti sono molto sensibili ai livelli di ossigeno e soprattutto a specie reattive dell'ossigeno che possono infliggere danno ossidativo deleteri7. C.J. Bayne4 e altri hanno riportato che la salute generale e la vitalità delle sporocisti in vitro sono migliorati significativamente quando le colture sono effettuate in condizioni di ipossia. I livelli abbassati dell'ossigeno possono essere ottenuti gas (con azoto) boccette closeable individuali o da azoto-arricchimento della fase gas di incubatore4.

Come citati sopra, metodi per isolamento e la coltura di schistosome axeniche miracidia e sporocisti sono stati descritti precedentemente. È stato riconosciuto fin dall'inizio che miracidial fototropismo poteva essere utilizzato per attirare e concentrare le larve nuoto e quello miracidia isolato potrebbe essere rapidamente immobilizzato in iperosmotico soluzioni saline (tra 120-160 mOs/Kg)8. È stato inoltre osservato che manutenzione in soluzioni saline ha provocato la trasformazione di miracidia di sporocisti primari, il primo stadio larvale intramolluscan9,12. Supporti complessi sono stati formulati anche per supportare la crescita in vitro a lungo termine e lo sviluppo di S. mansoni sporociste fasi9,13,14,15, così come le cellule derivato dall'host lumaca Biomphalaria glabrata del16. Queste formulazioni incorporato vari mezzi di comunicazione commerciali e possono sono state integrate con gli aminoacidi, sali, lipidi, agenti riducenti e zuccheri. Formulazioni multimediale completo incluso anche inattivati fetale bovino o siero equino a varie concentrazioni. Abbiamo trovato che quel corretto inattivazione termica (HI) era cruciale per sporociste sopravvivenza e sviluppo a lungo termine in vitro. Abbiamo trovato che incubazione del siero (scongelati, 100 mL bottiglie) a bagnomaria oC 60 per 60 min, con ogni 10 min per riscaldamento uniforme miscelazione delicata era più efficace. Inoltre, verifichiamo solitamente più lotti del siero da un potenziale fornitore per compatibilità cultura larvale. Infine, l'istituzione della linea cellulare di molluschi autentico primo (e attualmente unico), la linea di cellule b. glabrata embrionale (Bge) da Hansen16 era un'innovazione importante che notevolmente ha facilitato gli avanzamenti nella larvale di schistosome sforzi di coltivazione. Isolato S. mansoni miracidia, quando inserito in co-coltura con cellule di Bge sviluppate dal primario al secondario/figlia sporocisti17e alla fine per la fase finale di cercarial18,19. Così, continuo in vitro coltivazione della fase del ciclo di vita di S. mansoni lumaca intero è stato raggiunto. Il mezzo di cella Bge utilizzato nel nostro sistema cultura supporta sporociste crescita/sviluppo e la manutenzione della linea cellulare Bge.

In sintesi, abbiamo descritto e illustrato visivamente un protocollo dettagliato per la massa axenica isolamento e la coltivazione della fase liberamente natante miracidial di S. mansoni. Questi miracidia, quando sottoposti a condizioni di coltura appropriato, sono in grado di sviluppare per le generazioni successive sporociste primario e secondario e alla fine cercarie. Con lo sviluppo e il continuo perfezionamento di strumenti attualmente disponibili per manipolare i geni e gene espressione in vitro attraverso transgenici, l'interferenza del RNA e genoma di editing (ad es., CRISPR/Cas9) approcci, è previsto che efficiente metodi per l'isolamento e coltura di miracidia da diverse specie del trematode20 continuerà ad essere necessario al fine di procurare materiali per l'ulteriore avanzamento della ricerca in questo campo. Questo metodo ben integra un protocollo descritto in precedenza per isolamento e la coltura liberamente natante cercarie di S. mansoni per facilitare la trasformazione in vitro per i mammiferi schistosomula fase21, per eventuale coltivazione a ovigera adulto vermi22.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Finanziato in parte dalla concessione NIH RO1AI015503. Topi infettati di schistosome erano forniti dal NIAID schistosomiasi Resource Center presso l'Istituto di ricerca biomedica (Rockville, MD) attraverso NIH-NIAID contratto HHSN272201000005I per la distribuzione attraverso le risorse della BEI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

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References

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